碳氮代谢测定

谷氨酰胺合成酶（GS）和谷氨酸脱氢酶（GDH）是碳氮代谢的关键酶。

淀粉酶，转化酶，硝酸还原酶，

谷氨酰胺合成酶活性测定

原理谷氨酰胺合成酶（GS）是植物体内氨同化的关键酶之一，在ATP 和M g 2+ 存在下，它催化植物体内谷氨酸形成谷氨酰胺。在反应体系中，谷氨酰胺转化为γ—谷氨酰基异羟肟酸，进而在酸性条件下与铁形成红色的络合物，该络合物在540nm 处有最大吸收峰，可用分光光度计测定。谷氨酰胺合成酶活性可用产生的γ—谷氨酰基异羟肟酸与铁络合物的生成量来表示，单位μmol·mg －1 protein·h －1 。也可间接用540nm 处吸光值的大小来表示，单位A·mg －1 protein·h －1 。【仪器与用具】冷冻离心机；分光光度计；天平；研钵；恒温水浴；剪刀；移液管（2 ml、1ml）。【试剂】提取缓冲液：0.05mol/L Tris-HCl，pH8.0，内含2mmol/L Mg 2+ ，2mmol/L DTT，0.4 mol/L 蔗糖。称取Tris（三羟甲基氨基甲烷）1.5295g，0.1245g MgSO 4 ·7 H 2 O，0.1543g DTT（二硫苏糖醇）和34.25g 蔗糖，去离子水溶解后，用0.05 mol/L HCl 调至pH8.0，最后定容至250ml；反应混合液A（0.1mol/L Tris-HCl 缓冲，pH7.4）：内含80mmol/L Mg 2+ ，20mmol/L 谷氨酸钠盐，20mmol/L 半胱氨酸和2 mmol/L EGTA，称取3.0590g Tris，4.9795 gMgSO 4 ·7H 2 O, 0.8628g 谷氨酸钠盐，0.6057g 半胱氨酸，0.1920gEGTA，去离子水溶解后，用0. 1mol/L HCl 调至pH7.4，定容至250ml；反应混合液B（含盐酸羟胺，pH7.4）：反应混合液A 的成分再加入80mmol/L 盐酸羟胺，pH7.4；显色剂（0.2mol/L TCA, 0.37mol/L FeCl 3 和0.6mol/L HCl 混合液）：3.3176g TCA（三氯乙酸），10.1021g FeCl 3 ·6H 2 O，去离子水溶解后，加5ml 浓盐酸，定容至100ml；40mmol/L ATP 溶液：0.1210g ATP 溶于5ml 去离子水中（临用前配制）。【方法】1.粗酶液提取称取植物材料1g 于研钵中，加3ml 提取缓冲液，置冰浴上研磨匀浆，转移于离心管中，4℃下15,000g 离心20min，上清液即为粗酶液。2.反应1.6ml 反应混合液B，加入0.7ml 粗酶液和0.7ml ATP 溶液，混匀，于37℃下保温半小时，加入显色剂1ml，摇匀并放置片刻后，于5,000g 下离心10min，取上清液测定540nm 处的吸光值，以加入1.6ml 反应混合液A 的为对照。3.粗酶液中可溶性蛋白质测定取粗酶液0.5ml，用水定容至100ml，取2ml 用考马斯亮蓝G-250 测定可溶性蛋白质（见实验28）。4.原始数据记载 5.结果计算：GS 活力(A·mg －1 protein·h －1 )＝式中A—540nm 处的吸光值；P—粗酶液中可溶性蛋白含量（mg/ml）；V—反应体系中加入的粗酶液体积（ml）；T—反应时间（h）。

蔗糖合成酶的测定方法

一、仪器设备

冷冻离心机、恒温水浴、分光光度计

二、试剂

HEPES-NaOH（50mmol/L，pH7.5）缓冲液，包括50mmol/L MgCI2；2mmol/LEDTA；

0.2%(W/V)BSA；2%PVP；

0.1%间苯二酚：称取0.1g溶解并定溶于100ml 95%乙醇中。

30%盐酸、2mol/L NaOH、100mmol/L UDPG、100mmol/L6-磷酸果糖、100mmol/L 果糖

三、操作方法

1、粗酶液制备

称取0.5g样品（植物叶片去掉主叶脉），洗净剪碎，置于预冷的研钵中，加3ml Hepes-NaOH缓冲液，冰浴研磨，10000×g离心10min。

2、酶活性测定

依次加入50μL粗酶液，

50μLHepes-NaOH缓冲液pH7.5，

20μL 50 mmol/LMgCI2，

20μL 100mm ol/L UDPG，

20μL 100mmol/L6-磷酸果糖（20μL 100mmol/L果糖），

30℃中反应30min后，加入200μL 2mol/L NaOH终止反应，沸水煮10min，流水冷却，加入1.5ml 30%盐酸和0.5ml 0.1% 间苯二酚，摇匀后置于80℃水浴保温10min，冷却后置于480nm处，以提前杀死酶活性为空白比色测定蔗糖含量。

同时取50μL粗酶液，加入200μL 2mol/L NaOH，以下同上操作，测定蔗糖含量。

3、蔗糖标线制作：

取0、40、80、120、160、200μg/ml的蔗糖溶液50μL，操作同上，然后以蔗糖浓度为纵坐标，以吸光值为横坐标，得方程。

4、计算

样品中酶活性（μg·g﹣1·h﹣1）=

式中C—反应液催化产生的蔗糖总量（μg）；

V1—提取酶液时加入的缓冲液体积（ml）；

V2—酶反应时加入的粗酶液体积（ml）

淀粉酶活性的测定

1方法

1.1试剂配制淀粉酶提取缓冲液：0.1mol/L-1柠檬酸溶液(pH 5.6);1%的淀粉溶液：用0.1mol/L-1的柠檬酸缓冲液(pH 5.6)配制；标准麦芽糖溶液

(1mg/mL-1);3,5-二硝基水杨酸试剂(DNS试剂):称取6.5 g 3,5-二硝基水杨酸溶于少量水中，移入1000 mL容量瓶中，加入325 mL 2mol·L-1 NaOH溶液，再加入45g丙三醇，摇匀，冷却后定容到1000 mL。淀粉和麦芽糖为Sigma产品，其余试剂为国产分析纯试剂。

1.2测定方法

1.2.1酶液的提取

将每一个重复的3个果实去皮后切碎混匀，称取其果肉1g，置于预冷的研钵中，加2mL预冷的0.1mol/L-1柠檬酸溶液(pH5.6)和少量石英砂研磨，将匀浆移入7mL的离心管中，再分别用1mL的0.1mol/L-1柠檬酸缓冲(pH 5.6)冲洗2次,于4℃下以15000×g离心15min，上清液转移入另一个5mL离心管中，作为酶提取液备用。

1.2.2酶活性的测定

取洁净的试管18支，作标记，每一个样品设1个对照。总反应体积为0.5mL，测定管含0.2mL的酶提取液和0.3mL的1%淀粉溶液；对照管含0.2 mL的酶提取