吴健民--乙肝病毒基因检测和基因型

是直径42nm的双层外壳的病毒颗粒，称为Dane氏颗
粒，后来又有人发现26nm的核心颗粒。 e抗原： 1972年瑞典人Magnius发现与乙肝有关的第三种抗原。 e抗原为一种可溶性抗原。在HBV核心的表层
HBV的复制过程
机体感染 HBV 后产生相应的免疫反应， 形成多种不同的抗原抗体系统
表面抗原抗体系统 (HBsAg，抗HBs) 核心抗原抗体系统 (HBcAg，抗HBc)
前S1蛋白的存在导致免疫细胞 的激活引发免疫损害、肝细胞坏 死、转氨酶升高、黄疸出现
乙肝病毒前S1蛋白
前S1
HBV DNA定量检测
•HBV DNA： 是HBV感染最直接， 最灵敏和最特异的检测指标，且血清 中HBV DNA的水平可作为治疗方案 与疗效观察的指标。
目的基因扩增
循环数. 扩增子数 (靶序列拷贝数) 1 2 3 2 4 8
双标记探针: Taqman probes 5’
3’
5’ 3’
Excitation Excitation
3’ 5’ R Q
Q
5’
3’
1. HBV DNA 检测结果与血清标志物的综合评价
⑴ 与HBsAg检测结果的关系 :
一般来说HBsAg阳性，HBV DNA测定常常阳性。在实践 中可能遇到的问题是HBsAg测定结果阴性，而HBV DNA测定 阳性, 其原因可能是因为: ① HBsAg ELISA测定敏感性低，对极低浓度的HBsAg测 不出，而PCR具极高的灵敏度，HBV DNA含量即使很低亦可 检测出来； ② 或在HBV感染早期，此时所有乙肝的免疫标志物尚未 产生。
抗-HBc IgG ： 高滴度表明机体正感染 HBV；而低滴度抗-HBc IgG则是既往感染 过HBV的指标，具有流行病学的意义。 (非保护性抗体)
乙型肝炎病毒血清标志物的综合评价
(1) ＋ ＋ ＋ － － － － － － (2) － － － ＋ － － ＋ ＋ － (3) (4) ＋ － － － － ＋ － － － － － － － ＋ － (5)Hale Waihona Puke Baidu＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 急性或慢性乙型肝炎，高传染性 急性、慢性乙型肝炎或慢性HBsAg携带者 急性乙肝趋向恢复或慢性乙肝，弱传染性 急性HBV感染康复期或有既往感染史，有 免疫力 乙肝恢复期，弱传染性 急性HBV感染“窗口期”， 或既往曾感染 过乙肝 接种HBV疫苗或HBV感染后康复 急性乙肝康复期，开始产生免疫力 无HBV感染
四个主要亚型
1 排斥决定簇 HBsAg主蛋白还携带两对相互排斥的亚型决定簇 d/y （122-134 aa指令d/y决定簇）和w/r
（159-160 aa指令w/r决定簇）。
2 四个主要亚型
组成4个主要亚型：adw、adr、ayw和ayr。
流行病学意义
ayw：地中海沿岸、非洲、中近东、俄罗斯、印度； adr：分布于我国，朝鲜、日本、远东地区；
达90%值得重视。
•抗-HBe：
•意味着 HBV部分被清除或抑制，复制减少， 传染性降低, 但慢性肝炎, 肝硬化阳性率高 • e抗体和e抗原一般不同时存在，e抗原消失， e抗体产生。 • e抗体（+）说明患者曾出现过HBeAg • 但对e抗体（+）者不可视为HBV复制平息。
抗-HBc IgM ： 是诊断急性乙型肝炎和判断 病毒复制活跃的指标，并提示病人血液有 强传染性。抗-HBc IgM阳性也可见于慢性 活动性肝炎。
外
移行？
DNA pol Partially doublestranded DNA (-)-DNA RT
膜 装
核心包装？
配 ？
A(n) mRNA
cccDNA的形成？
病毒性肝炎
• 病毒性肝炎血清标志物包括：
• 肝炎病毒本身
• 组成该病毒的成分
• 抗病毒抗体（血清标志物检测）
乙型肝炎病毒标志物检测
乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV） 为嗜肝 DNA 病毒，在电镜下可见大球形颗 粒、小球形颗粒和管型颗粒。 完整的HBV颗粒为大球形颗粒，又称 Dane 颗粒，直径42nm，分为包膜与核心两部分， 包膜HBsAg，核心部分含有环状双股DNA、 DNA聚合酶、HBcAg和HBeAg等，是病毒 复制的主体。
3. 血液病患者，反复输血检出率高。
4. 无症状乙肝携带者：男性>女性，我国 携带者约10%，这种人虽然没有临床症状, 体 检肝功能正常或有轻微损害，有时ALT升高， 血中抗-HBS（-），具有一定的传染性, 不应 作为供血者。可持续数周、数年这种人将来 可能发生慢性活动性肝炎、迁延性肝炎、肝 硬化和肝癌值得注意。
血清型
目前认为HBsAg 含有5种不同的抗原表位，分别为 a、d、y、w、r，其中“a” 属于特异性抗原决定簇， d/y及 w/r是2对亚决定簇，d与y，w与r 一般不同时
出现，根据HBsAg的血清学分析，目前已知有 9 种
亚型, 主要的有adr、adw、 ayw、 ayr等4种。各亚
型的分布有明显的地区性。
亚型突变与病变程度关系
HBV感染后常引起感染的慢性化，引起慢性
肝炎，肝硬化。许多肝细胞癌患者也常常伴
有HBV感染。不同的HBV亚型及亚型内特异
部位的核苷酸位点的变异可能与感染的慢性 化及感染后病情的转归有一定的关系。
HBV亚型的划分
乙 型 肝 炎 病 毒
血清型（九个）
基因型（A-H型）
乙 肝 的 临 床 特 征
adw：由东非、北欧、美洲、及澳洲等地。
ayr： 亚型极少见。
HBV基因分型
根据ＨＢＶ全基因核苷酸序列异源性≥８％ 或者Ｓ基因区核苷酸序列异源性≥４％， 将不同病毒株分为不同的基因型。
乙型肝炎病毒基因分型的方法
⑴ 全基因序列比对分型法
⑵ 限制性片段长度多态性分析法（RFLP）
⑶ HBV基因分型芯片
4
5 6 20
16
32 64 1,048,576
30
1,073,741,824(10亿)
PCR 和 PCR 的定量问题
对数期分析 终点分析

N

高浓度 / 高效率 高浓度 / 低效率 低浓度 / 高效率
N n
:扩增分子的数量 :扩增循环数
n
LightCycler的定量概念
Target
log (F2/F1)
基因扫描图
限制性片段长度多态性分析法（RFLP）
HBV的基因型和分布
根据ＨＢＶ全基因核苷酸序列异源性≥８％
或者Ｓ基因区核苷酸序列异源性≥４％，将 不同病毒株分为不同的基因型，迄今为止， ＨＢＶ可以分为８个基因型， 即Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ和Ｈ型。
HBV 的异质性
基因型 * A 地理分布
基因型
乙肝病毒存在的三种形式
完整病毒颗粒， 内含DNA，具 有复制功能
空泡型病毒颗粒，无DNA， 不具有复制功能
乙 型 肝 炎 病 毒 基 因 组 结 构 示 意 图
乙肝抗原：
1963年美国肿瘤研究所B.S.BIumberg在澳大利亚首先 发现，称为“澳抗”又称肝炎相关抗原。 乙肝病毒： 1970年英国Dane在电镜下首先观察到乙肝病毒颗粒，
⑵ 与抗-HBs的关系 :
HBV感染恢复期，抗-HBs阳性，血清HBV DNA检测一般为 阴性，但少部分亦可为阳性，特别是肝组织HBV DNA测定阳
性率仍很高，说明HBV还没有从肝脏中完全清除掉。只有
HBV DNA测定阴性才是病毒消除的明确指标。
⑶ 与HBeAg，抗-HBe和抗-HBc的关系:
HBeAg阳性，HBV DNA检测几乎全为阳性； HBeAg阴性而抗-HBe和抗-HBc阳性者，仅表明病毒复制减弱， 但并未完全消失，血清HBV DNA的阳性率仍可高达 60% ~ 80% 。
－ － ＋ ＋ － －
HBsAg 抗-HBs HBeAg 抗-HBe 抗-HBc
+ + +
+ + + +
+
+
-
+
乙型肝炎病毒前S1(Pre S1)蛋白与抗-前S1抗体
前 S1蛋白是 HBV 外膜蛋白的成分，由 108～ 110 个氨 基酸组成，通常连接在前 S2 蛋白的氨基末端。前 S1 蛋
白 第21～47位氨基酸为肝细胞膜的受体，HBV 可通过
国人感染HBV起始于幼龄期
幼龄感染
90%慢性化 10%清除病毒 成年感染
急性肝炎 95%清除病毒 非活动性携带 （HBeAg ）
<1%暴发肝炎 5%慢性感染 慢性肝炎 （HBeAg + ）
非活动性携带 （HBeAg
慢性肝炎
） （HBeAg + ）
40%肝硬化
15~20%肝硬化
HBV的感染过程
HBV 附着和侵入？ 分泌？
未知标本
n
标准曲线
Crossing Point (Cycles) n log (copy number)
log (F2/F1)
FQ-PCR（ Taqman技术）
荧光化学基础
反应体系中，不仅有两条普通的引物， 还有一条荧光标记探针。这条探针的5’端和 3’端分别标记了荧光报告基团（R）和荧光 淬灭基团（Q）。当这条探针保持完整时， R 基团的荧光信号被 Q 基团所淬灭；一旦探 针被切断，淬灭作用消失，R基团的荧光信 号就可以被测定。
双标记探针(FQ-PCR反应的实现)
开始时,仪器并不能检测到荧光(阈值)。
因Taq聚合酶同时具有5`端外切酶的活 性，在PCR反应的延伸阶段，Taq酶会把5` 端的荧光分子切下，使其与3`端吸收或淬 灭荧光的分子分开，仪器就会检测到荧光 信号。每一个循环，随着PCR扩增产物的 增加，荧光信号会增强，从而根据荧光信 号的增强来计算PCR扩增产物的增加。
北欧、西欧、美国、非洲
B
C
中国、印度尼西亚、越南
中国、越南、朝鲜、日本
D
E F 西亚 G
地中海区、中东、印度
西非 美国（印地安拿人）、波利尼 欧洲、美国
H
尼加拉瓜、墨西哥
亚洲部分地区的基因型分布
100% 80%
81.4
32 84.7
HBV基因型 B HBV基因型 C 其他基因型
60% 40%
53
20% 0%
17.2
12.2
中国 (上海） 台湾
日本
国内部分地区基因型分布
100%
25
2.5 23
1.4 其它基因型 B、C混合型 C型 B型
80%
60%
88.9
50
42.7
81.4
40%
20%
11.1
25
32.8
17.2
沈阳
北京
广州
上海
HBV基因型的临床意义
近年来研究发现, HBV基因型具有如下意义 与HBV标志物清除的关系 与病毒致病性的关系 与乙型肝炎的病程及转归的关系 与药物敏感性的关系
e 抗原抗体系统
(HBeAg，抗HBe)
临床意义（1）
HBsAg： 1 .乙型肝炎具有传染性的标志之一，阳性常见于 急性、慢性乙型肝炎，慢活肝。 2. 肝硬化、肝癌患者中有相当百分比的病人阳性， 此现象说明肝硬化、肝癌患者有传染乙肝的危险， 还说明了乙肝，肝硬化，肝癌发展演变的内在联 系。乙肝是肝癌的病因之一。
因此HBV DNA 检测是评价HBV传染性的最可靠方法。
2. 抗病毒药物治疗乙肝的疗效评价
使用定量PCR测定乙肝患者血中HBV DNA的含量 在治疗前后的变化，可以判断相应药物的疗效，从 而确定有效的治疗方案。
3. 筛查献血员，防止乙肝病毒输血后感染。
HBV基因分型及其意义
杭州博赛基因诊断技术有限公司
这一受体粘附至肝细胞膜上，从而侵入肝细胞。前 S1
蛋白抗原性较强，可诱生机体产生抗-前S1抗体。
【临床意义】 前S1蛋白阳性提示病毒复制活跃，具有较强的
传染性。抗-前S1抗体是HBV的中和抗体，能阻止HBV入侵肝细 胞，抗-前S1抗体较早出现提示预后良好。抗-前S1阳性，见于急 性乙肝恢复早期，常表示HBV正在或已经被清除，是观察乙肝 病情，了解预后及乙肝疫苗接种后是否有效的指标。
与HBV血清型比较,HBV 基因型具有更加重要的意义。
HBV基因型和HBeAg的清除的关系
乙肝检验新进展
乙肝病毒基因检测和基因型
华中科技大学 同济医学院附属协和医院 吴健民
乙型肝炎全球分布
乙肝现状
乙肝病毒携带者占人口10%. 全世界共有3亿乙肝携带者、我国乙肝携 带者总数高达1.3亿.
10%转化为各种慢性肝病，包括有慢性
肝炎、肝硬化和肝癌
我国慢性肝病人数3000万，肝病死亡人 数每年30万
•抗-HBs ： 阳性表示
•① 既往曾感染过HBV，现已恢复；
•② 接种乙肝疫苗后；
•③ 被动性获得抗-HBs抗体
•HBeAg：
• HBeAg阳性表明: 患有乙型肝炎，是病毒复制活 跃，传染性强的指标，且HBeAg持续阳性的乙型肝 炎，易转变为慢性肝炎, 肝硬化。 •HBeAg , HBsAg (+) 的孕妇 所生的新生儿，母婴垂直 传播的机会很高，