ELISA原理和分类(附图解)
ELISA原理与应用-很详细PPT课件
ELISA的原理
酶联免疫吸附测定的基本原理是抗原 -抗体反应，即利用抗原与抗体之间 的特异性结合，实现对目标分子的检 测。
随后加入酶标记的抗体或抗原，与固 相载体上的抗原或抗体发生特异性结 合，形成酶标记的抗原-抗体复合物。
Elisa技术简介
简要介绍Elisa技术的原理、特点、 分类和应用范围，让读者对Elisa技 术有一个初步的了解。
结合图表和图片，形象生动地展示 Elisa技术的操作流程和实验设计，便 于读者理解和记忆。
02
Elisa原理
酶联免疫吸附测定（ELISA）的定义
酶联免疫吸附测定（ELISA）是一种基于抗原-抗体反应的检测技术，通过酶标记的 方法，将抗原或抗体结合到固相载体上，实现对目标分子的定量或定性检测。
标准化问题
不同实验室间Elisa检测结果 的标准化问题尚未完全解决，
导致结果可比性不高。
对操作人员要求高
虽然Elisa技术操作简便，但 对操作人员的专业知识和技能
要求较高。
06
Elisa技术的发展趋势和未来展望
技术创新和改进
自动化技术
提高检测的自动化程度，减少人 工操作，提高检测效率。
纳米技术
利用纳米材料提高检测的灵敏度 和特异性，实现更精确的检测。
食品安全检测
食品中微生物检测
检测食品中的细菌、病毒和寄生虫等微生物，确保食品的安全性。
食品中农药残留检测
检测食品中农药残留量，控制食品中的农药污染。
食品添加剂检测
检测食品中的添加剂种类和含量，保证食品的质量和安全。
环境监测
水质监测
ELISA实验 ppt课件
1.4 免疫测定在临床检验中的应用
由于各种抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制备 特异性的抗血清或单克隆抗体，利用此抗体作为试剂就可 检测标本中相应的抗原，因此免疫测定的应用范围极广。
2 ELISA的类型
ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方 法中有三个必要的试剂： （1）固相的抗原或抗体，即"免疫吸附剂"（immunosorbent ）； （2）酶标记的抗原或抗体，称为"结合物"（conjugate）； （3）酶反应的底物。
4 对照设定
阳性对照品(positive control)和阴性对照品(negative control)是检验试验有效性的控制品，同时也作为判断结果 的对照。
阳性对照品的基本组成应尽量与检测标本的组成相一致，多以含 蛋白保护剂的缓冲液为基质。
加入的量应与试剂的敏感度相称； 在测定中得到的吸光值与受检标本吸光值比较，可以估计标本物 质的量。
1.1.2 特异性
抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之 间。化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。
测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。
1.1.3 最适比例
1.1.4 敏感性
化学比色法的敏感度为mg/ml水平 酶反应测定法的敏感度约为5-10μg/ml 免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿 标记的免疫敏感度可提高数千倍，达ng/ml水平 例如，HBsAg，其敏感度可达0.1ng/ml。
ELISA的试剂准备A
固相载体 聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋 白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。
聚氯乙烯。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但 空白值也略高。
ELISA的原理和类型
ELISA的原理和类型ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种广泛应用于生物医学领域的实验技术，用于检测体液中的特定蛋白质或其他分子。
ELISA可用于诊断疾病、监测药物治疗效果、研究疾病发病机理等。
本文将介绍ELISA的原理和类型。
##ELISA的原理1.涂覆：将待测物质（抗原或抗体）固定在微孔板上。
2.结合：加入样本液，待测物质与样本中的目标分子结合。
3.探针：加入与目标分子结合的第二抗体，或标记有酶的第二抗体。
4.显色：加入底物，酶与底物发生反应，形成可见的颜色变化。
5.检测：通过测量颜色强度或荧光强度来定量检测目标分子的浓度。
根据酶与抗体/抗原结合的方式，ELISA可以分为直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和间接竞争ELISA等不同类型。
###直接ELISA直接ELISA是最简单的ELISA类型之一、在直接ELISA中，待测物质被直接固定在微孔板上，然后加入与待测物质特异性结合的第一抗体。
随后加入与第一抗体结合的酶标记的第二抗体，最后通过显色反应来检测目标分子的浓度。
###间接ELISA在间接ELISA中，待测物质被固定在微孔板上，然后加入与待测物质特异性结合的第一抗体。
接着加入与第一抗体结合的未标记的第二抗体，最后再加入与第二抗体结合的酶标记的第三抗体。
通过酶与底物的反应来检测目标分子的浓度。
###竞争ELISA竞争ELISA是一种测定待测物质浓度的方法。
在竞争ELISA中，待测物质与酶标记的抗体结合时，用于检测的抗体与酶标记的抗体之间存在竞争。
通过测量酶的活性来确定待测物质的浓度。
###间接竞争ELISA间接竞争ELISA结合了间接ELISA和竞争ELISA的原理。
在此类型的ELISA中，待测物质被固定在微孔板上，然后加入抗体，抗体与待测物质结合。
接着加入酶标记的抗体，酶标记的抗体与待测物质结合。
通过测量酶的活性来确定待测物质的浓度。
ElISA的原理和类型
Ab过量 前带 等价带 Ag过量 后带
Ab恒定，Ag递增
双抗原（体）夹心法测抗体
*
待测抗体
包被抗原
*
酶标抗原
酶标抗体
待测抗原
包被抗体
双抗原夹心法 双抗体夹心法 Anti-HIV, Anti-HBs
HBsAg ,HCV core Ag, HBeAg,HBV preS1,PreS2
双抗体夹心法流程
药片现配， 致畸， 但本底好50nm
荧光，化 学发光等
需要 仪器检测
ELISA的原理和类型
ELISA原理
ELISA-测抗原（Ag）或抗体（Ab） 三要素： 三要素：
抗原或抗体的固相化 抗原或抗体的酶标记 * *
底物被酶催化成为有色产物—定性和定量– 放大免疫反应的信号 E*
S +H2O2
s
抗体分子的结构示意图
重链 轻链
卵白溶菌酶与抗体结合的 3D示意图
抗原抗体反应
间接法测抗体
酶标抗体
*
待测抗体 Anti-HCV, Anti-HEV
包被抗原
竞争法测抗体
酶标抗体
待测抗体 Anti-HBc
包被抗原
*
捕获包被法测抗体
酶标抗体
*
特异性抗原
待测抗体
包被抗体 Anti-HBc IgM
底物系统
与HRP反应 后的颜色 OPD 加终止液后 的颜色 读数波长 特 点
492nm
酶标抗体 样品 底物
*
单抗
酶标仪测定OD值 值 酶标仪测定
终止液
双抗体夹心法测抗原
Hook effect 病毒的血清型 类风湿因子（ ） 类风湿因子（RF）的干扰 能和多种动物IgG的Fc段结合 段结合。 能和多种动物IgG的Fc段结合。它可充当抗 原成份，同时与固相抗体和酶标抗体结合， 原成份，同时与固相抗体和酶标抗体结合，表 现出假阳性反应。 现出假阳性反应。 双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大 分子抗原， 分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单 价抗原， 价抗原，因其不能形成两位点夹心
ELISA检测技术解析课件
优点: 1. 适用范围广，无需制备特殊的酶标抗体; 2. 制备方便，价格便宜。
双抗夹心法ELISA
双抗夹心法是先将未标记的抗体包被在酶标板上，用于捕获 抗原，在用酶标的抗体与抗原反应形成抗体-抗原-酶标抗体复合 物，加入酶反应底物，测定产物的吸光值，计算出捕获的抗原量， 本方法也称为直接夹心法（见后图） 。
优点: 1. 特异性高、准确性好； 2. 实验操作简便，用时短。
缺点: 1. 应用范围较小，生产难度大。 ——需制备各种酶标抗原或抗体。
间接法ELISA
间接法ELISA是将酶标记在二抗上，当抗体（一抗）和包被 在酶标板的抗原结合形成抗原-抗体复合物后，再以酶标二抗和 复合物结合，通过测定酶反应产物的颜色可以（间接）反映一抗 和抗原的结合情况，进而计算出抗原或抗体的量（见后图）。
洗涤3次，拍干
加底物溶液 (空孔除外)
避光 37℃, 10-30min
加终止液 (空孔除外)
加酶标抗体 (空孔除外)
上机检测、结果判定 (空孔调零)
双抗夹心法检测血清IL-2含量
设计加板次序 (空孔、阴、阳、标准)
加板 (阴、阳、标准、样)
37℃, 30min 洗涤3次, 拍干
加酶标抗体 (空孔除外)
E
E
E
E
E
E
对照孔
E
E
酶标记物
参考液(不含抗原) 酶标记物
E
E
E
E
E
E
E
底物溶液 底物溶液
E
E
E
E
E
E
E
测定孔
样本(含抗原)
竞争法ELISA实验原理
ELISA原理示意图详解ppt课件
洗涤去除未结合的抗原
双抗体夹心法ELISA原理示意图
01
加入酶标记的二抗与另 一特异性抗体结合，形 成双抗体夹心结构
02
洗涤去除未结合的酶标 二抗
03
加入底物，酶催化底物 生成有色产物
04
通过比色或分光光度法 测定吸光度，计算抗原 含量
04 ELISA实验数据 分析与解读
发展历程
自1971年Engvall和Perlmann首次 报道以来，ELISA技术得到了迅速 发展和广泛应用。
免疫学基础与抗原抗体反应
免疫学基础
免疫系统能够识别和清除外来抗原，维持机体内环境稳定。
抗原抗体反应
抗原与抗体特异性结合形成免疫复合物，引发一系列免疫反应。
ELISA技术分类及应用领域
技术分类
靠性。
数据分析策略及软件工具介绍
描述性统计分析
方差分析（ANOVA）
对数据进行初步的描述性统计分析，如计算 平均值、标准差、变异系数等，以了解数据 的分布和离散程度。
用于比较不同组别之间的差异显著性，如比 较不同浓度标准品或不同处理组之间的吸光 度值差异。
回归分析
软件工具
通过建立数学模型，探究自变量（如标准品 浓度）和因变量（如吸光度值）之间的线性 或非线性关系。
ELISA原理示意图详解ppt 课件
目录
• ELISA基本原理与概述 • ELISA实验步骤与操作规范 • ELISA原理示意图详解 • ELISA实验数据分析与解读 • ELISA技术应用案例分享 • ELISA技术挑战与发展趋势
01 ELISA基本原理 与概述
ELISA定义及发展历程
定义
ELISA的原理及分类ppt课件
? 良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板 之间、同一板各孔之间性能相近。
ELISA基本原理
4.抗原抗体的结合:
实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间。 由抗原决定簇和抗体分子超变区之间空间结构的互补性决定的。 抗体分子N端可变区形成3nm×1.5nm×0.7nm的槽沟，只有与其空间结构互 补的抗原决定簇才能如楔状嵌入。
由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系，所以抗原抗体反应具有高 度的特异性。
?大于Ab或者TCR的抗原结合部位 ?无机物不能成为抗原； ?分子量太小（如对氨基苯甲酸，DNP）的有机物不能成为抗原； ?蛋白质是最主要、最常见的抗原； ?多糖、脂肪、核苷酸等有机大分子能被B细胞和 gd-T 细胞所识别。
3. 最大特性：免疫应答的特异性
某一特定抗原只能刺激机体产生针对该特定抗原的细胞和体液免疫应答； 某一特定抗原只能与其相应的特异抗体或致敏淋巴细胞产生结合反应。
? 在抗原的反复刺激下，可通过 Ig基因的类转换而转向 IgG合成 ? IgG是再次免疫应答的主要抗体；合成速度快、分解慢、半衰期长。可作保护性抗体。
制备抗体的发展技术：
?多克隆抗体 ：免疫动物后从血清中所得。
抗原通常都有许多的抗原决定簇，所得抗体为针对这些所 有抗原决定簇的抗体混合物。
? 抗体的亲和力和特异性相对低于单克隆抗体。 ?单克隆抗体 ： 杂交瘤技术
a为最后测定结果的显色之源，当待测种抗原浓度增加时，无疑会使b， c和d复合物增加，从而消耗有限的Ab* ，使a复合物相应减少，显色 降低，吸光度对抗原浓度的变化曲线呈钟形。
elisa四种方法原理
elisa四种方法原理
ELISA（免疫酶联免疫吸附实验）原理：
ELISA（免疫酶联免疫吸附实验）是一种常见的免疫检测技术，可用于检测抗原（病原微生物或其产物）或抗体（就是人体免疫合成的抗体）。
ELISA技术是由美国科学家Engvall和 Perlmann在1971年开发的。
其原理是用待检样品中特异性的抗原或抗体，经过酶标记或免疫吸附后，与特异性的抗体或抗原结合，形成特异性的复合物，然后用酶试剂和酶色物质，利用酶-物质反应的特异性相互作用，使用特异性发光来检测复合物，从而实现抗原或抗体检测的目的。
ELISA可以分为四种：
1、双抗体免疫吸附ELISA法：在试剂盒中，将抗原（如病毒）固定在培养皿内，然后用一抗原特异性的抗体将抗体特异性的抗体结合起来；最后，添加特异性的抗体作为酶色原料，重复几次，即可得出检测结果。
2、双抗原免疫吸附ELISA：该法与上述方法类似，只是将抗原替换为特异性的抗体，而其余程序不变。
3、原位抗原免疫吸附ELISA：该方法与上述两种方法类似，但是在结合的特异性抗体上加入特异性的抗原，并将其结合在一起，用酶试剂和酶色物质来检测抗原-抗体复合物。
ELISA 测定原理
2021/4/20
酶ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
抗抗 体
酶标记 抗抗体
抗体
1.将抗原包被在固相载体上。
2.如样品中含有抗体，则结合 为抗原抗体复合物。 3.再加入酶标记抗抗体，则结 合 为抗原-抗体-酶标记抗抗体复 合物。
4.酶催化底物并显色。
抗原
固相载体
2021/4/20 间接法（抗-HCV等）示意图
再加入酶标记抗原则结合为抗原抗体酶标记抗原复合抗原酶标记抗原抗体抗原固相载体酶标记抗抗体抗体抗原固相载体1
ELISA 测定原理
2021/4/20
酶 酶标记抗体
抗体 抗原
1.将抗体包被在固相载体上。 2.如样品中含有抗原，则结合 为抗原抗体复合物。 3.再加入酶标记抗体，则结合 为抗体-抗原-酶标记抗体复合 物。
酶 酶标记 抗体 抗体
抗原 抗体
抗抗体
1.将抗抗体包被在固相载体上。 2.如样品中含有抗体，则结合 为抗抗体-抗体复合物。 3. 加入抗原及酶标记抗体， 则结合为抗抗体-抗体-抗原酶标记抗体复合物。
4.酶催化底物并显色。
固相载体
捕2捉021/4/法20 （抗-HAV IgM、抗-HDV IgM等）示意图
4.酶催化底物并显色。
抗体
固相载体
双抗体夹心法（HBsAg、HBeAg等）示意图
2021/4/20
酶 酶标记 抗原 抗原
抗体
1.将抗原包被在固相载体上。 2.如样品中含有抗体，则结合 为抗原抗体复合物。 3.再加入酶标记抗原，则结合 为抗原-抗体-酶标记抗原复合 物。
4.酶催化底物并显色。
抗原
固相载体
2021/4/20
ELISA原理方法及操作细节
ELISA原理方法及操作细节一、ELISA的原理1.直接ELISA：将抗原直接附着在固相载体上，通过特异性抗体的结合来检测抗原的存在和浓度。
2.间接ELISA：将已知的抗原附着在固相载体上，再加入待测样品，通过特异性抗体和二抗的结合来检测抗体的存在和浓度。
3.夹心ELISA：分别在固相载体上附着抗原和特异性抗体，再加入待测抗原，通过特异性抗体和二抗的结合来检测抗原的存在和浓度。
4.竞争ELISA：将已知抗原和酶标记的抗原竞争与待测抗原中的特异性抗体结合，通过酶标记抗体的含量来反映待测抗原的浓度。
二、ELISA的方法以下以间接ELISA为例进行详细介绍ELISA的方法步骤：1.固相吸附：将已知抗原溶液加入微孔板孔中，使抗原吸附在孔壁上。
然后用PBS或BSA溶液冲洗孔板孔，以去除未结合的抗原。
2.阻断：加入BSA或牛血清蛋白溶液等阻断剂，封闭孔壁上的非特异性结合位点。
3.添加待测样品：加入待检测的抗体样品，经过适当的孵育后，将孔板洗涤，去除未结合的抗体。
4.加入检测抗体：加入与待测抗体特异性结合的二抗，如抗人IgG的辣根过氧化物酶（HRP）二抗，HRP会与抗体特异性结合，形成复合物。
5.反应缓冲液：加入含有HRP底物的反应缓冲液，允许HRP催化底物，产生荧光或颜色反应。
6.反应停止：加入止反应剂，停止酶反应，停止颜色的产生。
7.读取结果：使用酶标仪或光密度计测量各孔中的荧光或颜色的强度，根据强度值的差异来判断样品中抗原或抗体的存在和浓度。
三、ELISA的操作细节1.实验前准备：准备所需试剂、材料和设备，并确保其干净和无菌。
2.微孔板处理：在操作前检查微孔板的孔是否完整，边沿是否正常。
可事先进行热处理或使用已经处理好的微孔板。
3.孔的布置：根据需要设置对照孔和待测孔，每种样品应设置多个孔位，以保证实验的可靠性。
4.液体处理：液体的加入和去除要注意均匀和充分，特别是在液体去除时需要彻底排空。
5.孔板洗涤：洗涤液的选择要注意是否会影响特异性结合和反应的准确性，同时洗涤液的温度和洗涤次数也需要严格控制。
Elisa技术原理及应用PPT课件
ELISA的检测类型
ABS-ELISA法
➢ 亲和素与生物素的结合，
虽不属于免疫反应，但特
异性强，亲和力大，能够
形成一种极为稳定的复合
体。把亲和素和生物素与
ELISA偶联起来，可以大
①：固相支持物；
大提高ELISA的敏感度。
②：样品； ③：特异性IgG； ④：生物素化抗小鼠IgG （Biotin）；
• 检查抗原和半抗原方面：在内分泌方面用于检测雌性激素、绒毛膜促性腺 激素、黄体素、胰岛素、皮质醇、促甲状腺素和孕酮等
• 在血液学方面：可用于检查凝固因子（如第Ⅷ凝固因子）、红细胞抗原及 结合球蛋白（Hapto Globin）等
• 在肿瘤方面：试用检查甲胎蛋白（AFP）癌胚抗原（CEA），对前者的敏
-
18
ELISA应用前景
ELISA在生物医学领域的应用范围四个方面： •免疫酶染色各种细胞内成份的定位 •研究抗酶抗体的合成 •显现微量的免疫沉淀反应 •定量检测体液中抗原或抗体成份
-
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ELISA应用前景
ELISA在检测抗原方面：
• 在实际应用方面：可作疾病的临床诊断、疾病监察、疾病普查、法医检查、 兽医及农业上的植物病害的诊断检定等。
ABS:亲和素（avidin）生物素 （biotin）系统（system）
⑤：辣根过氧化物酶HRP-酶标链亲和素（Avidin）；
⑥：DAB显色液；
⑦：显色；
-
17
ELISA检测
ELISA特点：
•灵敏度高：ELISA测定法的灵敏度来自作为报告基团的酶。由于酶的催 化效率很高，很少量的酶即可诱导大量的催化反应，产生可供观察的显 色反应，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。
ELISA的原理及分类
ELISA（酶联免疫吸附测定法）是一种常用的生物化学分析技术，用于检测和 定量分析特定物质在样本中的存在量。本演示将介绍ELISA的原理、分类、优 缺点、优化方法、实际应用以及未来趋势。
什么是ELISA
ELISA（酶联免疫吸附测定法）是一种生物化学分析技术，用于检测和定量 分析特定物质在样本中的存在量。
ELISA根据检测过程中所利用的 原理，如直接ELISA、间接ELISA、 夹心ELISA等进行分类，每种方 法都有其适用的场景。
ELISA的优缺点
优点
- 灵敏度高：能够准确检测低浓度的目标物质。 - 专一性强：可以准确检测特定物质，减少误差 和干扰。 - 可大量检测：适用于高通量的样本处理和分析。
药物的筛选
ELISA可以用于快速筛选药物的有 效性和毒副作用，加速药物研发 过程。
食品安全的检测
ELISA可以检测食品中的有害物质 或过敏原，保障食品的安全和质 量。
ELISA未来的发展趋势
1 新的反应体系的发展
研究人员不断探索新的反应体系，如荧光ELISA和电化学ELISA，以提高检测的敏感度和速 度。
2 高通量ELISA技术的发展
高通量ELISA技术的发展将允许同时检测多个目标物质，提高检测的效率和准确性。
3 自动化的发展
随着自动化技术的进步，ELISA的操作将更方便、快捷，并减少操作者的误差。
结束语
ELISA是一种重要的生物化学分析技术，已在许多领域得到广泛应用。随着技术的不断发展，ELISA将继续在医 学、生物科学和食品安全等领域发挥重要作用。 期待ELISA技术在未来的突破和创新，为科学研究和社会发展做出更大的贡献。
ELISA的原理
1
ELISA的步骤
ELISA原理示意图详解ppt课件
1
一、实验目的
A. 了解和掌握免疫酶技术的测定原理。 B. 掌握酶联免疫吸附测定技术的操作步骤，学会利
用竞争ELISA的方法，定量测定抗体或抗原。 C. 了解免疫酶技术在生物学和医学研究的重要意义
及应用价值。
2
二、实验原理
• 免疫标记技术（immunolabelling technique）: 是指用荧光素、放射性同位素、酶、发光剂或
2. 在实际操作中，你认为有哪些因素可以影响定量 检测的结果？（操作中应注意的问题）
3. 实验设计题：如何用竞争ELISA来定量检测抗体？
qinfuwang@
18
就是利用酶标记抗体或抗原，以检测 相应抗原或抗体的一（enzyme linked immunosorbent assay）
是一类常用的免疫酶技术。是将已知 的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使 抗原抗体反应在固相表面进行。
常用的酶：辣根过氧化物酶(HRP) 碱性磷酸酶（AP）。
5
ELISA检测抗原
Ag + Ab* ↔ Ag-Ab*
6
ELISA检测抗体
Ab + Ag* ↔ Ab-Ag*
7
ELISA检测抗体
Ag + Ab1 ↔ Ag-Ab1 Ag-Ab1 + Ab2* ↔ Ag-Ab1-Ab2*
8
9
竞争 ELISA 检测 抗原
10
固定OD值
11
12
实验材料：
• 羊抗人血清白蛋白抗体（一抗） • 已知含量的人血清白蛋白（作标准曲线） • 待检人血清白蛋白 • 辣根过氧化物酶标记的驴抗羊抗体（二抗） • 包被液CBS：PH9.6，0.05mol/L碳酸盐缓冲液 • 洗板液或稀释液：PH7.4，0.01mol/L PBS • 底物溶液：OPD-H2O2 • 终止液：2mol/L H2S04 • 酶标反应板（一条/人）
ELISA知识简介PPT课件
总结与展望：ELISA技术发展趋 势预测
2024/1/26
28
新型标记物在ELISA中应用前景探讨
荧光标记物
高灵敏度、宽线性范围，适用于低丰度蛋白检测 。
酶标记物
高催化活性，可放大信号，提高检测灵敏度。
纳米材料标记物
独特的光学、电学性质，可增强信号并降低背景 干扰。
2024/1/26
29
2024/1/26
肿瘤治疗监测
利用ELISA技术监测肿瘤患 者治疗过程中肿瘤标志物 的变化，评估治疗效果和 预后。
肿瘤复发监测
定期采用ELISA方法检测肿 瘤患者康复期肿瘤标志物 的水平，及时发现肿瘤复 发迹象。
16
药物滥用检测中ELISA方法应用
毒品滥用检测
采用ELISA技术检测尿液或血液中的毒品代谢物，如吗啡、可卡 因等，用于毒品滥用的筛查和确认。
多重检测技术在提高通量方面优势分析
1 2
多通道检测
同时检测多个样本，提高检测效率。
多重荧光标记
实现多目标蛋白同时检测，减少实验误差。
3
微流控芯片技术
集成化、微型化，降低样本消耗和检测成本。
2024/1/26
30
自动化和智能化设备在ELISA领域应用前景
自动化样本处理
减少人工操作，提高实验可重复性。
等疾病。
2024/1/26
03
其他自身抗体检测
ELISA还可应用于抗中性粒细胞胞浆抗体（ANCA）、抗磷脂抗体（
APL）等自身抗体的检测，为自身免疫性疾病的诊断提供依据。
15
肿瘤标志物筛查与监测进展
肿瘤标志物筛查
采用ELISA方法检测肿瘤标 志物，如AFP、CEA、 CA19-9等，实现肿瘤的早 期发现和筛查。
ELISA的原理课件
6 结果判断
定性测定
定性测定的结果判断作出“有”或“无”的回答，分别用“ 阳性”、“阴性”表示。在这种半定量测定中，将标本作一 系列稀释后进行试验，呈阳性反应的最高稀释度即为滴度。 根据滴度的高低，可以判断标本反应性的强弱，这比观察不 稀释标本呈色的深浅判断为强阳性、弱阳性更具定量意义。
标本的采取和保存
（3）冰冻保存的标本须注意避免因停电等造成的反复冻融。
标本的反复冻融所产生的机械剪切力将对标本中的蛋白等分子产生破坏作用 ，从而引起假阴性结果。此外，冻结样本溶解后，蛋白质局部浓缩、分布不 均，应上下颠倒轻缓混匀，避免气泡，不要在混匀器上强烈振荡。
反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测， 宜少量分装冰A中有三个必要的试剂：免疫吸附剂、结合物和酶的 底物。 （1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）； （2）酶标记的抗原或抗体（结合物）； （3）酶的底物； （4）阴性对照品和阳性对照品，参考标准品； （5）结合物及标本的稀释液； （6）洗涤液； （7）酶反应终止液
标本的采取和保存
HRP对氢受体的专一性很高，仅作用于H2O2、小分醇的过氧化 物和尿素过氧化物(urea peroxide)。
显色是酶催化无色的底物生成有色产物的温育反应。反应的温度和时间仍 是影响显色的因素。在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时 间的延长而呈色加强。适当提高温度有助于加速显色进行。
洗涤的方式除某些ELISA仪器配有特殊的自动洗涤仪外，手 工操作有流水冲洗式和浸泡式两种：
（1）流水冲洗式 流水冲洗法最初用于小珠载体的洗涤，洗 涤液为蒸馏水，自来水。洗涤效果更为彻底，且也简便、快速 。已有实验表明，流水冲洗式同样适用于微量滴定板的洗涤。 让水流冲击板孔表面，洗涤效果更佳。
ELISA的种类及原理
ELISA的种类及原理
ELISA（酶联免疫吸附试验）的种类有直接ELISA、间接ELISA、双抗体夹心ELISA、竞争ELISA、间接竞争ELISA
和间接/夹心ELISA。
直接ELISA的原理是将需要检测的抗原直接固定在微孔板上，然后加入与抗原结合的标记抗体，最后用底物检测标志物对微孔板进行显色，以确定抗原的存在。
间接ELISA的原理是先将需要检测的抗原固定在微孔板上，
然后加入特异性抗体，再加入标记二抗与特异性抗体结合，最后用底物检测标志物对微孔板进行显色，以检测抗原的存在。
双抗体夹心ELISA的原理是用两种具有特异性的抗体来检测
抗原。
首先将捕获抗体固定到微孔板上，加入待检样品，待抗原与捕获抗体结合后，加入检测抗体，最后再加入与检测抗体结合的标记二抗进行检测。
竞争ELISA的原理是在抗原与特异性抗体的竞争下检测抗原。
将捕获抗体固定到微孔板上，加入已知抗原浓度的标准样品和待检样品，再加入特异性抗体与标记抗体竞争结合。
间接竞争ELISA的原理同竞争ELISA类似，但检测抗体不是
标记抗体而是另一种竞争性抗体。
间接/夹心ELISA的原理是将捕获抗体固定在微孔板上，加入
待检样品和检测抗体，再加入标记二抗，最后用底物检测标志物对微孔板进行显色，并检测抗原的存在。
ELISA原理和分类(附图解)
一、ELISＡ旳原理ELIＳA旳基础是抗原或抗体旳固相化及抗原或抗体旳酶标记。
结合在固相载体表面旳抗原或抗体仍保持其免疫学活性, 酶标记旳抗原或抗体既保存其免疫学活性, 又保存酶旳活性。
在测定期,受检标本(测定其中旳抗体或抗原）与固相载体表面旳抗原或抗体起反映。
用洗涤旳措施使固相载体上形成旳抗原抗体复合物与液体中旳其他物质分开。
再加入酶标记旳抗原或抗体, 也通过反映而结合在固相载体上。
此时固相上旳酶量与标本中受检物质旳量呈一定旳比例。
加入酶反映旳底物后,底物被酶催化成为有色产物, 产物旳量与标本中受检物质旳量直接有关,故可根据呈色旳深浅进行定性或定量分析。
由于酶旳催化效率很高,间接地放大了免疫反映旳成果,使测定措施达到很高旳敏感度。
二、EＬISA旳类型ELISA可用于测定抗原,也可用于测定抗体。
在这种测定措施中有三个必要旳试剂:(1)固相旳抗原或抗体,即＂免疫吸附剂＂（immunoｓorbｅnｔ)；（2)酶标记旳抗原或抗体, 称为“酶联物”、“结合物”（conｊugate）；（3)酶反映旳底物。
根据试剂旳来源和标本旳状况以及检测旳具体条件,可设计出多种不同类型旳检测措施。
用于临床检查旳ELＩS Ａ重要有如下几种类型:（一）双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法是检测抗原最常用旳措施,操作环节如下:(1）将特异性抗体与固相载体联结,形成固相抗体。
洗涤除去未结合旳抗体及杂质。
（2) 加受检标本,保温反映。
标本中旳抗原与固相抗体结合,形成固相抗原抗体复合物。
洗涤除去其他未结合物质。
(3) 加酶标抗体,保温反映。
固相免疫复合物上旳抗原与酶标抗体结合。
彻底洗涤未结合旳酶标抗体。
此时固相载体上带有旳酶量与标本中受检抗原旳量有关。
(4) 加底物显色。
固相上旳酶催化底物成为有色产物。
通过比色,测知标本中抗原旳量。
在临床检查中, 此法合用于检查多种蛋白质等大分子抗原, 例如HBｓＡｇ、HBeAg、ＡFＰ、ｈＣG等。
只要获得针对受检抗原旳异性抗体, 就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。
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一、ELISA的原理ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。
结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。
在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。
用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。
再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。
此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。
加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。
由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。
二、ELISA的类型ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。
在这种测定方法中有三个必要的试剂：（1）固相的抗原或抗体，即"免疫吸附剂"（immunosorbent）；（2）酶标记的抗原或抗体，称为“酶联物”、“结合物”（conjugate）；（3）酶反应的底物。
根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法。
用于临床检验的ELISA主要有以下几种类型：（一）双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：（1）将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。
洗涤除去未结合的抗体及杂质。
（2）加受检标本，保温反应。
标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。
洗涤除去其他未结合物质。
（3）加酶标抗体，保温反应。
固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。
彻底洗涤未结合的酶标抗体。
此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。
（4）加底物显色。
固相上的酶催化底物成为有色产物。
通过比色，测知标本中抗原的量。
在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG 等。
只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。
如抗体的来源为抗血清，包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。
如应用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。
这种双位点夹心法具有很高的特异性，而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应，作一步法检测。
在一步法测定中，当标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成"夹心复合物"。
类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象，此时反应后显色的吸光值（位于抗原过剩带上）与标准曲线（位于抗体过剩带上）某一抗原浓度的吸光值相同，如按常法测读，所得结果将低于实际的含量，这种现象被称为钩状效应（hook effect），因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落。
钩状效应严重时，反应甚至可不显色而出现假阴性结果。
因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）时，应注意可测范围的最高值。
用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。
假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇，例如HBsAg的a决定簇，也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物。
但在HBsAg的检测中应注意亚型问题，HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4个亚型，显然每种亚型均有相同的a决定簇的反应性，这也是用单抗作夹心法应注意的问题。
双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子（RF）的干扰。
RF是一种自身抗体，多为IgM型，能和多种动物IgG的Fc段结合。
用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF，它可充当抗原成份，同时与固相抗体和酶标抗体结合，表现出假阳性反应。
采用F（ab'）或Fab片段作酶结合物的试剂，由于去除了Fc段，从而可消除RF的干扰。
双抗体夹心法ELISA 试剂是否受RF的影响，已被列为这类试剂的一项考核指标（参见6.2）。
双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。
（二）双抗原夹心法测抗体反应模式与双抗体夹心法类似。
用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。
与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。
此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。
乙肝标志物中抗HBs的检测常采用本法。
本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。
（三）间接法测抗体(我公司分装TORCH及传染病试剂盒大多采用本法)间接法是检测抗体常用的方法。
其原理为利用酶标记的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗体）以检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法（见图2-3）。
操作步骤如下：（1）将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原。
洗涤除去未结合的抗原及杂质。
（2）加稀释的受检血清，保温反应。
血清中的特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。
经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体，血清中的其他成份在洗涤过程中被洗去。
（3）加酶标抗抗体。
可用酶标抗人Ig以检测总抗体，但一般多用酶标抗人IgG检测IgG抗体。
固相免疫复合物中的抗体与酶标抗体抗体结合，从而间接地标记上酶。
洗涤后，固相载体上的酶量与标本中受检抗体的量正相关。
（4）加底物显色本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。
间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。
间接法成功的关键在于抗原的纯度。
虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结果，但应尽可能予以纯化，以提高试验的特异性。
特别应注意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质，例如以E.Coli为工程酶的重组抗原，如其中含有E.Coli成份，很可能与受过E.Coli感染者血清中的抗E.Coli抗体发生反应。
抗原中也不能含有与酶标抗人Ig反应的物质，例如来自人血浆或人体组织的抗原，如不将其中的Ig去除，试验中也发生假阳性反应。
另外如抗原中含有无关蛋白，也会因竟争吸附而影响包被效果。
间接法中另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性抗体。
病人血清中受检的特异性IgG只占总IgG中的一小部分。
IgG的吸附性很强，非特异IgG可直接吸附到固相载体上，有时也可吸附到包被抗原的表面。
因此在间接法中，抗原包被后一般用无关蛋白质（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封闭（blocking）固相上的空余间隙。
另外，在检测过程中标本须先行稀释（1:40~1:200），以避免过高的阴性本底影响结果的判断。
（四）竞争法测抗体当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。
其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。
标本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应。
如抗原为高纯度的，可直接包被固相。
如抗原中会有干扰物质，直接包被不易成功，可采用捕获包被法，即先包被与固相抗原相应的抗体，然后加入抗原，形成固相抗原。
洗涤除去抗原中的杂质，然后再加标本和酶标抗体进行竞争结合反应。
竞争法测抗体有多种模式，可将标本和酶标抗体与固相抗原竞争结合，抗HBc ELISA一般采用此法。
另一种模式为将标本与抗原一起加入到固相抗体中进行竞争结合，洗涤后再加入酶标抗体，与结合在固相上的抗原反应。
抗HBe的检测一般采用此法。
（五）竞争法测抗原小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。
其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。
标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。
小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。
（六）捕获包被法测抗体（经典方法）IgM抗体的检测用于传染病的早期诊断中。
间接法ELISA一般仅适用于检测总抗体或IgG 抗体。
如用抗原包被的间接法直接测定IgM抗体，因标本中一般同时存在较高浓度的IgG抗体，后者将竞争结合固相抗原而使一部份IgM抗体不能结合到固相上。
因此如用抗人IgM 作为二抗，间接测定IgM抗体，必须先将标本用A蛋白或抗IgG抗体处理，以除去IgG的干扰。
在临床检验中测定抗体IgM时多采用捕获包被法。
先用抗人IgM抗体包被固相，以捕获血清标本中的IgM（其中包括针对抗原的特异性IgM抗体和非特异性的IgM）。
然后加入抗原，此抗原仅与特异性IgM相结合。
继而加酶标记针对抗原的特异性抗体。
再与底物作用，呈色即与标本中的IgM成正相关。
此法常用于病毒性感染的早期诊断。
甲型肝炎病毒（HAV）抗体的检测模式见图2-7.类风湿因子（RF）同样能干扰捕获包被法测定IgM抗体，导致假阳性反应。
因此中和IgG的间接法近来颇受青睐，用这类试剂检测抗CMV IgGM和抗弓形虫IgM抗体已获成功。
（七）ABS-ELISA法ABS为亲和素(avidin)生物素(biotin)系统(system)的略语。
亲和素是一种糖蛋白，分子量60000，每个分子由4个能和生物素结合的亚基组成。
生物素为小分子化合物，分子量244.用化学方法制成的衍生物素-羟基琥珀酰亚胺酯可与蛋白质和糖等多种类型的大小分子形成生物素标记产物，标记方法颇为简便。
生物素与亲和素的结合具有很强的特异性，其亲和力较抗原抗体反应大得多，两者一经结合就极为稳定。
由于一个亲和素可与4个生物素分子结合，因此如把ABS与ELISA法可分为酶标记亲和素-生物素（LAB）法和桥联亲和素-生物素（ABC）法两种类型。
两者均以生物素标记的抗体（或抗原）代替原ELISA系统中的酶标抗体（抗原）。
在LAB中，固相生物素先与不标记的亲和素反应，然后再加酶标记的生物素以进一步提高敏感度。
在早期，亲和素从蛋清中提取，这种卵亲和素为碱性糖蛋白，与聚苯乙烯载体的吸附性很强，用于ELISA中可使本底增高。
从链霉菌中提取的链霉亲和素则无此缺点，在ELISA应用中有替代前者的趋势。
由于ABS-ELISA较普通ELISA多用了两种试剂，增加了操作步骤，在临床检验中ABS-ELISA应用不多。
科研项目中检测微量的成分如细胞因子常采用本法。