细胞免疫荧光染色

细胞免疫荧光染色

a．将待分析的细胞传代，铺在事先放置了细胞爬片的24孔板内，细胞不宜过密，否则会影响荧光染色观察单个细胞。5000个/200ul，可以通过加到孔里粗略观察密度。

b．培养一段时间后，待细胞贴壁即可开始细胞免疫染。

c. 取上述24孔板，加入500ul含有Ca2+、Mg2+的PBS，置于4℃摇床上摇晃3分钟，

洗去培养基和杂质，此步重复2次。(可常温)

d．吸取多余的PBS，每孔加入400ul 4%的多聚甲醛用于固定，4℃摇床上摇晃30分钟。

e．移去多聚甲醛，继续加入400ul的PBS洗去残余的液体，常温洗3次，每次3分钟。

f．用PBS配制成0.1M/L氯化铵溶液，向每孔加入300ul，室温培育10分钟，用PBS洗两次，每次三分钟。

g．0.5% Triton X-100 4℃孵育30min，在细胞膜上穿孔，便于染色，之后用PBS洗2次，每次3分钟。

h．TBST配制1%BSA 4℃封闭1小时。TBST 10X的话，用超纯水稀释。

i．一抗4℃封闭过夜，移去一抗，TBST洗5次，每次3分钟。

j．二抗4℃避光孵育1小时，移去二抗，TBST洗4次，每次3分钟，PBS洗3分钟。

k．DAPI核染，4℃染色4分30秒，TBST洗3次，每次3分钟。储存液配成10mg/ml，200ul每管，于避光管中，-20℃保存。工作液为10ug/ml，用超纯水稀释，先配现

用。

l．扣片，用蒸馏水洗去残留的盐分，并晾干，之后将细胞爬片缓缓从一侧放置在滴有4ul mounting media 的载玻片上(有细胞的一面向下)，放在暗处晾干，用指甲油封

住圆形细胞爬片的边缘，风干即可用荧光显微镜拍片。