DNA重排的检测方法
分子病理常用检测方法
分子病理常用检测方法一、PCR（聚合酶链反应）PCR是一种常用的分子生物学技术，可在体外扩增DNA片段。
在分子病理学中，PCR被广泛应用于检测基因突变、基因重排和基因拷贝数变异。
通过PCR扩增后，可以使用各种方法进行分析，如限制性酶切酶切割、聚合酶切点突变检测等。
二、测序技术测序技术是分子病理学中的关键技术之一。
目前常用的测序技术有Sanger测序和下一代测序（NGS）技术。
Sanger测序是一种经典的测序方法，通过DNA链延伸的方式逐个测定碱基序列。
NGS技术则可以同时测定数百万个DNA片段的序列，具有高通量和高灵敏度的优势。
测序技术在分子病理学中被广泛应用于基因突变检测、全基因组测序等。
三、蛋白质质谱蛋白质质谱是一种分析蛋白质组成和结构的方法。
在分子病理学中，蛋白质质谱可用于检测蛋白质的修饰、相互作用和定量分析。
常用的蛋白质质谱技术包括质谱仪、液相色谱和电泳等。
通过蛋白质质谱技术，可以揭示蛋白质在疾病发生和发展中的作用机制。
四、免疫组化免疫组化是一种通过特异性抗体检测蛋白质表达的技术。
在分子病理学中，免疫组化可用于检测疾病标志物、诊断肿瘤类型和判断预后。
通过免疫组化技术，可以通过对组织切片或细胞涂片的染色，观察特定抗原的表达和分布情况。
五、原位杂交原位杂交是一种通过标记了特定DNA序列的探针与组织切片中的DNA进行杂交的方法。
在分子病理学中，原位杂交可用于检测基因缺失、基因扩增和基因重排等。
通过原位杂交技术，可以直接观察到特定基因的表达和分布情况，为疾病的诊断和治疗提供重要信息。
六、基因芯片技术基因芯片技术是一种高通量的基因表达分析方法。
在分子病理学中，基因芯片技术可用于检测基因表达谱、寻找差异表达基因和预测疾病发生的风险。
通过基因芯片技术，可以同时检测上千个基因的表达水平，为疾病的诊断和治疗提供全面的基因信息。
PCR、测序技术、蛋白质质谱、免疫组化、原位杂交和基因芯片技术是分子病理学中常用的检测方法。
基因突变和基因重排的检测方法
基因突变和基因重排的检测方法基因突变和基因重排是影响生命过程的两个关键机制。
突变是指DNA序列发生了错误，而重排则是指基因组中的一段DNA序列被移动或复制到另一个位置。
这些变化会导致有害的影响，如导致癌症、自身免疫性疾病和遗传病等。
因此，检测这些变化变得极其重要，以便及早发现并防止这些疾病的发生。
在过去几十年里，科学家已经开发出了多种基因突变和基因重排的检测方法，其中一些方法在诊断遗传性疾病和癌症等方面证明了非常有效。
下面是一些常见的基因突变和基因重排检测方法。
1. Sanger测序Sanger测序是第一种可靠的DNA测序技术，通过分析DNA序列来检测突变和重排。
将DNA反复复制并添加特定的荧光标记，然后测量不同荧光信号的强度来确定DNA序列。
这种方法可以检测单个基因的突变以及一些基因的重排，并已广泛用于诊断遗传性疾病和癌症等。
2. PCRPCR是另一种常见的基因检测方法，它使用聚合酶链反应技术来扩增DNA片段。
通过扩增目标DNA片段，可以检测基因突变和重排。
PCR可以用于从血液、唾液和口腔黏膜等样本中提取DNA，并且已成为诊断基因突变和重排的主要工具。
3. FISHFISH是一种高度特异性的细胞遗传学方法，可用于检测基因重排。
通过将荧光标记的DNA探针与细胞的染色体配对，科学家可以识别染色体上的重排。
这种方法已被广泛用于癌症分析和遗传诊断等领域。
4. CGHCGH是一种用于检测基因重排的分子遗传学技术。
它可以检测整个基因组上的DNA重排，而不是单个基因。
CGH技术基于比较样品DNA和控制DNA之间的差异，以检测DNA重排的部位和类型。
这种方法已被广泛用于研究人类基因组的变异，并在癌症和遗传性疾病诊断中得到应用。
5. NGSNGS是一种DNA测序方法，可以快速、准确地测定DNA序列。
它通过将样品DNA纳入微型反应器中，然后生成数以百万计的DNA片段。
NGS技术可以同时检测多个基因的突变和重排，并已广泛用于快速检测基因变异。
DNA重组与基因重排
DNA重组与基因重排DNA重组与基因重排的概念DNA重组与基因重排是指在基因组中发生的两种重要的遗传事件。
DNA重组指的是DNA分子内部的片段重新组合的过程，而基因重排则是指基因组中基因的排列发生变化的过程。
这两个过程在生物学领域中具有重要的作用，对于生物的进化和遗传变异至关重要。
DNA重组的类型和机制DNA重组可以分为三种类型：重组联结、基因转座和转位。
重组联结是指DNA的双链断裂后进行连接的重组过程。
基因转座是指转座元件通过剪接和粘连将自身从一个基因移动到另一个基因上的过程。
转位是指转座元件自身的转位事件。
DNA重组的机制主要包括两种：一是同源重组，即两条具有相同顺序的DNA序列之间的重组。
这一机制通常发生在有相似序列的区域，如染色体间重组、基因间的复制等。
二是非同源重组，即两条不完全相同的DNA序列之间的重组。
这一机制通常发生在两个不同的DNA分子之间，如噬菌体的转导等。
基因重排的类型和影响基因重排是指基因组中基因的排列顺序发生变化的过程。
基因重排主要包括基因扩增、基因缺失和基因倒位。
基因扩增是指基因的多次复制，从而使基因组中特定基因的拷贝数目增加。
基因缺失是指基因在基因组中的丢失，导致个体缺乏这个基因的功能。
基因倒位是指基因在基因组中的顺序倒转。
基因重排对生物的遗传变异和进化具有重要的影响。
它们可以导致基因型和表型之间的差异，从而增加物种的适应性和生存能力。
此外，基因重排也是一种导致新基因和功能的出现的重要机制，推动了生物多样性的产生。
DNA重组与基因重排在疾病发生中的作用DNA重组与基因重排在人类疾病的发生中起着至关重要的角色。
它们可以导致基因突变、基因失活和基因过度表达等，进而导致细胞功能异常和疾病的发生。
例如，染色体重排可以导致染色体畸变和肿瘤的发生；基因转座可以导致基因的异常表达，进而引发遗传疾病等。
研究与应用前景DNA重组与基因重排的研究在基因组学和生物医学领域有着广泛的应用前景。
DNA重排的检测方法
马欣荣 高方远 康海歧
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1
一、形态学观察 二、细胞遗传学
如：染色体核型分析、染色体显带等 三、分子细胞遗传学
如：荧光原位杂交 四、分子生物学
如： Southern杂交，PCR及相关技术等
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2
一、形态学观察
例子：
• 上个世纪40年代科学家B．McClintock 观察研究玉米籽粒和叶子时发现有颜色 变化。 这种颜色变化是由遗传结构的基 本改变引起的，从而导致转座子的发现。
10、11号染色体易发生 断裂的基因(MLL)位点
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16
小麦－簇毛麦F1 代染色体间易位
染色体涂染显示人染色体组
荧光标记探针
• 不对环境构成污染 • 灵敏度能得到保障 • 可进行多色观察分析，可同时使用多个
探针，缩短因单个探针分开使用导致的 周期过长和技术障碍。
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19
4. 比较基因组杂交
Comparative Genomic Hybridization (CGH)
原理：在荧光原位杂交基础上，结合消减杂 交技术而发展起来的技术，主要用于 肿瘤的检测及其基因组分析
是由Kallioniemi等在1992年首先提出的，是检 测整个肿瘤基因组DNA增加或减少的强有力的 工具
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• 肿瘤DNA和对照DNA 在染色体上的相对结 合量取决于两种DNA 标本中相应杂交序列 的多少
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4
光谱核型分析原理(Spectral karyotyping, SKY)
1996 年 Schroch等首次描述了SKY技术。 应用5种荧光素同时标记24条人染色体，制成染 色体涂染探针，应用Fourier光谱仪，CC成像 和荧光显微镜进行检测分析，经计算成像处理， 46条染色体形成具有不同颜色的核型影像,可用 以分析各种染色体异常。
临床病理学：肿瘤病理的分子检测
ORR (%)
71.2 vs 47.3 84.6 vs 37.5 62.1 vs 32.2 73.7 vs 30.7
83 vs 36 58 vs 15 61 vs 22 66.9 vs 23.0
PFS (月)
9.8 vs 6.4 8.4 vs 6.7 9.6 vs 6.6 10.8 vs 5.4 13.1 vs 4.6 9.7 vs 5.2 11.1 vs 6.9 11.0 vs 5.6
ROS1 、 RET基因重排
ROS1重排见于2%肺肿瘤；少吸（<10包、年）/不吸 烟患者；年轻患者；腺癌。临床对克唑替尼敏感。 对EGFR TKIs不敏感。 RET基因融合见于1.3%肺癌，腺癌。
临床检测方法：FISH，RT-PCR
HER2在乳腺癌中…
HER2在乳腺癌中…
HER2扩增与肿瘤发生有关。肿瘤体积大 ,无病生存期 短 ,对CMF等方案耐药, 对蒽环类药物比较敏感,50% 患者为ER或PR阳性。
检测：定量PCR或测序。
ALK基因重排在NSCLC中…
发生率： 3-7% 临床特点： 少吸（<10包、年）/不吸烟
年轻患者 腺泡或印戒细胞癌
融合特点： 主要与EML4存在 至少9种融合方式，其他IFGALK, KIF5B-ALK 与其他癌基因变异不共存
靶向药物：克唑替尼
临床检测方法：FISH，增强免疫组化，RT-PCR
EXON
Genet Med 2009:11(1):21–34
胃肠道间质瘤与格列卫
c-kit/PDGFRA突变类型预测伊马替尼疗效，其中c-kit外显子11突变疗效最佳 PDGFRA D842V突变者对伊马替尼原发耐药。 检测方法：DNA测序
基因重排
淋巴瘤的分子生物学诊断知识点
淋巴瘤的分子生物学诊断知识点淋巴瘤是一种以淋巴细胞增生异常为特征的恶性肿瘤，包括多种亚型，具有不同的生物学特征和临床表现。
分子生物学诊断技术在淋巴瘤的分类、预后评估和治疗选择等方面起到了重要的作用。
本文将介绍淋巴瘤分子生物学诊断的一些重要知识点。
一、免疫组织化学检测（IHC）免疫组织化学检测通过检测肿瘤细胞表面或细胞内的特定分子标志物，帮助确定淋巴瘤的亚型和对应的治疗策略。
例如，CD20和CD79a是B细胞标志物，CD3是T细胞标志物，CD30是霍奇金淋巴瘤的标志物等。
免疫组织化学检测可以通过染色的强度和分布情况来判断特定标志物的阳性率，并结合其他临床和病理学特征进行综合分析。
二、基因重排检测淋巴瘤的发生和发展与基因重排异常密切相关。
通过检测重排的免疫球蛋白（Ig）和T细胞受体（TCR）基因，可以帮助确定淋巴瘤的亚型和起源。
例如，典型的霍奇金淋巴瘤患者常存在免疫球蛋白基因的重排。
PCR和Southern blot是常用的基因重排检测方法，可以通过扩增和分析特定基因区域的DNA序列来判断重排情况。
三、染色体异常检测淋巴瘤中常伴随着染色体异常，如染色体重排、整倍体性改变和部分染色体缺失等。
通过检测染色体异常，可以帮助确定淋巴瘤的亚型、预后风险和治疗选择。
常用的染色体异常检测方法包括常规染色体核型分析、荧光原位杂交（FISH）和比较基因组杂交（CGH）等。
FISH 可以通过探针标记的染色体特定区域来检测染色体重排和缺失。
而CGH则可以全基因组范围内分析基因拷贝数变异。
四、新一代测序技术随着新一代测序技术的发展，淋巴瘤分子生物学诊断也得到了进一步的提升。
新一代测序技术可以高效地获得淋巴瘤患者的全基因组、外显子组、转录组和甲基化组等信息。
这些信息可以帮助识别新的突变驱动基因和疾病相关的生物学过程，为个体化治疗提供重要依据。
总结：以上介绍了淋巴瘤分子生物学诊断的一些重要知识点，包括免疫组织化学检测、基因重排检测、染色体异常检测和新一代测序技术。
seq测序的原理及应用
SEQ测序的原理及应用前言SEQ测序是一种重要的生物学技术，它通过测定DNA或RNA序列来揭示生物体内的基因信息。
本文将介绍SEQ测序的原理、应用以及相关的技术发展。
SEQ测序的原理SEQ测序通过反复复制DNA或RNA来获得大量的DNA或RNA片段，然后通过特定的测序方法分析这些片段的序列。
常用的SEQ测序方法包括Sanger测序、454测序、Illumina测序和Ion Torrent测序。
Sanger测序Sanger测序是最早被广泛应用的测序方法之一。
它使用特殊的核酸链终止剂（ddNTP）来阻止DNA链的延伸，然后利用电泳将延伸终止的DNA片段按照大小排序。
测序结束后，根据延伸终止的顺序就可以确定DNA的序列。
454测序454测序是一种高通量测序方法，它使用了一种称为“二代测序”的技术。
该方法通过将DNA片段连接到小珠上，并在小珠表面扩增，然后使用荧光标记的核酸链终止剂来测序。
测序过程中，每次加入一个碱基，都会释放出一个光信号，这些光信号被记录下来并转化为序列。
Illumina测序Illumina测序是目前最常用的高通量测序技术之一。
它利用凝胶上固定的DNA片段和特殊的引物来扩增DNA片段，并通过量子荧光标记的核酸链终止剂来测序。
这种方法可以同时进行数百万次测序，速度快、准确性高。
Ion Torrent测序Ion Torrent测序是一种基于离子检测的测序方法。
该方法使用特殊的压电离子探测器来测量水解反应产生的氢离子数目，从而确定DNA序列。
Ion Torrent测序速度快、成本低，适合快速测序。
SEQ测序的应用SEQ测序在生命科学研究、医学诊断和生物工程等领域有着广泛的应用。
基因组学研究SEQ测序是进行基因组学研究的重要工具之一。
通过测序方法可以获得生物体的全基因组序列，解析基因功能、研究基因组的结构和变异，并寻找与疾病相关的基因。
肿瘤学研究SEQ测序在肿瘤学研究中发挥着重要作用。
通过测序，可以鉴定肿瘤中的基因突变和基因重排等变化，为肿瘤的早期诊断、治疗和预后评估提供依据。
基因组重排的技术原理是
基因组重排的技术原理是
基因组重排的技术原理主要包括以下几方面:
1. 识别目标基因座位点
利用基因定位技术确定需要重排的目标基因在染色体上的精确座位点。
2. 制备重组载体
使用分子克隆技术,在载体上构建含有目标基因和调控元件的重组DNA片段。
3. 将重组载体导入目标细胞
使用病毒载体或基因枪等方法,将重组DNA导入目标细胞/生物体。
4. 目标位点破坏和重组载体的整合
使用端核酶等产生DNA双链断裂,激活细胞的DNA修复机制,促进重组载体的目标位点整合。
5. 筛选重组子代细胞
通过Southern blot、PCR、基因测序等方法鉴定获得了目标基因重排的重组细胞。
6. 获得重组整体生物
将重组细胞培养获得重组整体生物,进行性状鉴定,获得基因组重排的转基因生物
株。
通过这些关键步骤,可以实现对目标生物基因组的精确编辑和重排,获得希望的新性状。
这是转基因技术的重要内容之一。
DNA重排的研究进展
F re q u e n t
S lie n t c a s s e tte
HM R
a
HM L
M AT
F re q u e n t
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酵母细胞接合型决定因子 基因结构及表达
HMLa/HMR/MATa/MAT位点的结构
a1和 2在二倍体细胞中协同抑制单倍体特异性功能
a / d ip lo id
2
2
a1
C CATG TN A N TN N TAC C ATG G
HO内切酶在Y区的切割位点
Y reg io n
TTTCAGCTTTC CGCAACAGTATA AAAGTCGAAAG GCGTTGTCATAT
H O en d on u clease
TTTCAGCTTTC CGCAACA AAAGTCGAAAG GCG
酵母的接合型转换
性别转换只发生在酵母的母细胞
第一次转换
子细胞为a
第一次分裂
a
性别不转换
第二次转换
a
子细胞为
a a
a a
酵母接合型转换模型-磁带模型
酵 母 性 别 转 换 的 磁 带 模 型
S lie n t c a s s e tte
HM L
A c tiv e c a s s e tte
M AT
C C ATG TA ATTA C C C A A A A A G G A A ATTTA C ATG G
PP TA ATTA G TN C N TC A ATG N C A G
DNA重组技术概述
DNA重组技术概述DNA重组技术（DNA recombinant technology）是利用DNA序列的组合、修饰和重排等方法来获得特定目的的DNA分子的一种技术。
该技术被广泛应用于基因工程、生物医药、农业、食品工业等领域，并在科研、生产和临床医学中产生了重要的影响。
DNA重组技术的主要原理是通过DNA分子的切割、粘接、合成等操作，改变DNA序列的结构和组合关系。
这样一来，就可以将不同来源的DNA片段进行组合，重组为新的DNA分子，从而实现对DNA序列的改变和修饰。
DNA重组技术的核心技术包括PCR扩增、限制酶切割、DNA连接、酶体定向克隆、DNA测序等。
PCR扩增是一种常用的DNA重组技术，它可以在短时间内扩增出目标DNA片段。
PCR的原理是通过DNA聚合酶酶作用下的连续循环体系，将目标DNA片段从少量模板DNA中扩增出来。
这种方法简单、高效，广泛应用于分子生物学研究、基因克隆、医学诊断等领域。
限制酶切割是DNA重组技术中常用的一种手段。
限制酶能识别并切割DNA特定的序列，从而产生特定的DNA片段。
通过选择不同的限制酶，可以将DNA分子切割为具有不同片段和末端特性的DNA片段，从而实现希望的DNA重组效果。
限制酶的切割操作常用于基因克隆、DNA分析和重组等实验中。
DNA连接是DNA重组技术的另一个核心环节。
DNA连接是将两条DNA片段的末端通过DNA连接酶的作用连接在一起，形成一个新的DNA分子。
DNA连接的方法有多种，如末端连接、中间连接等。
不同的连接方式和连接酶的选择，可以实现不同的DNA重组目的。
通过DNA连接技术，可以将来自不同源的DNA片段进行连接，从而构建出具有特定功能的DNA分子。
酶体定向克隆是DNA重组技术中的一种重要方法。
它通过酶体（vector）的选择和DNA片段的连接来实现目标DNA片段的克隆和表达。
常用的酶体有质粒、噬菌体和人工染色体等。
酶体定向克隆技术常用于基因工程研究，用于将外源基因导入到宿主细胞中，并在宿主细胞中表达和复制。
DNA重排的检测方法
小麦－簇毛麦F1 代染色体间易位
染色体涂染显示人染色体组
荧光标记探针
• 不对环境构成污染 • 灵敏度能得到保障 • 可进行多色观察分析，可同时使用多个
探针，缩短因单个探针分开使用导致的 周期过长和技术障碍。
4. 比较基因组杂交
Comparative Genomic Hybridization (CGH)
• 原理：在扩增反应中加入不等量的两段寡核 苷酸引物，引物量相差100倍，通过PCR扩增 获得单链DNA，然后利用双脱氧法直接测序。
• 应用：扩增产物的测序，可以很容易确定群 体中某一特定基因的序列变异情况，这种方 法是了解目的基因突变的较理想的方法。
(5) 原位PCR技术
• 原理：即聚合酶原位扩增技术。将PCR技术 与原位杂交技术结合起来，不改变周围组织 的原有位置，直接在组织、细胞或病原体原 位研究基因变化的技术。
光谱核型分析原理(Spectral karyotyping, SKY)
1996 年 Schroch等首次描述了SKY技术。 应用5种荧光素同时标记24条人染色体，制成 染色体涂染探针，应用Fourier光谱仪，CC成 像和荧光显微镜进行检测分析，经计算成像处 理，46条染色体形成具有不同颜色的核型影像, 可用以分析各种染色体异常。
应用：
• 主要应用在检测肿瘤细胞的遗传变化 • 物种间染色体同源性比较 优势：
• 可快捷检测中期、间期基因组 • 不需预先知道DNA发生改变的部位 • 一次实验即可检出待测样本整个基因
组拷贝数的增减
四、分子生物学技术
1. Southern-blotting • 应用于基因重排检测是1981年Korsmeyer等
• 优势：Southern分析已被应用于IgH、 Igk、 Igl及各种TCR(T-细胞受体)克隆性重排的检测， 并以其令人满意的灵敏度和可靠性被视为基因 重排检测的“金标准”。
生物信息学中的DNA序列分析方法与工具介绍
生物信息学中的DNA序列分析方法与工具介绍DNA序列分析是生物信息学领域中的重要研究内容，通过对DNA序列进行分析可以揭示生物基因组的组成、结构和功能，为进一步的生物学研究提供了重要的信息。
本文将介绍DNA序列分析的一些常用方法和工具。
首先要介绍的是DNA序列比对方法。
DNA序列比对是将一个DNA序列与另一个DNA序列进行对比，以确定两个序列之间的相似性和差异性。
在DNA序列比对中有两种常见的方法，即全局比对和局部比对。
全局比对是将整个序列进行比对，适用于两个相似的序列。
而局部比对则是找出序列中的一个片段，与另一个序列进行比对，适用于两个不太相似的序列。
常用的DNA序列比对工具有BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）和BWA （Burrows-Wheeler Aligner）。
其次是DNA序列组装方法。
DNA序列组装是将大量的DNA 片段拼接起来，以重建原始DNA序列。
DNA序列组装是一项复杂的任务，需要解决重复片段的问题和利用辅助信息进行拼接。
目前，在DNA序列组装中常用的方法有重叠组装方法和重建图方法。
重叠组装是通过比对DNA序列片段之间的重叠区域来进行拼接，常用的重叠组装工具有SOAPdenovo和Velvet。
而重建图方法则是通过构建一张图，将DNA序列的片段作为节点，辅助信息作为边，来进行拼接，常用的重建图工具有SPAdes和ABySS。
DNA序列分析中还有一个重要的方法是序列标识和注释方法。
序列标识是将DNA序列进行标记，以便于后续的分析和注释。
常用的序列标识方法有基因预测和开放阅读框（ORF）预测。
基因预测是通过寻找DNA序列中具有编码蛋白质的基因，以确定基因的位置和功能。
而ORF预测则是通过寻找DNA序列中具有编码蛋白质的开放阅读框，以确定蛋白质编码区域。
常用的序列标识工具有GeneMark和Glimmer。
此外，DNA序列分析中还有一些其他的方法和工具。
基因重排检测技术的建立及其在淋巴瘤诊断中的应用
基因重排检测技术的建立及其在淋巴瘤诊断中的应用【关键词】淋巴瘤Detection and clinical significance of gene rearrangements in diagnosis of lymphomas【Abstract】 AIM: To establish a way to detect the gene rearrangements of IgH and TCR and to assess the application of the detection technique in the diagnosis of malignant lymphoma. METHODS: Fiftythree cases of malignant lymphoma and 20 cases of reactive lymphoid hyperplasia were chosen for making tissue sections. Genomic DNA was extracted， and amplified via PCR. The products were resolved on denaturing polyacrylamide gels and visualized through silver staining. RESULTS: Gene rearrangements of IgH and TCR were negative in 20 cases of reactive lymphoid hyperplasia. In all of 18 cases of T cellnonHodgkins lymphoma (TNHL)， gene rearrangement of TCR γ was found in 12 cases and that of TCR β was found in 3 cases， and IgH gene rearrangement was not found. IgH gene rearrangement was found in 28 cases out of 32 cases of B cellNHL (BNHL)，in 2 cases of which gene rearrangements of TCR γ and IgH were both found. There was IgH gene rearrangement in 3 cases of suspected lymphomas. There was a remarkable difference between NHL group and benign group in gene rearrangment (P<0.05). CONCLUSION: The detection of gene rearrangements of IgH and TCR by PCR can be a kind of subsidiary means to diagnose the lymphoproliferative disease. Particularly， the clonality showed in the formalinfixed and paraffinembedded samples may be useful in the retrospective researches.【Keywords】 lymphoma; gene rearrangement; polymerase chain reaction; neoplasm【摘要】目的：建立基于克隆性分析技术的B和T淋巴细胞产生的抗原受体分子基因重排检测技术，探讨B淋巴细胞免疫球蛋白及T淋巴细胞受体基因重排在恶性淋巴瘤临床诊断中的应用. 方法：从组织蜡块中切取组织片5~10张，提取基因组DNA，PCR扩增，聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染显示基因重排结果. 结果：20例良性淋巴组织反应性增生病例中，淋巴细胞IgH及TCR基因重排均为阴性；18例T细胞非何杰金氏淋巴瘤中TCRγ基因重排12例，TCRβ基因重排3例，未见有IgH基因重排；32例B细胞性非何杰金氏淋巴瘤标本中有28例IgH基因重排阳性，有2例TCRγ和IgH基因重排均阳性；3例未确诊的疑难病例均为IgH基因重排；IgH及TCR基因重排检出率在淋巴瘤组与良性组之间，差异有显著意义(P<0.05). 结论：应用PCR法检测B淋巴细胞IgH和T淋巴细胞TCR基因重排可作为淋巴细胞来源的良、恶性病变的一种辅助诊断手段，且适用于石蜡标本以进行回顾性研究.【关键词】淋巴瘤；基因重排；聚合酶链反应；肿瘤0引言恶性淋巴瘤(malignant lymphoma)是免疫系统的原发性恶性肿瘤，主要发生于淋巴器官和淋巴组织. 根据肿瘤的组织结构及细胞学特征可分为何杰金氏病（Hodgkins disease， HD）及非何杰金恶性淋巴瘤（nonHodgkins malignant lymphoma， NHL），淋巴瘤的诊断一直是病理诊断中的难点，部分淋巴组织增生性病变单纯通过HE和免疫组化很难明确性质，另外NHL由于种类繁多，分类复杂，给临床病理工作者带来了一定的困难.淋巴细胞从原始的胚系构型到分化成熟，其抗原受体(Ig和TCR)基因通过基因重排而形成有功能的基因. 一个T，B细胞或其克隆性后代，均只含一种独特的分子遗传学标记. 一旦某一克隆的淋巴细胞发生恶性变化，即可呈现特异的基因重排［1］. 因此，对基因重排类型进行检测可用于对淋巴细胞增殖性疾病的诊断. 此研究拟应用这一手段，探讨淋巴组织增生性病变的性质，并对该技术在恶性淋巴瘤中的诊断价值进行探讨.1材料和方法1.1材料53例恶性淋巴瘤标本均来自第四军医大学唐都医院病理科（1995~2005）. 其中男性29例（55%），女性24例（45%）；年龄12~76岁，平均年龄44.2岁. 所有标本均为福尔马林固定、石蜡包埋组织. 其中B细胞非何杰金淋巴瘤32例，T细胞非何杰金淋巴瘤18例，未能定性的淋巴组织增生性病变3例. 20例良性淋巴组织反应性增生病例作为阴性对照. 所有淋巴瘤病例均在取PCR 模板前经临床病理HE和免疫组化标记（B细胞: CD20，CD79α; T细胞: CD3，CD45RO）证实，以确定为相应病例且所取部位确为病变部位，包含有需检测的部分. 3例未能定性的淋巴组织增生性病变怀疑为BNHL(免疫组化标记CD79α阳性)，但诊断仍未明确.1.2方法1.2.1石蜡包埋组织DNA的提取每例标本制备厚度为4 μm的切片6张，贴于载玻片上，常规烤片、二甲苯脱蜡、乙醇冲洗，切片自然干燥. 用无菌双面刀片将组织刮入1.5 mL的离心管中，按以前的方法［2-3］提取基因组DNA.1.2.2引物合成引物序列由上海生工生物工程技术公司合成. 引物序列为: β球蛋白基因内对照PC03：ACACAACTGTGTTCACTAGC， PC04：CAACTTCATCCACGTTCACC；免疫球蛋白基因重排(IgH) FR3A：ACACGGCTGTGTATTACTGT， LJH： TGAGGAGACGGTGACC，VLJH：GTGACCAGGGTACCTTGGCCCCAG；T细胞受体基因重排(TCR β链和γ链)Db1: CAAAGCTGTAACATTGTGGGGAC， Jb2:AGCACTGTGAGCCTGGTGCC，TVG: AGGGTTGTGTTGGAATCAGG， TJX: CGTCGACAACAAGTGTTGTTCCAC，Vγ11: TCTGGAGTCTATTACTGTGC，Vγ101: CTCACACTCTCACTTC，Jγ12:CAAGTGTTG TTCCACTGCC， Jp12: GTTACTATGAGCTAGTCC.1.2.3PCR扩增及循环条件PCR扩增在PT200型热循环仪（MJ Research）上进行. 反应体系为25 μL，含10 mmol/L dNTP（Gibco BRL）2 μL，10×缓冲液2.5 μL，50 mmol/L MgCl2 0.75 μL，Taq DNA聚合酶（Gibco BRL） 1 U，20 pmol/L引物1 μL，DNA样品1~5 μL. IgH基因采用半巢氏PCR扩增: 第一轮引物为FR3A和LJH，95℃预变性3 min，然后94℃变性40 s，62℃退火50 s，72℃延伸40 s，共30个循环; 最后72℃延伸10 min. 扩增产物经1∶100稀释后取1 μL进行第二轮扩增，引物为FR3A和VLJH，95℃预变性3 min，然后94℃变性40 s，60℃退火50 s，72℃延伸40 s，共30个循环; 最后72℃延伸10 min. FR 3A与VLJH扩增产物为100～120 bp.TCRβ和TCRγ采用40个循环，其中TCRγ引物为Vγ11，Vγ101和Jγ12或Vγ11，Vγ101和Jp12的混合物. 95℃预变性3 min，然后94℃变性40 s，56℃退火50 s，72℃延伸40 s；最后72℃延伸10 min. TCRβ扩增产物为65～85 bp. TCRγ各组扩增产物在70～200 bp不等.β球蛋白基因引物作为内对照进行扩赠，共40个循环. 95℃预变性3 min，然后94℃变性40 s，60℃退火50 s，72℃延伸40 s；最后72℃延伸10 min. 产物长度为110 bp.1.2.4电泳及结果观察琼脂糖凝胶（20 g/L）电泳评价扩增效果后，将3 μL产物和等体积的上样缓冲液［4］（990 mL/L甲酰胺，1 g/L溴酚蓝，1 g/L二甲苯青）混匀后加到厚度为0.8 mm的聚丙烯酰胺凝胶（100 g/L，含尿素8mol/L），应用miniVE系统（AmershamPharmacia Biotech）泳动8 h（80 V）.取出后按以前的方法［2］银染，分别用UVP凝胶分析系统（UVP， Cambridge，UK）和光学照相记录数据，根据IgH及TCR相应阳性位置判断结果.1.2.5结果判定阳性结果判定标准：①PCR扩增电泳条带清晰，宽度不大于1 mm，边缘锐利；②片段大小与预计范围相符，与期望值相差不超过5 bp；③若出现期望值大小之外的其他条带或期望值内出现两条或以上可接受的条带，应判定为重排阴性.统计学处理：采用SPSS 10.0统计分析软件对组间率的差别进行χ2检验，以P<0.05为有统计学意义.2结果2.1组织学观察和免疫组织化学结果32例B细胞非何杰金淋巴瘤免疫组化证实CD20和(或)CD79α阳性， CD3和CD45RO阴性（图1）; 18例T细胞非何杰金淋巴瘤免疫组化证实CD3和(或)CD45RO阳性， CD20和CD79α阴性（图2），支持原来的诊断和分型. 3例未能定性的淋巴组织增生性病变免疫组化标记CD79α阳性， CD3和CD45RO阴性，怀疑为BNHL. 20例良性淋巴组织反应性增生病例CD20，CD79α，CD3，CD45RO均有不同程度的阳性表达.A: CD79а； B: CD20.图1BNHL组织中CD79а和CD20阳性表达（略）A: CD45RO； B: CD3.图2TNHL组织中CD45RO和CD3阳性表达（略）2.2基因重排检测结果2.2.1石蜡组织标本DNA检测PC03，PC04引物对良性增生的淋巴组织以及淋巴瘤组织DNA进行扩增，均见110 bp大小的β球蛋白特异条带（图3）.右侧泳道为100 bp DNA标志物的位置. 1：实验组TNHL. 黄色箭头为110 bp涌动位置;2：实验组BNHL；3：阳性对照TNHL（已知TCRγ重排阳性）；4：阳性对照BNHL（已知IgH重排阳性）；5：反应性增生淋巴组织作为阴性对照.图3PC03/PC04引物PCR扩增结果电泳图（略）2.2.2良性淋巴组织反应性增生病例结果20例良性淋巴组织反应性增生病变组织B细胞和T细胞抗原受体重排均为阴性（图4）.2.2.3阳性对照T，B淋巴瘤检测结果B细胞淋巴瘤阳性对照标本组织B细胞Ig重排阳性（图5）. T细胞淋巴瘤阳性对照标本组织T细胞TCRγ1重排阳性（图6）.右侧泳道为100 bp DNA标志物的位置. 1：IgH FR3A/LJH， FR3A/VLJH引物扩增产物；2：TCRβDb1/Jb2引物扩增产物；3：TCRγ1 TVG/TJX引物扩增产物；4：TCRγ2 Vγ11/Vγ101/Jγ12引物扩增产物； 5：TCRγ3Vγ11/Vγ101/Jp12引物扩增产物. 黄色箭头为110 bp涌动位置.图4良性淋巴组织反应性增生病例PCR扩增结果电泳图（略）左侧泳道为100 bp DNA标志物的位置. 1：内对照PC03/PC04引物扩增产物；2：IgH FR3A/LJH，FR3A/VLJH引物扩增产物；3：TCRβDb1/Jb2引物扩增产物； 4：TCRγ1 TVG/TJX引物扩增产物； 5：TCRγ2 Vγ11/Vγ101/Jγ12引物扩增产物；6：TCRγ3 Vγ11/Vγ101/Jp12引物扩增产物；7：阴性对照FR3A/LJH，FR3A/VLJH引物扩增产物. 黄色箭头为110 bp涌动位置.图5阳性对照BNHL PCR扩增结果电泳图（略）2.2.4淋巴瘤组织检测结果18例T细胞淋巴瘤中TCRγ基因重排为12例，TCRβ基因重排为3例， TCR基因重排阳性率83.3%，与良性组（TCR基因重排均阴性）相比，差异有显著意义(χ2=15.10， P<0.05)；32例B细胞性非何杰金氏淋巴瘤标本中有28例IgH基因重排阳性，其中2例TCRγ基因重排也阳性，基因重排阳性率87.5%，与良性组（IgH基因重排均阴性）相比，差异有显著意义(χ2=25.30， P<0.05).中间泳道为100 bp DNA标志物的位置. 1：TCRβDb1/Jb2引物扩增产物； 2：TCRγ3 Vγ11/Vγ101/Jp12引物扩增产物；3：TCRγ2Vγ11/Vγ101/Jγ12引物扩增产物；4：TCRγ1 TVG/TJX与内对照PC03/PC04引物扩增产物；5：阴性对照TCRγ1 TVG/TJX与内对照PC03/PC04引物扩增产物；6：阴性对照TCRγ2 Vγ11/Vγ101/Jγ12引物扩增产物； 7：阴性对照TCRγ3Vγ11/Vγ101/Jp12引物扩增产物；8：IgH FR3A/LJH，FR3A/VLJH引物扩增产物. 黄色箭头为110 bp涌动位置，红色箭头为190 bp涌动位置，红色箭头为80 bp涌动位置.图6阳性对照TNHL PCR扩增结果电泳图（略）2.2.5未确诊病例检测结果3例未确诊的疑难病例均为IgH基因重排，经FR3A/LJH，FR3A/VLJH引物采用半巢氏PCR扩增后出现95 bp大小IgH阳性条带.3讨论恶性淋巴瘤(malignant lymphoma)是免疫系统的原发性恶性肿瘤，主要发生于淋巴器官和淋巴组织. 淋巴瘤的诊断一直是病理诊断中的难点，部分淋巴组织增生性病变单纯通过HE染色和免疫组化方法很难明确性质，另外NHL种类繁多，分类复杂，给临床病理工作者带来了一定的困难［5］.干细胞在向淋巴细胞分化过程中， Ig重链基因(IgH)和T细胞受体(TCR)基因的可变区(V)和结合区(J)基因会发生重排［6］. 基因重排过程是一个正常的过程，正常淋巴细胞在发育中是多克隆性质，但淋巴造血系统肿瘤所具有的是单克隆性重排，也就是全部肿瘤细胞具有一个相同的免疫球蛋白或TCR 基因重排，即表现为重排基因为单一模式，这对研究淋巴细胞恶变的机制和解决临床的诊断问题都十分重要［6］. 检测单克隆性免疫球蛋白和T细胞受体基因有助于鉴别淋巴系统的肿瘤性和反应性增生，并确定细胞的来源.本研究中18例T细胞淋巴瘤中TCRγ基因重排为12例，TCRβ基因重排为3例， TCR基因重排阳性率83.3%，与Diss等［7］报道的T 细胞淋巴瘤78.2%的检出率相近. 而良性淋巴组织未见克隆性条带， TCR基因重排检出率在TNHL及良性淋巴结反应性增生之间相比，差异有显著意义(P<0.05). 说明TCR基因引物对T细胞性NHL的克隆性确定有重要价值. 32例B细胞性非何杰金氏淋巴瘤标本中有28例IgH基因重排阳性，基因重排阳性率87.5%，与Kros等［8］报道的B细胞淋巴瘤77%的检出率以及国内王萍等［9］报道的B细胞淋巴瘤72 %的检出率相近. 而TNHL及反应性增生均未见IgH克隆性基因重排， IgH基因重排检出率在BNHL及良性淋巴结反应性增生之间相比，差异有显著意义(P<0.05). 说明IgH基因引物对B细胞性NHL的克隆性和细胞源性确定有重要价值，可用于淋巴瘤的诊断和分型.B淋巴细胞产生的抗原受体分子Ig和T淋巴细胞产生的抗原受体分子TCR，其编码基因在细胞的分化过程中均发生重排. 一个T，B细胞或其克隆性后代，均只含一种独特的分子遗传学标记. 大量的实验已证实，淋巴细胞肿瘤源于单克隆性增生. 我们利用特定的引物对其基因进行扩增，当将扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳时，多克隆淋巴细胞将产生一片弥漫带（见于反应性增生），而单克隆性增殖的淋巴组织则出现一明显条带（见于恶性淋巴瘤）.因此对于淋巴瘤的诊断，首先应依靠形态学检查，并辅以免疫组化结果，对于仍不能明确诊断一小部分病例得，可行基因重排检测，在本研究中有3例较难诊断病例，由于病理HE切片、免疫组化均不能做出明确诊断，通过运用PCR技术对其进行基因重排检测，有IgH的特异性重排条带，提示基因重排的检测对于识别此类交界性及淋巴瘤的早期发现可能具有重要价值.参考文献［1］ Garcia MJ， Delgado BM， Granizo JJ， et al. IgH，TCRγ and TCRβ gene rearrangement in 80 B and Tcell NonHodgkins lymphomas: Study of the association between proliferation and the socalled “A berrant” patterns［J］. Diag Mol Pathol， 2001， 10(2): 69-77.［2］王淑芳，苏勤，朱少君，等．多发性子宫平滑肌瘤的克隆性［J］．中华病理学杂志，2002， 31:107-111.［3］朱少君，苏勤，王淑芳，等. 女性外阴尖锐湿疣的克隆性［J］. 诊断病理学杂志， 2003， 10:81-84.［4］ Lucas DR， Shroyer KR， McCarthy PJ， et al. Desmoid tumor is a clonal cellular proliferation: PCR amplification of HUMARA for analysis of patterns of Xchromosome inactivation［J］. Am J SurgPathol， 1997， 21:306-312.［5］高子芬，潘增刚，裴斐，译. 女性生殖系统. 见: Juan Rosai，ed. 回允中，主译. 阿克曼外科病理学［M］. 8版. 沈阳: 辽宁教育出版社，1999. 1319.［6］朱平. 现代血液肿瘤诊断治疗学［M］ . 北京:北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1998:24-41.［7］ Diss TC， Watts M， Pan LX， et al. The polymerase chain reaction in the demonstration of monoclonality in T cell lymphomas［J］. J Clin Pathol， 1995， 48:1045-1050.［8］ Kros JM， Bagdi EK， Zheng P， et al. Analysis of immunoglobulin H gene rearrangement by polymerase chain reaction in primary central nervous system lymphoma［J］. J Neurosurg， 2002，97:1390-1396.［9］王萍，王瑞年，卢健，等. 非霍奇金淋巴瘤的IgH和TCRδ基因重排［J］. 临床与实验病理学杂志， 2002，18: 21-23.。
igh重排检测方法
IGH重排是指免疫球蛋白重链基因（immunoglobulin heavy chain gene）发生基因重组的过程。
为了检测IGH重排，可以采用以下方法：
PCR（聚合酶链式反应）：PCR是一种常用的方法，可以对DNA进行扩增。
使用特定的引物，可以扩增IGH重排区域的DNA序列。
通过PCR扩增的结果可以观察到重排后的DNA片段。
环境极性PCR（inverse PCR）：环境极性PCR是一种特殊的PCR方法，用于检测未知重排位点。
它首先对DNA进行酶切，然后反应体系中加入特定的引物，扩增重排区域的DNA序列。
最后，通过测序分析扩增产物，可以确定重排位点。
双链断裂检测（double-strand breaks assay）：IGH重排过程中，DNA链会发生断裂，然后再通过基因重组形成新的DNA序列。
双链断裂检测可以通过检测重排过程中的DNA断裂来间接地确定IGH重排。
免疫组织化学染色（immunohistochemistry）：免疫组织化学染色可以检测免疫球蛋白重链蛋白的表达情况。
通过染色的结果可以观察到是否发生了IGH重排。
以上是常用的IGH重排检测方法，不同的方法有其优劣性，并且也可以根据具体实验目的进行选择。
DNA测序方法及其在基因组学解读中的作用
DNA测序方法及其在基因组学解读中的作用DNA测序技术是现代基因组学研究中最重要的工具之一，其在基因组学解读中发挥着关键作用。
DNA测序是指确定DNA序列的过程。
自从1977年Sanger法被首次应用以来，DNA测序技术得到了迅猛发展，从而推动了基因组学领域的进展。
现代DNA测序方法有多种，其中最常用的包括Sanger测序、Illumina测序和第三代测序技术。
Sanger测序法是第一个商业化的DNA测序方法，在过去的几十年里一直是主流技术。
它基于DNA复制中使用ddNTP（二脱氧核苷三磷酸）的原理，将DNA分子扩增成一系列不同长度的碎片，然后通过电泳将这些碎片分离出来，并根据停滞的位置确定碱基序列。
然而，Sanger测序法的缺点是高成本、低吞吐量和相对缓慢的速度。
相比之下，Illumina测序技术作为高通量测序的代表，已经成为最常用的测序方法之一。
它基于DNA的大规模并行测序，能够同时处理数千至数百万个DNA分子。
Illumina测序利用DNA扩增、断裂、适配、桥接和扩增等步骤，通过发光法检测碱基扩增的顺序。
这种技术具有高通量、高分辨率和低成本等优点，使研究人员能够在短时间内快速测序大量的DNA样本。
此外，第三代测序技术，如PacBio和ONT，也在基因组学领域中发挥了重要作用。
这些技术通过测量DNA合成的延长时间或单分子的特性来测序，从而实现了长读长重测序。
第三代测序技术具有测序速度快、读长长等优点，能够更好地解决基因组变异、结构重排和重复序列等难题。
DNA测序的发展和应用使得基因组学研究取得了巨大的突破。
通过测序并解读个体基因组，科学家能够鉴定个体的遗传性疾病风险，比如某些癌症和遗传病。
测序还能帮助构建物种进化树和研究物种间的关系，推动了生物多样性研究。
此外，基因组测序还有助于深入理解人类基因组的组成和功能，揭示基因的作用机制，从而为精准医学和个性化治疗提供支持。
DNA测序技术的进步和应用还带来了精准医学的发展。
基因组重组和重排的分子机制研究
基因组重组和重排的分子机制研究基因组重组和重排是生物进化过程中常见的现象。
在这一过程中，基因组中不同的基因会在染色体上重组和重排，产生新的组合，为生物适应环境变化提供了新的基因方案，一定程度上可以增加生物种群的多样性和适应性。
本文将介绍基因组重组和重排的分子机制研究现状及未来可能的发展方向。
一、重组和重排的概念与形式基因组重组通常指染色体间或染色体内不同部分之间的相互交换，而基因组重排则指染色体内部一段基因序列的某种方式移动、删除或复制，并插入到同一染色体的另一位置。
基因组重组和重排产生的新序列可用于早期胚胎发育、免疫系统发育、疾病发生等多个生物过程中。
重组和重排的形式包括异源染色体重组、同源染色体重组、非等位基因重排等，这些形式涉及到不同的分子机制。
二、基因组重组和重排的分子机制（一）重排1. V(D)J重组V(D)J重组是免疫系统细胞发育中一种非常重要的基因重排形式。
在该过程中，V、D和J基因段在基因组特定区域经过非同源重组，从而形成免疫球蛋白和T细胞受体基因的可变部分，通过不同的组合形成能够识别外源抗原的受体。
V(D)J重组发生在IgH、IgK、IgL和TcR α/β/γ/δ等多个基因的可变部分，它是由两个酶——RAG1和RAG2催化的。
2. 移位型DNA重排移位型DNA重排是基因组重排中最为普遍的一种形式，其也是生物进化过程中非常重要的因素。
在该过程中，由转座酶催化的DNA序列剪切和粘接，将某段DNA序列插入到基因组的新位置。
转座酶具有高度的选择性，可以选择在基因组序列中的某些特定位点上发生作用。
（二）重组1. 同源染色体重组同源染色体重组是染色体间最常见的重组形式。
其通常发生在同一物种基因组中两个相似的染色体上，这两个染色体互相配对形成四联体，接着进行交叉互换过程。
在交叉呈交换后，配对染色体可以重新组合形成新的染色体。
2. 异源染色体重组异源染色体重组是较少见的一种基因组重组方式。
该过程发生在不同物种之间的染色体间，不同物种的染色体可以发生交叉互换，产生新的染色体组合。
基因突变的检测与病理诊断
基因突变的检测与病理诊断基因突变是一种常见的基因变异形式，是在DNA分子中的一种不正常的、意外的、或者出现了永久变化的序列单元。
由于基因突变会导致DNA信息的发生改变，从而影响基因的表达和功能，其可能是导致许多遗传病发生和发展的重要原因。
因此，基因突变的检测和诊断对于疾病预防和治疗具有重要意义。
1. 基因突变的检测方法基因突变的检测方法主要包括三种：单一基因疾病检测、基因组测序、基因组重排检测。
单一基因疾病检测是指检测一个基因中某种变异导致疾病的存在，可以通过PCR、Sangers测序、节段扩增等方式进行检测。
例如，致病基因突变导致的囊性纤维化是遗传性疾病之一，即CFTR 基因的编码突变导致纤维化囊性病的发生。
因此，在一个家族中，如果存在不止一个成员有囊性纤维化，可以考虑对该基因进行突变检测。
基因组测序是指通过对DNA序列的完整测定来搜寻某个基因或某些基因区域的突变情况。
它可以检测单核苷酸多样性（SNP）、插入或删除（Indel）等类型的基因突变。
现代的测序技术已经可以通过NGS（下一代测序技术）分析人类整个基因组的信息，这允许检测全遗传基因组中的变异。
例如，基因组测序可以检测致病基因突变与传染性疾病的产生机制和治疗方式的关联性。
另外，基因组测序也可以检测罕见的基因疾病，如先天性心脏病等。
基因组重排检测是指检测有些一段DNA序列在某些疾病情况下被缺失或者重复。
这种变异类型通常在一些多基因疾病或癌症基因分析过程中经常出现。
重复元件是基因组结构中的一部分，因此，一些人群内的�某个基因组区域可能遗传了重复元件，导致某种疾病突变。
例如，在黄色瘤遗传形式中，大部分都是由于C-kit基因的 Chromosome 4上的重复元件所导致，此时可通过基因重排检测来进行检测。
2. 基因突变与疾病的关联基因突变是各种疾病发生的重要原因。
从单基因遗传病的角度来看，多个常见疾病与基因缺陷或突变有直接关联。
例如，血友病是由于F8/F9基因突变而导致的疾病，遗传性乳糜泻疾病是由于消化系统中的酶表达出现问题，因此身体对膳食中的麦类蛋白质产生了过敏反应。
bcr基因重排方法
bcr基因重排方法哎呀，说起这个bcr基因重排方法，我可得好好给你掰扯掰扯。
这事儿得从我大学时候的一个实验说起，那时候我们实验室里有个项目，就是研究这个bcr基因重排的。
你可别小看这个基因重排，它在医学上可有大用处，尤其是在白血病的研究上。
记得那会儿，我们实验室里头，大家都忙得跟什么似的。
我呢，就负责这个基因重排的部分。
首先得说，这个bcr基因重排，它其实是一种基因突变，这种突变在某些类型的白血病中特别常见。
我们的目标就是通过实验，找到一种方法来检测和分析这种基因重排。
我们用的是一种叫做PCR（聚合酶链反应）的技术。
这个技术，简单来说，就是能让我们复制特定的DNA片段，然后通过一系列的步骤，来检测这个bcr基因是否发生了重排。
具体步骤是这样的：1. 提取DNA：首先，我们得从样本中提取出DNA。
这个样本可能是血液，也可能是骨髓，反正就是含有我们想要研究的细胞的地方。
2. 设计引物：接下来，我们得设计一对引物，这对引物就像是DNA复制的模板，它们能特异性地识别bcr基因的特定区域。
3. PCR扩增：有了引物，我们就可以进行PCR扩增了。
这个过程就像是复制粘贴，我们让DNA片段在试管里复制好多好多遍。
4. 电泳分析：复制出来的DNA片段，我们得看看它们长啥样。
这就需要用电泳技术，把DNA片段分离开来，看看有没有我们想要的重排。
5. 结果解读：最后，就是解读结果了。
如果电泳图上出现了我们预期之外的条带，那就意味着bcr基因可能发生了重排。
记得有一次，我们做了一整夜的实验，结果发现了一个异常的条带。
我们那个激动啊，就像是中了彩票一样。
结果后来发现，原来是引物设计的问题，导致结果出现了偏差。
哎，科学实验就是这样，有时候你得面对失败，然后从中学习。
不过，通过这个实验，我学到了很多。
不仅仅是关于bcr基因重排的知识，还有如何面对实验中的挫折和不确定性。
这就像是生活，有时候你得经历一些失败，才能更好地理解成功的意义。
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四、分子生物学技术
1. Southern-blotting • 应用于基因重排检测是1981年Korsmeyer等 应用于基因重排检测是1981 Korsmeyer等 1981年 首先进行的。 首先进行的。 • 淋巴瘤DNA重排:将细胞DNA抽提出来,用限 淋巴瘤DNA重排:将细胞DNA抽提出来, DNA重排 DNA抽提出来 制 性内切酶进行酶切，胚系DNA DNA就会产生特征 性内切酶进行酶切，胚系DNA就会产生特征 性片段。但发生过基因重排的细胞DNA DNA的酶 性片段。但发生过基因重排的细胞DNA的酶 切位点有所改变，会产生有别于胚系的DNA 切位点有所改变，会产生有别于胚系的DNA 酶切片段。转膜后，与标记的DNA探针杂交， DNA探针杂交 酶切片段。转膜后，与标记的DNA探针杂交， 如有一定数量的克隆性增殖的淋巴细胞存 (>1 在 (> 1 ~ 5 % ） ， 克隆性的基因重排条带就 可显示出来。 可显示出来 。 对于正常或多克隆性的淋巴 细胞增生， 细胞增生 ， 由于重排片段大小各异而显弥 散带。 散带。
Figure 5._Southern blot analysis of the T-cell receptor -chain gene. Three specimens are shown, each digested with EcoRI, BamHI, and HindIII restriction enzymes, run in agarose gels, transferred to a nylon membrane, and hybridized with a radioactively labeled J probe. Two specimens, one (negative control) in lanes 2, 5, and 8, and the second in lanes 3, 6, and 9, reveal only germline bands and are polyclonal. The third specimen, in lanes 4, 7, and 10, has evidence of gene rearrangement in all 3 lanes and is monoclonal. Lane 1 shows the markers. Lane 11 is a 5% sensitivity control
4. 比较基因组杂交
Comparative Genomic Hybridization (CGH) 原理：在荧光原位杂交基础上， 原理：在荧光原位杂交基础上，结合消减杂 交技术而发展起来的技术， 交技术而发展起来的技术，主要用于 肿瘤的检测及其基因组分析 是由Kallioniemi等在 等在1992年首先提出的，是检 年首先提出的， 是由 等在 年首先提出的 测整个肿瘤基因组DNA增加或减少的强有力的 测整个肿瘤基因组 增加或减少的强有力的 工具
二、细胞遗传学
染色体核型分析、 染色体核型分析、染色体显带 一个物种的染色体核型及带型是稳定的 染色体核型分析：观察中期染色体， 1. 染色体核型分析：观察中期染色体，初步 分析染色体有无较大片段的缺失、断裂、 分析染色体有无较大片段的缺失、断裂、 易位、及附加 易位、 • 常规核型分析 • 荧光核型分析 • 光谱核型分析(Spectral karyotyping, SKY) 光谱核型分析(
• 肿瘤DNA和对照DNA 肿瘤DNA和对照DNA DNA和对照 在染色体上的相对结 合量取决于两种DNA 合量取决于两种DNA 标本中相应杂交序列 的多少 • 因此可根据不同荧 光強度的比率而定量 分析肿瘤基因組中 DNA的增加或丟失 DNA的增加或丟失
等比混合
比较基因组杂交原理示意
比较基因组杂交过程
人染色体光谱核型分析
乳腺癌细胞染色体复杂的畸变
2.染色体显带技术： 2.染色体显带技术： 染色体显带技术 • C-banding 主要染异染色质 • R-banding 与C-banding 相反，主要染 相反， 常 染色质区域 • G-banding 是Giemsa 染色结果，产生深 染色结果， 浅不同的条带 • Q-banding 是用喹丫因（quinacrine） 是用喹丫因（quinacrine） 染 色得到的荧光条带，带型与G 色得到的荧光条带，带型与G带相似
DAPI ,64’,6-二联脒-2,6 二联脒吲哚苯
FITC 异硫氰酸酯
TRITC 硫氰酸四甲基罗丹明
人染色体不同荧光素染色结果
数 字 化 图 像
FITC/TRITC 荧光强度比率分析图 Ratio image FITC/TRITC
应用： 应用： • 主要应用在检测肿瘤细胞的遗传变化 • 物种间染色体同源性比较 优势： 优势： • 可快捷检测中期、间期基因组 可快捷检测中期、 • 不需预先知道 不需预先知道DNA发生改变的部位 发生改变的部位 • 一次实验即可检出待测样本整个基因 组拷贝数的增减
2. 常规PCR技术 常规 技术
DNA发生重排后，其扩增产物条带与正常的有差异， DNA发生重排后，其扩增产物条带与正常的有差异， 发生重排后 由此可以检测DNA DNA重排 由此可以检测DNA重排 • 淋巴瘤诊断 ： 淋巴瘤是细胞克隆性增生的结果 ， 淋巴瘤诊断： 淋巴瘤是细胞克隆性增生的结果， 其特殊的基因重排形式占一定的数量优势， 其特殊的基因重排形式占一定的数量优势 ， 从而成 为细胞克隆性的检测指标。选取IgH与TCR（T细胞受 为细胞克隆性的检测指标。选取IgH与TCR（ IgH 区基因编码中20 体）的V、D、J、C区基因编码中20 个左右的保守核 苷酸序列， 人工合成一对或多对（ 家族基因） 引物， 苷酸序列 ， 人工合成一对或多对 （ 家族基因 ） 引物 ， 以待测样品DNA为模板， 扩增目的DNA序列片段。 DNA为模板 DNA序列片段 以待测样品 DNA 为模板 ， 扩增目的 DNA 序列片段 。 如 果是淋巴瘤则扩增产物电泳出现单克隆性单带。 果是淋巴瘤则扩增产物电泳出现单克隆性单带 。 而 良性增生性淋巴组织或正常组织则出现弥漫涂片状， 良性增生性淋巴组织或正常组织则出现弥漫涂片状 ， 不形成单带。 不形成单带。
G-带 c. 正常染色体 a. 末端缺失 ห้องสมุดไป่ตู้. 末端倒位 b. 末端单向易位 e. 着丝粒周倒位
G－带显示人急性骨髓白血病异常染色体 10、11染色体间易位 染色体间易位， 9、10、11染色体间易位，右为异常染色体
三、分子细胞遗传学
1. 原位杂交（In situ hybridisation） 原位杂交（ ） 标记的核酸探针变性后与已变性的靶核 酸在退火温度下复性， 酸在退火温度下复性，在不改变被分析 对象， 对象，即维持其原位的前提下对靶核酸 进行分析。 进行分析。 2. 荧光原位杂交
Fluorescent in situ hybridisation (FISH)
核酸探针用荧光染料标记， 核酸探针用荧光染料标记，荧光信号通 过显微镜观察。 过显微镜观察。
染色体涂染(Chromosome 3. 染色体涂染(Chromosome painting)
又称为多重荧光原位杂交(multiplex又称为多重荧光原位杂交(multiplexfluorescence in situ hybridisation, M-FISH) • 可同时检测多个染色体，一次杂交即可检 可同时检测多个染色体， 测人的24条染色体 测人的 条染色体 • 可检测简单及复杂的染色体重排
荧光原位杂交原理示意
荧光原位杂交过程
急性骨髓白血病 10、11号染色体间易位 、 号染色体间易位
10、11号染色体易发生 、 号染色体易发生 断裂的基因(MLL)位点 断裂的基因 位点
小麦－簇毛麦F1 小麦－簇毛麦 代染色体间易位
染色体涂染显示人染色体组
荧光标记探针
• 不对环境构成污染 • 灵敏度能得到保障 • 可进行多色观察分析，可同时使用多个 可进行多色观察分析， 探针， 探针，缩短因单个探针分开使用导致的 周期过长和技术障碍。 周期过长和技术障碍。
• 优势：Southern分析已被应用于IgH、 Igk、 优势：Southern分析已被应用于IgH、 Igk、 分析已被应用于IgH Igl及各种TCR(T-细胞受体)克隆性重排的检测， 及各种TCR(T Igl及各种TCR(T-细胞受体)克隆性重排的检测， 并以其令人满意的灵敏度和可靠性被视为基因 重排检测的“金标准” 重排检测的“金标准”。 局限：需要较大量（10mg）新鲜或冰冻组织， • 局限：需要较大量（10mg）新鲜或冰冻组织， 操作复杂，若用放射性同位素标记，时间过长 操作复杂，若用放射性同位素标记， 约两周），易污染等缺点， ），易污染等缺点 （约两周），易污染等缺点，仅适用于科研而不 适用于临床诊断。 适用于临床诊断。 • 改进：荧光素标记IgH、 Igk、Igl及各种TCR探 改进：荧光素标记IgH Igk、Igl及各种TCR探 IgH、 及各种TCR 针化学发光试剂盒克服了上述缺点， 针化学发光试剂盒克服了上述缺点，以荧光素 取代了同位素作为标记；缩短了曝光时间(5~10 取代了同位素作为标记；缩短了曝光时间(5 分钟) 并且敏感性不降低， 分钟)，并且敏感性不降低，非常有利于在临床 诊断中推广、应用。 诊断中推广、应用。
转基因材料外源基因的检测
转基因黑麦草PCR检测外源Ubi启动子 转基因黑麦草PCR检测外源Ubi启动子 PCR检测外源Ubi
• 上个世纪 年代科学家B．McClintock 上个世纪40年代科学家 ． 年代科学家 观察研究玉米籽粒和叶子时发现有颜色 变化。 变化。 这种颜色变化是由遗传结构的基 本改变引起的，从而导致转座子的发现。 本改变引起的，从而导致转座子的发现。 • 肿瘤细胞与正常细胞 肿瘤细胞中基因重排现象非常普遍， 肿瘤细胞中基因重排现象非常普遍，遗 传结构的改变引起表型的改变。 传结构的改变引起表型的改变。因此从 形态学上可以鉴定肿瘤。 形态学上可以鉴定肿瘤。