淋巴瘤基因克隆性重排检测

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t细胞淋巴瘤tcrγ基因重排特征的分析及检测方法优化

Ｔ细胞淋巴瘤ＴＣＲＴ基Ｎ重排特征分析及检测方法的优化摘要研究背景与目的淋巴瘤在组织和细胞形态学方面与高度反应增生性淋巴组织的鉴别诊断十分困难，容易造成误诊。

淋巴瘤病理诊断是临床病理工作的难题之一。

目前国内主要依靠以形态学为主、免疫组化为辅的诊断手段。

随着分子生物学的发展，从基因水平研究和分析诊断疾病的技术不断出现并且日趋成熟，为淋巴瘤诊断提供了有效工具。

淋巴瘤是由单克隆淋巴细胞增生所致，而反应增生性淋巴组织则来自于多克隆淋巴细胞，这是二者的重要区别。

编码免疫球蛋白（Ｉｇ）或Ｔ细胞受体（ＴＣＲ）的基因经过重排以后，不同克隆之间的重排基因互不相同，因此，基因重排对淋巴瘤的诊断具有特异性价值。

以ＰＣＲ技术为基础的方法以其简便、高效、廉价及适用面广而在淋巴瘤基因重排研究方面越来越受重视。

但不同研究文献中所采用的引物、ＰＣＲ条件、ＰＣＲ产物检测方法等都不尽相同，结果也有差异。

因此，难以找到适于常规临床病理诊断之用的标准程序。

Ｊｕｒｋａｔ细胞是Ｔ细胞淋巴瘤基因重排研究中常用的阳性对照细胞，但有关Ｊｕｒｋａｔ细胞基因重排的详细情况也未见报道。

假基因是Ｉｇ和ＴＣＲ胚系ＤＮＡ中常见的基因，有关假基因参与重排的情况以及在设计引物方面是否应将假基因包括在内也未见有关研究报道。

本实验以ＴＣＲ基因重排为研究对象，通过优化引物选择、ＰＣＲ条件及ＰＣＲ产物的检测方法等，分析Ｔ细胞淋巴瘤基因重排检测的最佳方法。

同时，分析ＴＣＲ基因重排的特点，为进一步研究ＴＣＲ基因重排提供理论和技术支持。

方法１以ＴＣＲｙ基因重排为研究对象，选用通用引物ＴＶＧ、ＶｖＩ及ＴＣＲ７家族特异性引物为工具。

用正交设计实验优化ⅥＩ引物的ＰＣＲ条件。

另选一对ＴＣＲ［ｊ通用引物作为ＴＣＲｙ引物的补充和比较。

２利用ＰＣＲ和测序研究Ｊｕｒｋａｔ细胞基因重排情况，分析ＴＣＲ基因重排的基本特点。

３ＰＣＲ产物检测方法①利用ＴＣＲ通用引物检测淋巴瘤克隆性基因重排阳性率，分别用琼脂糖电泳和ＳＳＣＰ分析ＰＣＲ产物；②将ＰＣＲ产物分别进行直接测序和克隆后测序，分析ＴＣＲ基因重排的特点及探索测序方法在基因重排检测中的应用；⑧分析ＰＣＲ产物中ＤＮＡ的克隆数与ＳＳＣＰ中条带数目的关系。

淋巴瘤的检验报告标准

淋巴瘤的检验报告标准-概述说明以及解释1.引言1.1 概述淋巴瘤是一种常见的恶性肿瘤，起源于淋巴系统的恶性淋巴细胞克隆增殖。

它是世界范围内发病率较高的肿瘤之一，并且在许多国家和地区已经成为癌症的主要死因之一。

淋巴瘤被广泛分为霍奇金淋巴瘤（Hodgkin lymphoma）和非霍奇金淋巴瘤（Non-Hodgkin lymphoma，NHL）两大类。

霍奇金淋巴瘤主要发生在年轻人和青少年，而非霍奇金淋巴瘤则更常见于中老年人。

淋巴瘤的病因和发病机制尚不完全清楚。

与其他肿瘤一样，基因突变和异常表达在淋巴瘤的发生发展过程中起着重要的作用。

此外，一些病毒感染（如EB病毒感染）和免疫系统失调也被认为是淋巴瘤发病的重要因素。

淋巴瘤的临床表现和诊断方法多种多样，主要包括肿块、疼痛、乏力、发热、出汗、体重下降等症状。

诊断主要依靠组织活检、淋巴细胞表型分析、影像学检查等多种手段综合判断。

目前，淋巴瘤的检验报告标准也在不断更新和完善。

这些标准包括病理学诊断标准、分子生物学检测指标、治疗反应评估标准等，这些标准的制定和应用对于淋巴瘤的诊断、治疗和预后评估具有重要意义。

随着科学技术的不断进步和淋巴瘤研究的深入，淋巴瘤的检验报告标准也将不断发展，并且有望实现个体化医疗。

我们对淋巴瘤的认识和治疗水平也将不断提高，为患者提供更好的诊疗效果。

1.2文章结构文章结构部分的内容如下：1.2 文章结构本文主要分为引言、正文和结论三个部分。

以下是对各个部分的详细介绍：引言部分（Chapter 1）：引言部分主要包括三个方面内容。

首先，通过概述淋巴瘤检验报告标准的重要性和必要性，引起读者对该主题的兴趣。

其次，介绍全文的结构和内容，以便读者能够更好地理解和把握文章的主旨。

最后，说明本文的目的，即通过对淋巴瘤检验报告标准的研究和分析，为淋巴瘤的诊断和治疗提供科学依据。

正文部分（Chapter 2）：正文部分主要分为三个小节。

首先，详细介绍淋巴瘤的定义和分类，包括淋巴瘤的基本概念、不同类型的淋巴瘤及其特点等内容。

淋巴瘤基因克隆性重排检测

淋巴瘤应用基因重排检测进行辅助/鉴别诊断的方案
注意事项
▪ 检测到克隆性重排未必一定发生恶性病变某些良性增生也可呈克隆性重排，如CD8+T细胞淋巴增生性病变、良性单克隆性丙种球蛋白病、皮肤淋巴瘤样丘疹病、免疫缺陷患者严重的EB病毒感染等；
▪ 检测不到克隆性重排也不能排除恶性病变某些明确恶性病变的免疫缺陷患者中偶尔检测不到克隆性重排，NK/T细胞淋巴瘤中IG和TCR基因呈胚系结构，即也无克隆性重排。
▪ 辅助诊断：少见类型淋巴瘤，如肝脾T细胞淋巴瘤 ▪ 亚类分析：明确是B淋巴恶性增殖还是T细胞恶性增殖 ▪ 区分同一患者两种淋巴细胞恶性肿瘤，包括复发与继发淋巴瘤 ▪ 微小残留病灶监测，评估治疗效果或复发风险（NGS方法） ▪ 细胞免疫治疗监测，监测回输T细胞增殖状况和淋巴组织来源肿
瘤细胞清除效果（NGS）
淋巴瘤基因克隆性重排和 IGHV体细胞超突变检测
血液肿瘤（常规肿瘤）检测方案-
MICM综合分子检测(旌准方案)
形态学
（Morphology）
分子生物学
（Molecular） • 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE) • 毛细管凝胶电泳(CE) • 荧光实时定量 PCR(RTQT-PCR) • 一代测序(Sanger) • 二代测序(NGS)
胞
B-Cell Receptors (BCR) /Immunoglobulins (Ig) T-Cell Receptor (TCR)
蛋白
Ig重链 Ig轻链 Ig轻链
基因
IGH IGK IGL
染色体定位
14q32 2p12 22q11
蛋白
TCRα TCRβ TCRγ TCRδ
基因染色体定位
TRA 14q11

用IgH、TCR基因重排技术检测疑难淋巴组织增生性病变(精)

用IgH、TCR基因重排技术检测疑难淋巴组织增生性病变【摘要】目的探讨IgH 、TCR基因重排技术检测疑难淋巴组织增生性病变的意义。

方法采用IgH、TCR β、TCR γ基因重排标志检测，36例经常规HE、免疫组化不能诊断的疑难淋巴组织增生性病变，并进行克隆性分析。

结果29例淋巴组织增生性病变呈克隆阳性，其中IgH、TCR双重排阳性者为13例，IgH单一阳性8例，TCR单阳性为8例。

克隆阳性病例与免疫组化结果一致的为24/29例，7例阴性者，4例为反应性增生，2例经随诊为猫抓病淋巴结炎，1例为不典型增生。

结论 IgH、TCR基因重排技术对于疑难淋巴组织增生性病变的诊断和鉴别诊断有较大的意义。

【关键词】淋巴瘤基因重排;诊断Detecting Problematic Proliferative Lesions of Lymph Tissue by IgH and TCR Gene Rearrangement TechniqueZHONG Mei, LV Ya li, LI Bing, ZHAO PoDepartment of Pathology, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, ChinaAbstract：Objective To investigate the significance in diagnosis of problematic proliferative lesions of lymph tissue by IgH, TCR gene rearrangement technique.Methods Thirty six cases of proliferative lesions of lymph tissue with diagnostic difficulty by routine HE and immunohistochemistry, were analyzed in detail by PCR based IgH, TCR gene rearrangement technique to further determine the diagnosis. 20 cases of previously diagnosed lymphoma and 10 reactive lymphadenitis were used as a positive control and negative control, respectively.Results All control samples of lymphoma were positive for clonal rearrangement. 29/36(80.6%)cases of problematic lesion showed positive for clonal proliferation in which those positive for both IgH and TCR were 13/29(44.8%), for single,IgH 8/29(27.6%)or TCR 8/29(27.6%), respectively; and those positivity associated with immunohistochemistry were 24/29(82.8%). In seven cases negative for clonal rearrangement, 4 were reactive proliferation，2 Cat scratch lymphadenitis and 1 atypical proliferation.Conclusion It is significantly useful to solve the problems in differentiating diagnosis of elusive proliferative lesions of lymph tissue, by IgH, TCR gene rearrangement analysis.Key words：Lymphoma; Gene rearrangement; Diagnosis0 引言本研究应用IgH、TCR β、TCR γ基因重排技术对36例疑难淋巴组织增生性病变进行分析，以探讨实际工作中解决疑难问题的可能性及意义。

高通量测序分析B细胞非霍奇金淋巴瘤IGH基因克隆性重排特点及临床应用价值

高通量测序分析B细胞非霍奇金淋巴瘤IGH基因克隆性重排特点及临床应用价值马强;邹东梅;郭轶先;赵弘;常晓丽;胡蓉华;孙婉玲【期刊名称】《肿瘤防治研究》【年(卷),期】2024(51)5【摘要】目的探讨B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)IGH基因克隆性重排特点及临床应用价值。

方法收集接受NGS检测,且存在IGH基因存在克隆性重排的55例B-NHL患者的人口学资料、临床资料及IGH基因NGS检测结果,分析IGH基因克隆性重排特点、IGHV基因取用频率,以及NGS检测IGH基因重排在临床中的应用价值。

结果55例患者中,以单个优势克隆为主(85.45%,47/55),少数患者可检测到2个(12.73%,7/55)和3个优势克隆(1.82%,1/55);在IGHV基因取用偏好方面,IGHV3基因在B-NHL中取用频率最高,其次为IGHV4基因;在IGHV亚型中,IGHV3-23在慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤(CLL/SLL)中出现频率最高,IGHV4-34在原发中枢神经系统弥漫大B细胞淋巴瘤(PCNSL-DLBCL)及弥漫大B细胞淋巴瘤非特指型(DLBCL-NOS)中出现频率最高。

结论不同病理类型的B-NHL患者IGH基因克隆性重排中IGHV基因片段取用频率存在偏好,使用NGS检测IGH重排可以识别亚克隆,鉴定克隆相关性,辅助疾病诊断。

【总页数】5页(P368-372)【作者】马强;邹东梅;郭轶先;赵弘;常晓丽;胡蓉华;孙婉玲【作者单位】首都医科大学宣武医院血液内科【正文语种】中文【中图分类】R551.2【相关文献】1.IgH基因单克隆重排检测及其在B细胞性非霍奇金淋巴瘤诊断中的应用2.血浆游离DNA IgH和TCRγ基因重排在非霍奇金淋巴瘤患者微小残留病中的应用及临床意义3.高通量测序结合捕获技术检测非霍奇金B细胞淋巴瘤中重链基因重排VDJ 区的临床研究4.血浆游离DNA IgH和TCRγ基因克隆性重排在非霍奇金淋巴瘤诊断中的意义5.实时定量PCR检测B细胞非霍奇金淋巴瘤患者外周血和骨髓IgH基因重排及临床意义因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

一种检测淋巴细胞相关基因重排的克隆性的方法[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201711382598.5(22)申请日 2017.12.20(71)申请人北京旌准医疗科技有限公司地址 100176 北京市大兴区经济技术开发区经海四路156号经海产业园A3-2号楼5层(72)发明人袁太明　刘明坤　叶锋　(74)专利代理机构北京爱普纳杰专利代理事务所(特殊普通合伙) 11419代理人何自刚(51)Int.Cl.C12Q 1/6869(2018.01)(54)发明名称一种检测淋巴细胞相关基因重排的克隆性的方法(57)摘要本发明公开了一种检测淋巴细胞相关基因重排的克隆性的方法，属于生物技术领域。

本发明利用高通量二代测序法检测淋巴组织相关基因的重排克隆性，具体是先利用多功能引物和PCR试剂对待测样本进行扩增，得到多样品基因座增殖子文库；其中增殖子文库指两端连有不同接头的DNA片段，一侧为测序接头(可以含样本标签，以区分不同样本的测序结果)，另外一侧为用于连接捕获颗粒的固定接头；然后对增殖子文库进行高通量测序，并根据标签序列将测序结果按照样本及目的基因位点进行分类整理，分析是否存在目的基因的克隆性重排。

本发明具备检测通量高、灵敏度高、特异性高的特性，灵敏度可以达到0.01％，样本的DNA浓度可以低至0.1-1ng/μl。

权利要求书1页说明书14页序列表4页附图6页CN 108004304 A 2018.05.08C N 108004304A1.一种检测基因的重排克隆性和/或体细胞超突变和/或微小残留病的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括多功能引物；所述多功能引物中含有高通量测序平台适用的测序接头的核苷酸序列、能够与样本目标区域匹配的核苷酸序列、相应高通量测序平台适用的固定接头的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述多功能引物的核苷酸序列，由高通量测序平台适用的测序接头的核苷酸序列、能够与样本目标区域匹配的核苷酸序列、相应高通量测序平台适用的固定接头的核苷酸序列依次组成。

琼脂糖凝胶电泳及SSCP法在淋巴瘤克隆性TCRγ基因重排检测中的应用

琼脂糖凝胶电泳及SSCP法在淋巴瘤克隆性TCRγ基因重排检测中的应用韩西群;齐宗利;贺莉;赵彤【期刊名称】《山东医药》【年(卷),期】2009(49)42【摘要】目的比较琼脂糖凝胶电泳和单链构象多态性分析(SSCP)法对淋巴瘤克隆性T细胞受体(TCR)γ基因重排的检测结果,探讨TCRγ基因重排的有效检测方法.方法从T、B细胞淋巴瘤及反应增生性淋巴组织中提取DNA,分别用两组TCRγ基因重排通用引物进行PCR扩增,扩增产物分别进行琼脂糖凝胶电泳和SSCP.结果 T、B细胞淋巴瘤均出现克隆性TCRγ基因重排.SSCP法两组PCR产物在T细胞淋巴瘤中的阳性率分别为77.6%和75.9%,B细胞淋巴瘤均为10%;与SSCP相比,琼脂糖凝胶电泳中两组PCR扩增产物的假阳性率分别为15.3%和14.4%,所有反应增生性淋巴组织均出现假阳性.结论 T、B 细胞淋巴瘤中都存在克隆性TCRγ基因重排,仅用琼脂糖凝胶电泳检测可能出现假阳性,SSCP灵敏性较高.【总页数】3页(P23-25)【作者】韩西群;齐宗利;贺莉;赵彤【作者单位】南方医科大学,广州,510515;南方医科大学,广州,510515;南方医科大学,广州,510515;南方医科大学,广州,510515【正文语种】中文【中图分类】R733;R319【相关文献】1.PCR-SSCP检测非霍奇金淋巴瘤患者骨髓克隆性T细胞受体基因重排及其临床意义 [J], 徐兵;田红;周淑芸2.BIOMED-2标准化IG/TCR基因重排克隆性分析系统在原发性中枢神经系统淋巴瘤诊断中的应用 [J], 王迪;宋福林;秦海明;程琳3.T细胞性淋巴瘤诊断中TCR基因重排检测的应用 [J], 潘鑫艳;杨长绍;黎贵芸;杨举伦;王丽4.TCRβ克隆性基因重排分析在NHL诊断中的应用 [J], 杨华;温建立;邓飞;肖庆邦5.克隆性T细胞受体基因重排检测在皮肤T细胞淋巴瘤中的应用 [J], 徐晨;王琳因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

克隆性基因重排检测用于诊断B细胞淋巴瘤微小病灶

克隆性基因重排检测用于诊断B细胞淋巴瘤微小病灶施纯玫;陈强【期刊名称】《福建医科大学学报》【年(卷),期】2006(040)002【摘要】目的探讨B细胞淋巴瘤(B-NHL)外周血及骨髓克隆性基因重排检测对微小病灶(MD)的诊断价值.方法应用PCR技术,扩增IgH、bcl-2/IgH(包括MBR及MCR)基因重排,对42例治疗前B-NHL患者外周血及骨髓同时进行MD检测,对照组为25例非B-NHL.用IgH基因重排阳性的淋巴瘤CA46细胞株作系列稀释法实验,判断以IgH为分子标志检测外周血及骨髓MD实验的灵敏度.结果淋巴瘤CA46细胞株系列稀释法实验显示:以IgH基因重排为分子标志检测MD敏感性为10-2.42例B-NHL外周血中IgH检出率19% (8/42),bcl-2/IgH检出率为33.3%(14/42).对42例B-NHL同时进行的骨髓MD检测中,IgH检出率为28.6%(12/42),bcl-2/IgH MBR检出率为45.2%(19/42).外周血及骨髓中T细胞淋巴瘤及其他淋巴瘤3种指标检测均为阴性.IgH、bcl-2/IgH MBR、bcl-2/IgH MCR 3个指标各自在骨髓中检出率与外周血中检出率差别无统计学意义(P>0.05),虽然bcl-2/IgH MBR检出率在外周血与骨髓中滤泡性淋巴瘤(FCL)组均较弥漫性大B细胞淋巴瘤组高,但差别无统计学意义(P>0.05).在同时进行的外周血及骨髓检测中,12例骨髓IgH阳性中有8例外周血检测亦为阳性,19例骨髓bcl-2/IgH MBR 阳性中有13例外周血检测为阳性,但1例FCL骨髓检测阴性外周血检测为阳性.结论检测外周血bcl-2/IgH MBR可作为诊断B-NHL MD辅助手段.【总页数】4页(P114-117)【作者】施纯玫;陈强【作者单位】福建省肿瘤医院,内科,福州,350014;福建省肿瘤医院,内科,福州,350014【正文语种】中文【中图分类】R733.4【相关文献】1.克隆性基因重排检测技术在淋巴瘤穿刺标本中的诊断价值 [J], 施纯玫;叶韵斌;陈强2.B细胞淋巴瘤石蜡包埋组织克隆性重链基因重排检测 [J], 施纯玫;叶韵斌;陈强3.弥漫性大B细胞淋巴瘤克隆性基因重排检测研究 [J], 陈愉;赵彤;韩西群;吴炳绪;陈美燕4.克隆性T细胞受体基因重排检测在皮肤T细胞淋巴瘤中的应用 [J], 徐晨;王琳5.石蜡包埋B细胞性恶性淋巴瘤组织克隆性免疫球蛋白重链基因重排检测研究 [J], 陈云昭;李锋;胡文浩;李新霞;李洪安;蒋金芳因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

淋巴瘤基因克隆性重排检测

专注分子诊断 | 引领精准医学
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IGH, IGK, TRB , TRG IGHV
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IGHV SHM的检测
结合 Leader 和 FR1 区域的引物在 5’端连接有通用的测序片段，这种设计，配合 JH 反向测序引物，能够实现 PCR 扩增产物的双向测序。目前，欧洲慢性淋巴细胞性白血病研究机构（European Research Initiative on CLL，ERIC）的指南即使用双向测序判断 IGH V区体细胞超突变（Somatic Hypermutation， SHM）状态。
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基于不同方法的产品系列-Invivoscribe公司
基于PCR检测技术，简便、快速、成本较低，所需DNA量少，对DNA质量要求不高。灵敏度高于10%，需配制胶，安全清洁性较差。
基于PCR-毛细管电泳检测技术，敏感性高，检测周期较长，结果更加直观可靠
目前市场最被接受的检测方法。灵敏度无法满足MRD要求，难以定量和得到序列。
目前市场最被接受的检测方法。灵敏度无法满足MRD要求，难以定量和得到序列。
IGH, IGK, IGL, TRB ,TRD, TRG（BIOMED-2方案，唯一授权） IGHV（依据ERIC指南）
新兴技术，更高灵敏度（10-6），更高分辨率，更高的通量，更广泛的应用。但成本高，仪器贵，操作复杂，时间长。
1-5年
9.2-18.9年
OS
3.2-10年
17.9-25.8年
预后
不良
良好
PFS：无进展生存期（Progression free survival） OS：总生存期（Overall survival）

IgH基因克隆重排在B细胞非霍奇金淋巴瘤中的的诊断价值

IgH基因克隆重排在B细胞非霍奇金淋巴瘤中的的诊断价值目的：探讨IgH基因克隆重排在B细胞非霍奇金淋巴瘤的中的诊断价值。

方法：用PCR凝胶电泳检测B细胞非霍奇金淋巴瘤中IgH基因克隆性重排。

结果：43例B细胞非霍奇金淋巴瘤中，39例用FR3A引物检测阳性，阳性率90.7%；22例用FR2A引物检测阳性，阳性率55.2%；FR3A或者FR2A引物联合检测的总阳性率为90.7%。

结论：PCR凝胶电泳技术检测IgH基因克隆重排对B细胞非霍奇金淋巴瘤的诊断有重要的辅助价值。

标签：B细胞非霍奇金淋巴瘤IgH基因克隆重排淋巴瘤作为我国常见恶性肿瘤之一，从分子病理学和分子遗传学水平来探讨相关基因的特征和发病机制，以期建立相应的分子标记，进一步协助诊断、判断预后[1-2]。

淋巴瘤组织学形态多样，免疫组化染色可鉴定淋巴瘤的类型，但无法解决良恶性鉴别难题。

近年来，国外用分子生物学技术证实，细胞增殖的单克隆性可协助肿瘤的诊断。

本研究应用PC R方法检测B细胞非霍奇金淋巴瘤（B-NHL）中免疫球蛋白重链（IgH）基因重排情况，探讨其在淋巴瘤诊断中的价值。

胚系状态下，IgH基因由可变区（V）、多变区（D）、连接区（J ）、恒定区（C）构成。

这些区域在染色体上分布是不连续，片断之间可有长度不等的插入序列将其分开，当淋巴细胞发育到一定阶段，在重组酶的作用下，重新排列组合构成一个有结构的基因，即所谓的基因重排。

正常B淋巴细胞免疫球蛋白重链（IgH ）基因重排为多克隆性，而恶性B细胞肿瘤表现为单克隆性。

因此，这种单克隆IgH 基因重排可用于B细胞淋巴瘤的诊断，对鉴别良、恶性淋巴细胞增生有重要的参考价值[3-5]。

1. 材料与方法1.1. 标本来源收集浙江大学附属医院，温州医学院2010-2013年间诊断的B细胞非霍奇金淋巴瘤（B-NHL）石蜡标本43例，男性24例，女性19例，年龄17-75岁，平均年龄为52岁。

其中弥漫大B淋巴瘤（DLBCL ）30例，滤泡性淋巴瘤（FL）4例，粘膜相关淋巴组织淋巴瘤（MALT）4例，套细胞淋巴瘤（MCL）3例，小细胞淋巴瘤（SLL/CLL）2例。

基因重排检测技术的建立及其在淋巴瘤诊断中的应用

基因重排检测技术的建立及其在淋巴瘤诊断中的应用【关键词】淋巴瘤Detection and clinical significance of gene rearrangements in diagnosis of lymphomas【Abstract】 AIM: To establish a way to detect the gene rearrangements of IgH and TCR and to assess the application of the detection technique in the diagnosis of malignant lymphoma. METHODS: Fiftythree cases of malignant lymphoma and 20 cases of reactive lymphoid hyperplasia were chosen for making tissue sections. Genomic DNA was extracted， and amplified via PCR. The products were resolved on denaturing polyacrylamide gels and visualized through silver staining. RESULTS: Gene rearrangements of IgH and TCR were negative in 20 cases of reactive lymphoid hyperplasia. In all of 18 cases of T cellnonHodgkins lymphoma (TNHL)， gene rearrangement of TCR γ was found in 12 cases and that of TCR β was found in 3 cases， and IgH gene rearrangement was not found. IgH gene rearrangement was found in 28 cases out of 32 cases of B cellNHL (BNHL)，in 2 cases of which gene rearrangements of TCR γ and IgH were both found. There was IgH gene rearrangement in 3 cases of suspected lymphomas. There was a remarkable difference between NHL group and benign group in gene rearrangment (P<0.05). CONCLUSION: The detection of gene rearrangements of IgH and TCR by PCR can be a kind of subsidiary means to diagnose the lymphoproliferative disease. Particularly， the clonality showed in the formalinfixed and paraffinembedded samples may be useful in the retrospective researches.【Keywords】 lymphoma; gene rearrangement; polymerase chain reaction; neoplasm【摘要】目的：建立基于克隆性分析技术的B和T淋巴细胞产生的抗原受体分子基因重排检测技术，探讨B淋巴细胞免疫球蛋白及T淋巴细胞受体基因重排在恶性淋巴瘤临床诊断中的应用. 方法：从组织蜡块中切取组织片5~10张，提取基因组DNA，PCR扩增，聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染显示基因重排结果. 结果：20例良性淋巴组织反应性增生病例中，淋巴细胞IgH及TCR基因重排均为阴性；18例T细胞非何杰金氏淋巴瘤中TCRγ基因重排12例，TCRβ基因重排3例，未见有IgH基因重排；32例B细胞性非何杰金氏淋巴瘤标本中有28例IgH基因重排阳性，有2例TCRγ和IgH基因重排均阳性；3例未确诊的疑难病例均为IgH基因重排；IgH及TCR基因重排检出率在淋巴瘤组与良性组之间，差异有显著意义(P<0.05). 结论：应用PCR法检测B淋巴细胞IgH和T淋巴细胞TCR基因重排可作为淋巴细胞来源的良、恶性病变的一种辅助诊断手段，且适用于石蜡标本以进行回顾性研究.【关键词】淋巴瘤；基因重排；聚合酶链反应；肿瘤0引言恶性淋巴瘤(malignant lymphoma)是免疫系统的原发性恶性肿瘤，主要发生于淋巴器官和淋巴组织. 根据肿瘤的组织结构及细胞学特征可分为何杰金氏病（Hodgkins disease， HD）及非何杰金恶性淋巴瘤（nonHodgkins malignant lymphoma， NHL），淋巴瘤的诊断一直是病理诊断中的难点，部分淋巴组织增生性病变单纯通过HE和免疫组化很难明确性质，另外NHL由于种类繁多，分类复杂，给临床病理工作者带来了一定的困难.淋巴细胞从原始的胚系构型到分化成熟，其抗原受体(Ig和TCR)基因通过基因重排而形成有功能的基因. 一个T，B细胞或其克隆性后代，均只含一种独特的分子遗传学标记. 一旦某一克隆的淋巴细胞发生恶性变化，即可呈现特异的基因重排［1］. 因此，对基因重排类型进行检测可用于对淋巴细胞增殖性疾病的诊断. 此研究拟应用这一手段，探讨淋巴组织增生性病变的性质，并对该技术在恶性淋巴瘤中的诊断价值进行探讨.1材料和方法1.1材料53例恶性淋巴瘤标本均来自第四军医大学唐都医院病理科（1995~2005）. 其中男性29例（55%），女性24例（45%）；年龄12~76岁，平均年龄44.2岁. 所有标本均为福尔马林固定、石蜡包埋组织. 其中B细胞非何杰金淋巴瘤32例，T细胞非何杰金淋巴瘤18例，未能定性的淋巴组织增生性病变3例. 20例良性淋巴组织反应性增生病例作为阴性对照. 所有淋巴瘤病例均在取PCR 模板前经临床病理HE和免疫组化标记（B细胞: CD20，CD79α; T细胞: CD3，CD45RO）证实，以确定为相应病例且所取部位确为病变部位，包含有需检测的部分. 3例未能定性的淋巴组织增生性病变怀疑为BNHL(免疫组化标记CD79α阳性)，但诊断仍未明确.1.2方法1.2.1石蜡包埋组织DNA的提取每例标本制备厚度为4 μm的切片6张，贴于载玻片上，常规烤片、二甲苯脱蜡、乙醇冲洗，切片自然干燥. 用无菌双面刀片将组织刮入1.5 mL的离心管中，按以前的方法［2-3］提取基因组DNA.1.2.2引物合成引物序列由上海生工生物工程技术公司合成. 引物序列为: β球蛋白基因内对照PC03：ACACAACTGTGTTCACTAGC， PC04：CAACTTCATCCACGTTCACC；免疫球蛋白基因重排(IgH) FR3A：ACACGGCTGTGTATTACTGT， LJH： TGAGGAGACGGTGACC，VLJH：GTGACCAGGGTACCTTGGCCCCAG；T细胞受体基因重排(TCR β链和γ链)Db1: CAAAGCTGTAACATTGTGGGGAC， Jb2:AGCACTGTGAGCCTGGTGCC，TVG: AGGGTTGTGTTGGAATCAGG， TJX: CGTCGACAACAAGTGTTGTTCCAC，Vγ11: TCTGGAGTCTATTACTGTGC，Vγ101: CTCACACTCTCACTTC，Jγ12:CAAGTGTTG TTCCACTGCC， Jp12: GTTACTATGAGCTAGTCC.1.2.3PCR扩增及循环条件PCR扩增在PT200型热循环仪（MJ Research）上进行. 反应体系为25 μL，含10 mmol/L dNTP（Gibco BRL）2 μL，10×缓冲液2.5 μL，50 mmol/L MgCl2 0.75 μL，Taq DNA聚合酶（Gibco BRL） 1 U，20 pmol/L引物1 μL，DNA样品1~5 μL. IgH基因采用半巢氏PCR扩增: 第一轮引物为FR3A和LJH，95℃预变性3 min，然后94℃变性40 s，62℃退火50 s，72℃延伸40 s，共30个循环; 最后72℃延伸10 min. 扩增产物经1∶100稀释后取1 μL进行第二轮扩增，引物为FR3A和VLJH，95℃预变性3 min，然后94℃变性40 s，60℃退火50 s，72℃延伸40 s，共30个循环; 最后72℃延伸10 min. FR 3A与VLJH扩增产物为100～120 bp.TCRβ和TCRγ采用40个循环，其中TCRγ引物为Vγ11，Vγ101和Jγ12或Vγ11，Vγ101和Jp12的混合物. 95℃预变性3 min，然后94℃变性40 s，56℃退火50 s，72℃延伸40 s；最后72℃延伸10 min. TCRβ扩增产物为65～85 bp. TCRγ各组扩增产物在70～200 bp不等.β球蛋白基因引物作为内对照进行扩赠，共40个循环. 95℃预变性3 min，然后94℃变性40 s，60℃退火50 s，72℃延伸40 s；最后72℃延伸10 min. 产物长度为110 bp.1.2.4电泳及结果观察琼脂糖凝胶（20 g/L）电泳评价扩增效果后，将3 μL产物和等体积的上样缓冲液［4］（990 mL/L甲酰胺，1 g/L溴酚蓝，1 g/L二甲苯青）混匀后加到厚度为0.8 mm的聚丙烯酰胺凝胶（100 g/L，含尿素8mol/L），应用miniVE系统（AmershamPharmacia Biotech）泳动8 h（80 V）.取出后按以前的方法［2］银染，分别用UVP凝胶分析系统（UVP， Cambridge，UK）和光学照相记录数据，根据IgH及TCR相应阳性位置判断结果.1.2.5结果判定阳性结果判定标准：①PCR扩增电泳条带清晰，宽度不大于1 mm，边缘锐利；②片段大小与预计范围相符，与期望值相差不超过5 bp；③若出现期望值大小之外的其他条带或期望值内出现两条或以上可接受的条带，应判定为重排阴性.统计学处理：采用SPSS 10.0统计分析软件对组间率的差别进行χ2检验，以P<0.05为有统计学意义.2结果2.1组织学观察和免疫组织化学结果32例B细胞非何杰金淋巴瘤免疫组化证实CD20和(或)CD79α阳性， CD3和CD45RO阴性（图1）; 18例T细胞非何杰金淋巴瘤免疫组化证实CD3和(或)CD45RO阳性， CD20和CD79α阴性（图2），支持原来的诊断和分型. 3例未能定性的淋巴组织增生性病变免疫组化标记CD79α阳性， CD3和CD45RO阴性，怀疑为BNHL. 20例良性淋巴组织反应性增生病例CD20，CD79α，CD3，CD45RO均有不同程度的阳性表达.A: CD79а； B: CD20.图1BNHL组织中CD79а和CD20阳性表达（略）A: CD45RO； B: CD3.图2TNHL组织中CD45RO和CD3阳性表达（略）2.2基因重排检测结果2.2.1石蜡组织标本DNA检测PC03，PC04引物对良性增生的淋巴组织以及淋巴瘤组织DNA进行扩增，均见110 bp大小的β球蛋白特异条带（图3）.右侧泳道为100 bp DNA标志物的位置. 1：实验组TNHL. 黄色箭头为110 bp涌动位置;2：实验组BNHL；3：阳性对照TNHL（已知TCRγ重排阳性）；4：阳性对照BNHL（已知IgH重排阳性）；5：反应性增生淋巴组织作为阴性对照.图3PC03/PC04引物PCR扩增结果电泳图（略）2.2.2良性淋巴组织反应性增生病例结果20例良性淋巴组织反应性增生病变组织B细胞和T细胞抗原受体重排均为阴性（图4）.2.2.3阳性对照T，B淋巴瘤检测结果B细胞淋巴瘤阳性对照标本组织B细胞Ig重排阳性（图5）. T细胞淋巴瘤阳性对照标本组织T细胞TCRγ1重排阳性（图6）.右侧泳道为100 bp DNA标志物的位置. 1：IgH FR3A/LJH， FR3A/VLJH引物扩增产物；2：TCRβDb1/Jb2引物扩增产物；3：TCRγ1 TVG/TJX引物扩增产物；4：TCRγ2 Vγ11/Vγ101/Jγ12引物扩增产物； 5：TCRγ3Vγ11/Vγ101/Jp12引物扩增产物. 黄色箭头为110 bp涌动位置.图4良性淋巴组织反应性增生病例PCR扩增结果电泳图（略）左侧泳道为100 bp DNA标志物的位置. 1：内对照PC03/PC04引物扩增产物；2：IgH FR3A/LJH，FR3A/VLJH引物扩增产物；3：TCRβDb1/Jb2引物扩增产物； 4：TCRγ1 TVG/TJX引物扩增产物； 5：TCRγ2 Vγ11/Vγ101/Jγ12引物扩增产物；6：TCRγ3 Vγ11/Vγ101/Jp12引物扩增产物；7：阴性对照FR3A/LJH，FR3A/VLJH引物扩增产物. 黄色箭头为110 bp涌动位置.图5阳性对照BNHL PCR扩增结果电泳图（略）2.2.4淋巴瘤组织检测结果18例T细胞淋巴瘤中TCRγ基因重排为12例，TCRβ基因重排为3例， TCR基因重排阳性率83.3%，与良性组（TCR基因重排均阴性）相比，差异有显著意义(χ2=15.10， P<0.05)；32例B细胞性非何杰金氏淋巴瘤标本中有28例IgH基因重排阳性，其中2例TCRγ基因重排也阳性，基因重排阳性率87.5%，与良性组（IgH基因重排均阴性）相比，差异有显著意义(χ2=25.30， P<0.05).中间泳道为100 bp DNA标志物的位置. 1：TCRβDb1/Jb2引物扩增产物； 2：TCRγ3 Vγ11/Vγ101/Jp12引物扩增产物；3：TCRγ2Vγ11/Vγ101/Jγ12引物扩增产物；4：TCRγ1 TVG/TJX与内对照PC03/PC04引物扩增产物；5：阴性对照TCRγ1 TVG/TJX与内对照PC03/PC04引物扩增产物；6：阴性对照TCRγ2 Vγ11/Vγ101/Jγ12引物扩增产物； 7：阴性对照TCRγ3Vγ11/Vγ101/Jp12引物扩增产物；8：IgH FR3A/LJH，FR3A/VLJH引物扩增产物. 黄色箭头为110 bp涌动位置，红色箭头为190 bp涌动位置，红色箭头为80 bp涌动位置.图6阳性对照TNHL PCR扩增结果电泳图（略）2.2.5未确诊病例检测结果3例未确诊的疑难病例均为IgH基因重排，经FR3A/LJH，FR3A/VLJH引物采用半巢氏PCR扩增后出现95 bp大小IgH阳性条带.3讨论恶性淋巴瘤(malignant lymphoma)是免疫系统的原发性恶性肿瘤，主要发生于淋巴器官和淋巴组织. 淋巴瘤的诊断一直是病理诊断中的难点，部分淋巴组织增生性病变单纯通过HE染色和免疫组化方法很难明确性质，另外NHL种类繁多，分类复杂，给临床病理工作者带来了一定的困难［5］.干细胞在向淋巴细胞分化过程中， Ig重链基因(IgH)和T细胞受体(TCR)基因的可变区(V)和结合区(J)基因会发生重排［6］. 基因重排过程是一个正常的过程，正常淋巴细胞在发育中是多克隆性质，但淋巴造血系统肿瘤所具有的是单克隆性重排，也就是全部肿瘤细胞具有一个相同的免疫球蛋白或TCR 基因重排，即表现为重排基因为单一模式，这对研究淋巴细胞恶变的机制和解决临床的诊断问题都十分重要［6］. 检测单克隆性免疫球蛋白和T细胞受体基因有助于鉴别淋巴系统的肿瘤性和反应性增生，并确定细胞的来源.本研究中18例T细胞淋巴瘤中TCRγ基因重排为12例，TCRβ基因重排为3例， TCR基因重排阳性率83.3%，与Diss等［7］报道的T 细胞淋巴瘤78.2%的检出率相近. 而良性淋巴组织未见克隆性条带， TCR基因重排检出率在TNHL及良性淋巴结反应性增生之间相比，差异有显著意义(P<0.05). 说明TCR基因引物对T细胞性NHL的克隆性确定有重要价值. 32例B细胞性非何杰金氏淋巴瘤标本中有28例IgH基因重排阳性，基因重排阳性率87.5%，与Kros等［8］报道的B细胞淋巴瘤77%的检出率以及国内王萍等［9］报道的B细胞淋巴瘤72 %的检出率相近. 而TNHL及反应性增生均未见IgH克隆性基因重排， IgH基因重排检出率在BNHL及良性淋巴结反应性增生之间相比，差异有显著意义(P<0.05). 说明IgH基因引物对B细胞性NHL的克隆性和细胞源性确定有重要价值，可用于淋巴瘤的诊断和分型.B淋巴细胞产生的抗原受体分子Ig和T淋巴细胞产生的抗原受体分子TCR，其编码基因在细胞的分化过程中均发生重排. 一个T，B细胞或其克隆性后代，均只含一种独特的分子遗传学标记. 大量的实验已证实，淋巴细胞肿瘤源于单克隆性增生. 我们利用特定的引物对其基因进行扩增，当将扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳时，多克隆淋巴细胞将产生一片弥漫带（见于反应性增生），而单克隆性增殖的淋巴组织则出现一明显条带（见于恶性淋巴瘤）.因此对于淋巴瘤的诊断，首先应依靠形态学检查，并辅以免疫组化结果，对于仍不能明确诊断一小部分病例得，可行基因重排检测，在本研究中有3例较难诊断病例，由于病理HE切片、免疫组化均不能做出明确诊断，通过运用PCR技术对其进行基因重排检测，有IgH的特异性重排条带，提示基因重排的检测对于识别此类交界性及淋巴瘤的早期发现可能具有重要价值.参考文献［1］ Garcia MJ， Delgado BM， Granizo JJ， et al. IgH，TCRγ and TCRβ gene rearrangement in 80 B and Tcell NonHodgkins lymphomas: Study of the association between proliferation and the socalled “A berrant” patterns［J］. Diag Mol Pathol， 2001， 10(2): 69-77.［2］王淑芳，苏勤，朱少君，等．多发性子宫平滑肌瘤的克隆性［J］．中华病理学杂志，2002， 31:107-111.［3］朱少君，苏勤，王淑芳，等. 女性外阴尖锐湿疣的克隆性［J］. 诊断病理学杂志， 2003， 10:81-84.［4］ Lucas DR， Shroyer KR， McCarthy PJ， et al. Desmoid tumor is a clonal cellular proliferation: PCR amplification of HUMARA for analysis of patterns of Xchromosome inactivation［J］. Am J SurgPathol， 1997， 21:306-312.［5］高子芬，潘增刚，裴斐，译. 女性生殖系统. 见: Juan Rosai，ed. 回允中，主译. 阿克曼外科病理学［M］. 8版. 沈阳: 辽宁教育出版社，1999. 1319.［6］朱平. 现代血液肿瘤诊断治疗学［M］ . 北京:北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1998:24-41.［7］ Diss TC， Watts M， Pan LX， et al. The polymerase chain reaction in the demonstration of monoclonality in T cell lymphomas［J］. J Clin Pathol， 1995， 48:1045-1050.［8］ Kros JM， Bagdi EK， Zheng P， et al. Analysis of immunoglobulin H gene rearrangement by polymerase chain reaction in primary central nervous system lymphoma［J］. J Neurosurg， 2002，97:1390-1396.［9］王萍，王瑞年，卢健，等. 非霍奇金淋巴瘤的IgH和TCRδ基因重排［J］. 临床与实验病理学杂志， 2002，18: 21-23.。

TCR重排

TCR重排一、临床意义：近年来小儿急性淋巴细胞白血病的发生日趋增多, 并且在成年人的发病率也呈增长的趋势, 虽然部分患者经过化疗或干细胞移植, 能够达到临床或血液学的完全缓解( Complete Remission, CR) , 但白血病微小残留病(Minimal Residual Disease, MRD) 导致白血病复发的问题一直困扰着医务人员。

目前检测MRD 的手段很多, 如流式细胞仪检测白血病细胞、RT-PCR 检测白血病基因等方法, 其中白血病基因检测具有灵敏度高的特点具有很高的参考价值。

然而淋巴细胞白血病因为不具有高特异性的白血病基因, 所以在MRD 的监测上比较困难。

1、TCR基因重排技术是检测淋巴细胞克隆性增生的金标准，应用于恶性淋巴瘤的早期诊断和鉴别诊断有重大意义，特别是对于经常规HE、免疫组化检测仍不能确诊的病例有较好的用途和前景。

非霍奇金淋巴瘤是发生于单一亲本细胞的单克隆恶性增殖，瘤细胞的基因重排高度一致。

而正常淋巴组织和良性淋巴组织增生性疾病呈多克隆性，因此可作为非霍奇金淋巴瘤的基因标志。

TCRγ或TCRβ基因重排常作为T 细胞淋巴瘤的基因标志，阳性率可达70%～80%。

为非霍奇金淋巴瘤的诊断、分型及评估预后提供参考依据。

由此可见TCR 基因重排是淋巴细胞恶性增生的特异性标志。

2、我们通过对T 细胞受体(Tcell receptor , TCR) 检测以及它们在监测MRD 中的临床意义的研究, 观察到这种TCR基因重排的检测持续阳性的患者, 更容易导致白血病的早期复发。

因而在ALL 病程中对TCR基因重排进行动态监测, 极大的提高MRD 检出的特异性和敏感性,对ALL患儿的预后、复发的判断及制定相应的个体化治疗方案有重要的指导意义,可以使患儿最大程度的长期无病生存,减少化疗所致的远期不良反应。

二、检测方法：1、S outhern杂交技术（印迹杂交）优点是稳定、可靠, 被称为基因重排的金标准,缺点是成本较高, 需要较多新鲜组织、操作复杂和费时, 且国内收费标准较低, 无法广泛应用于淋巴瘤的鉴别诊断。

克隆性基因重排检测的原理及结果判读

IGK-B
阴性对照
78F, 胃窦、胃底活检组织，组织较小， CD20+、CD79+、bcl6+、κ+、 Ki67 95%等
结合形态、IHC 和基因重排检测诊断为DLBCL
5种T细胞淋巴瘤类型中克隆性重排
TCRG-A TCRG-B TCRB-A TCRB-B TCRB-C TCRD
阴性病例
31F 皮肤病变， CD20+， CD3+， CD4-， CD8-，Ki67（80-90%），CD56-， TIA-1+，EBER+等。
PCR检测的分析方法
1. 异源双链PAGE电泳分析
2. 基因扫描分析
异源双链PAGE电泳分析
+
-
判读原则：
克隆性：
➢ 条带在期望的碱基大小范围内；一条或两条
➢ 带宽不超过1mm, ➢ 边缘整齐；
多克隆性：无特异性条带，弥散带或梯状带
异源双链PAGE电泳分析的优缺点
优点：
➢ 简便、易开展； ➢ 对变异范围小的基因重排易判断
优点： ➢步骤相对简单 ➢DNA需求量小 ➢价格相对便宜
缺点： ➢根据大小而不是序列 ➢不典型时判断困难 ➢敏感性低
二代测序检测克隆性重排
结果判断
判断依据： ➢每个VJ区使用比例 ➢显示重排的序列
优点： ➢更敏感 ➢判断更客观
应用 ➢检测克隆 ➢确定复发还是原发 ➢外周血MRD
5种B细胞淋巴瘤类型中克隆性重排
克隆性检出与B细胞淋巴瘤起源有关
FL中 IGH重排：57% IGK重排：80% IGH+IGK： 96% IGH+IGK+IGL：100%
对于生发中心起源的淋巴瘤选用IGK的必要性

应用基因重排技术诊断淋巴瘤

应用基因重排技术诊断淋巴瘤淋巴瘤是发生于淋巴组织的恶性肿瘤。

淋巴组织由T、B淋巴细胞，组织细胞等免疫活性细胞组成。

由于其组织学结构特殊，当它受到抗原刺激时能产生不同程度的反应性增生，淋巴结正常结构紊乱，免疫母细胞增生，核分裂相增多等假恶性图象。

因此仅凭形态学观察有时很难确定其良、恶性。

目前，一般病理科大约有70%左右的淋巴组织增生性疾病，凭常规切片可以明确诊断，约25%的病例。

但对于无表面标记的早期未成熟细胞，或失去表面标记的异常细胞却无能为力。

对反应性增生细胞成分较多的病例，瘤细胞即使有免疫表型也可能被掩盖。

相反，由于操作等原因造成抗原扩散也可能造成假阳性。

近年发展起来的克隆性基因重排检测技术为疑难、早期或微量标本确定诊断提供了可能，是对形态学检查和免疫组化方法的重要补充。

安徽医科大学第一附属医院皮肤性病科盛宇俊淋巴细胞表面具有与抗体或抗原特异性结合能力的一类有多个亚单位组成的糖蛋白，包括B淋巴细胞产生的IgH与IgL和T细胞产生的TCR(T细胞受体)。

两者的基因编码相似，一般由可变区(V区)、多变区(D区)、连接区(J区)及恒定区(C区)构成。

胚系状态下，这些区域在染色体上的分部是不连续的。

V、D、J、C基因从5'端到3'端呈线状排列在DNA单链上，尚有长度不等的插入序列将其分开。

当淋巴细胞发育到一定阶段，在特别的重组酶作用下，有选择地将它们连接起来(即基因重排)，才能构成一个有表达功能的基因。

淋巴细胞从母细胞分化到成熟需要经过多次基因重排。

由于V、D、J区均有多个可供选择的基因片段，使基因重排的自由度可达106~107之多。

从个体上看，每个淋巴细胞的抗原或受体基因编码均有特定的基因重排形式，即独有的基因编码结构。

如果T或B淋巴细胞在重排的某一阶段产生单克隆性增生即成为淋巴瘤。

也就是说淋巴瘤细胞克隆性增生的结果，会使其特殊的基因重排形式占一定的数量优势。

从而成为细胞克隆性的检测指标。