细胞凋亡的诱导与检测

三.实验材料：
酿酒酵母，荧光显微镜，8.8mol/L H2O2，AO/EB的PBS 溶液，酿酒酵母的培养基，DAPI溶液 台盼蓝。
四.实验步骤：
1.使用马铃薯培养基，恒温30度，在振荡的条件下培养24 个小时，再用3500rpm×10min除Hale Waihona Puke Baidu上清液，再用去离子水 洗涤，沉淀即湿菌体. 2.取上述酵母湿菌体，加入双氧水2ml，在温室下缓慢震 荡，24h后加入乙醇，温室固定10min. 3.倒掉乙醇，用PBS洗净。 4.染色： DAPI染色法：加入500ul的PBS和50ul的DAPI 的母液染色约10min，倒置显微下观察。 AO/EB染色法：取25ml上述悬浮细胞于载玻片 上，加入AO/EB混合液，再从中去10u于载玻片上，加一滴 台盼蓝，染色5-10min，盖上盖玻片，放在荧光显微镜下观 察。
细胞凋亡诱导及检测
1.概述 2.细胞凋亡的过程与机制 3.凋亡与坏死的区别 4.细胞凋亡生物学意义 5.细胞凋亡的诱导及检测
细胞凋亡
细胞凋亡是指细胞在一定的生理或 病理条件下，受内在遗传机制的控 制自动结束生命的过程。
• 概述
悉尼· 悉尼·布雷诺尔
罗伯特· 罗伯特·霍维茨
约翰· 约翰·苏尔斯顿
细胞凋亡的诱导及检测
一.实验目的： 1.了解细胞凋亡的诱导及检测方法。 2. 了解细胞凋亡的机制及生物学意 义。
二.实验原理：
细胞凋亡过程不同于坏死性死亡，其染色质断裂，细胞 核碎裂成核裂片，细胞质浓缩，细胞体积减小，细胞膜内 折，整个细胞通过起泡和发芽的方式形成一些大小不等凋 亡小体，并逐渐被细胞周围的吞噬细胞吞噬。在整个凋亡 过程中，线粒体基本保持完好，细胞的内容物没有泄露， 不会引起周围组织的炎症反应。凋亡的细胞的核DNA的断裂
2002年诺贝尔生理与医学奖获得者 2002年诺贝尔生理与医学奖获得者
apoptosis
一、细胞死亡的模式
■ ■
Necrosis = 细胞病理性死亡 Apoptosis = 细胞自发性死亡
坏死
凋亡
•凋亡的过程及机制
凋亡诱导因素 死亡信号 凋亡相关基因激活
Caspases激活、 DNase激活 激活、
Thanks!
细胞坏死
强烈刺激 成群细胞死亡 早期即丧失 增大肿胀 稀疏成网状 肿张破坏 破坏外溢 破裂成碎片 随机降解 不需要 无 引起炎症反应 病理死亡方式
一、细胞死亡的模式
■ ■
Necrosis = 细胞病理性死亡 Apoptosis = 细胞自发性死亡
坏死
凋亡
凋亡的生理学意义: 凋亡的生理学意义: ■胚胎发育期去除某些细胞 ■维持内环境稳定
•
• 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜
• 一般以细胞核染色质的形态学改变来评判细胞凋亡的进展情况。常用 的DNA特异性染料有：HO ,Hoechst 33342;HO, Hoechst 33258; DAPI。
• 电子显微镜观察
(扫描电镜) 正常细胞
(扫描电镜)
(透射电镜)
凋亡细胞—凋亡小体 凋亡细胞 凋亡小体
增殖细胞群中细胞去除、去除潜在有害的自身反应性淋巴细胞
■参与防御反应
细胞毒T 细胞毒T细胞
凋亡过多或不足→→疾病： 肿瘤、艾滋病、神经变性性疾病、缺血性损伤
细 胞 凋 亡
1、细胞凋亡的形态学检测 、
• 光学显微镜和倒置显微镜
未染色细胞：凋亡细胞V变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象， 晚期可见凋亡小体。 • 染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色、苏木精染色等。凋亡细胞的 染色质浓缩、边缘化，呈新月状附在核膜周围。
发生在核小体之间，因此产生的断裂NA在电泳时会呈180~200bp 整数倍大小的阶梯状条带，这是识别 凋亡细胞的可靠生化特征。 能诱导细胞凋亡的方法有很多，这里主要采取化学方法过氧化 （H2O2)诱导细胞凋亡。 细胞凋亡的检测方法也很多，而形态学观察方法更为方便。1.吖 啶橙只进入活细胞，正常细胞及处于凋亡早期的细胞，从而将细胞 染成绿色，而溴化乙啶（EB)只进入死细胞，凋亡的细胞核染成橙 红色。2.DAPI也是一种荧光染料它可以与DNA双螺旋凹槽部分结合， 可在紫外光下激发蓝光，也可以用于观察凋亡的细胞。
Nuclear morphological changes of HeLa cells in apoptosis process （488nm ×400）
Apoptotic HeLa cells were stained with FITC-AnnexinV + PI
六. 实验结果：
DAPI染色法：视野里有的细胞染色均匀，且表面光滑，则为正常细 胞（control),有的细胞染色 不均匀，表面不光滑，核轮廓不规则，这是凋亡前期细胞（stageⅠ), 有的细胞细胞 核固缩，染色体凝聚边缘化，这是凋亡中期细胞（stageⅡ),有的细胞 崩解，成为碎片 可以看见颗粒状得碎片，这是凋亡后期细胞（stageⅢ）。 AO/EB染色法：显微镜下有的细胞的细胞核呈绿色，为活细胞。有 的细胞细胞核为橙红色，为凋亡细胞。
七.注意事项：
1.由于荧光会发生淬灭，加入DAPI染色后要尽 量避光 操作，在显微镜下操作时，先用可见光 找到细胞再转换到紫外光，因为紫外光对荧光的 淬灭效果比可见 光强很多。 2.实验要求阴性对照，不然说明不了问题。 3.每一个步骤都要PBS溶液洗掉上一步的试剂， 避免 影响下一步。 4.EB为强染色剂，使用实应高度注意。 5.在显微镜下观察时候要操作迅速因为细胞会 变干而发生改变。
凋亡的执行
巨噬细胞吞噬分解凋亡细胞 凋亡细胞清除
细胞凋亡与细胞坏死的区别
特征
诱导因素 受累范围 膜完整性 细胞体积 染色质 细胞器 溶酶体 细胞形状 基因组DNA 基因组DNA 大分子合成 基因调控 后果 意义
细胞凋亡
生理及弱刺激 单个细胞丢失 保持到晚期 减小、 减小、固缩 凝聚成半月形 无明显变化 保持完整 形成凋亡小体 有控降解 一般需要 有 不引起炎症反应 生理死亡方式