血涂片和骨髓片的制备及瑞氏染色
血液涂片的制作与染色标准操作程序
血液涂片的制作与染色标准操作程序1 目的指导如何正确制作血液涂片与染色。
2 器材和试剂2.1器材：清洁玻片、推片。
2.2试剂：瑞氏-姬姆萨复合染色液、pH 6.4～6.8 磷酸盐缓冲液。
3 程序步骤3.1 血涂片制作取末梢血1 滴，置载玻片一端，取另一边缘光滑的推片，放在血滴前面慢慢后移，接触血滴后稍停。
血液即沿推片散开，将推片与载片保持30 ～45°角，向前平稳均匀推动推片，载片上便留下一层薄血膜。
血涂片制成后，立即在空气中挥动，使其迅速干燥，以免血细胞变形。
血膜干燥后，用铅笔在血膜的一侧写上病人姓名或编号。
3.2 血涂片染色平置玻片于染色架上，滴加染液3～5 滴，使其迅速盖满血膜，约1分钟后，滴加缓冲液5～10 滴，轻轻摇动玻片或对准血片吹气，与染液充分混合，5 ～10 分钟后用水冲去染液，待干。
4质量控制4.1 一张良好的血片，厚薄要适宜，头体尾要明显，细胞分布要均匀，膜的边缘要整齐，并留有一定的空隙。
涂片时，血滴愈大，角度愈大，推片速度愈快则血膜愈厚，反之血膜愈薄。
太薄的血膜片50 ％的白细胞集中于边缘或尾部，不利于白细胞分类。
如果血膜分布不匀，主要是推片不整齐，用力不均匀，载片不清洁所致。
4.2 血膜片的质量要求是厚薄均匀适度，低倍镜下观察全片，细胞不重叠，头尾及两侧有一定的空隙，血膜头部有明确的病人标志。
4.3 有些体积较大的特殊细胞常在血膜的尾部出现，因此蜡笔划线时应注意保存血膜尾部细胞，血膜必须充分干燥，否则在染色过程中容易脱落。
4.4 配制染料须用优质甲醇，稀释染液用缓冲液，因为缓冲液的pH 对细胞染色的影响很重要。
在偏酸性环境中正电荷增多，在偏碱性环境中负电荷增多，又因为细胞着色对氢离子浓度十分敏感。
如果染色偏碱，原是紫红色的中性颗粒则染成深蓝色，造成识别困难。
冲洗须用中性水，虽亦可用自来水（但不能保持稳定）。
4.5 对所用染液应进行预染试验，新配制的染液放置一段时间后其中的美蓝逐渐氧化成天青B ，天青B 对细胞核的着色效果比美蓝好，因此，瑞氏染液放置时间越长染色效果越好，临床上称之为成熟。
血涂片的制备、染色、观察方法、复检
04
章节 PART
血涂片的复检
血涂片的复检
血涂片复检的意义，首先是复核该复检标本的血常规报告的准确性， 其次是在观察血细胞形态时，根据所观察到的外周血细胞形态，提供给临 床有效的信息，要做到保证血常规结果的准确、不漏检、不误诊、不误导。 切实的结合临床，关注已知的患者信息，查看患者的相关检查结果，了解
靠等待自然干燥章。节 PART
血涂片的染色
4、瑞氏染色是最经典，最常用的染色法，尤其对于细胞质成分，中 性颗粒等可获得很好的染色效果，但对细胞核的着色能力略差。姬姆萨染 液对细胞核着色较好，结构更清晰，但对细胞质成分的着色能力略差。采
用瑞-姬姆萨章复节合染PA液R可T使细胞质、颗粒、胞核等均获得满意的染色效果。
患者出现的体章征节、P症A状R（T 必要时要询问临床医生），在此基础上，了解临
床医生的诊断或治疗思路，然后在显微镜下有目的地进行查找，才能做到 有百密而无一疏。
红系统细胞形态
一、正常红细胞
章节 PART
红系统细胞形态
二、红细胞大小改变
章节 PART
红系统细胞形态
三、红细胞血红蛋白含量改变
章节 PART
章节 PART
红系统细胞形态
3、卡波环
章节 PART
红系统细胞形态
4、有核红细胞
章节 PART
红系统细胞形态
5、网织红细胞：是指晚幼红细胞脱核后到完全成熟的红 细胞之间的过度细胞，分为4型。Ⅰ型：丝球形，Ⅱ型：网型， Ⅲ型：破网型，Ⅳ型：点粒型（图2-165、2-166、2-167）
红系统细胞形态
章节 PART
血涂片的制备
二、将推片接近血滴处，然后轻轻接触血滴并压在血滴上，使血滴呈”一”字型展开, 充满推片宽度(如果能做到边缘血量较少,中间血量稍多为最佳)(图1-2,图1-3).
血涂片的制备与染色-PPT课件
2）pH值的影响：血细胞多种成分属 于蛋白质，由于蛋白质系两性电解质，所 带电荷随着溶液的pH而定。因此，血细 胞染色对氢离子浓度十分敏感。
染色时常用缓冲液（pH6.4～6.8）来调节
染色时的pH值，以达到满意的染色效果（表111）。
（2）试剂
1）Wright染液： Wright染液是由伊
红和亚甲蓝溶解于甲醇而成。甲醇的作用：
床常用的方法，主要用于观察血细胞形态
及仪器法检测结果异常的复查。
（2）厚血膜涂片法：取新鲜血液1滴于载
玻片的中央，用推片的一角将血滴由内向外旋
转涂布，制成厚薄均匀、直径约1.5cm的圆形 血膜，待自然干燥后，滴加数滴蒸馏水，使红 细胞溶解，脱去血红蛋白，倾去水，血涂片干 燥后即可染色并用显微镜检查。 本方法特别适合检查疟原虫、微丝蚴等。
（2）试剂：染液放置越久，其染色
效果越好。
（3）染色：Giemsa染色法的步骤与方 法见表1-11-2。
3．Wright-Giemsa染色法 Wright-
Giemsa染色法结合了Wright染色法和Giemsa
染色法的优点。在Wright染液配方的基础上，
每1.0g Wright染料添加0.3g Giemsa染料。染
色步骤与Wright染色法相同。
【方法学评价】血涂片染色的方法学评
价见表1-12。
【质量保证】染色过深、过浅与血
涂片中细胞数量、血膜厚度、染色时间、 染液浓度、pH密切相关。Wright染色的
质量保证见表1-13。血涂片染色不佳的
原因及纠正措施见表1-14。
谢谢！
2．自动涂片法 目前有许多型号的自
动血液分析仪，配备有血涂片仪和染色仪，
可以按照检验人员的指令执行自动送片、 取血、推片、标记和染色等任务。
瑞氏染液制作血涂片
清洁液（洗液）重铬酸钾（工业品纯）300g浓硫酸（工业品纯）300ml自来水3000ml实际上重铬酸钾、硫酸和自来水之比为1：1:10。
先将重铬酸钾溶于水，如加热须待冷后，再缓慢加入浓硫酸，边加边搅。
不准将水倒入浓硫酸内！！！另外，清洁液只能用于玻璃仪器的清洗，不能浸泡金属器械。
血涂片的制备：1、载玻片及盖玻片泡酸时间大于24小时，一张一张放，保证每一张都浸湿2、冲洗，先用自来水冲净至没有颜色，再用流水冲洗一夜3、放在95%的酒精中浸泡过夜4、取出后用棉布擦干，涂片，并用甲醇固定，竖直干燥。
Wright染色法制作血涂片1、取涂好的血片，用玻璃笔划出染色区，以防染液滴落后溢流。
2、将涂片平放桌上或者架上，滴加Wright染液至恰好布满所划范围的血膜，混动使混匀，染色约3分钟。
Wright染液配法:Wright粉剂0.1g，加甲醇60毫升。
将Wright粉剂放在乳钵内，充分研磨，越细越好。
然后取甲醇逐步加入乳钵内，边加边研磨，直至染料全部溶解，置试剂瓶中密封，以后走后可用，以放置一个月后再用最佳。
3、加入等量磷酸盐缓冲液（pH6.8~7)，不断晃动，染色约12分钟，直接放与流水下冲洗。
4、染色后甩干或者直立晾干，用中性树胶或者合成树脂或香柏油封片，或不封片直接镜检。
时间：温度较低时约15分钟（染3分钟，加缓冲液不断晃动12分钟。
温度较高时，总时间约5分钟。
剂量：染液与缓冲液剂量之比为1:1如果染色不够，蒸馏水冲洗后，在按照原步骤重新染封片：干燥后的血涂片，浸入二甲苯中后在其干燥前，擦去蜡线，滴明胶与血涂片的一边（半滴至一滴），眼科镊捏住盖玻片正面在酒精灯上烘烤一下后反面贴于载玻片上。
结果：红细胞呈橘红色；中性粒细胞颗粒蓝紫色至紫红色；嗜酸性粒细胞鲜红色至橘红色；嗜碱性粒细胞颗粒深蓝紫色；淋巴细胞核深蓝紫色，胞质天蓝色；单核细胞核蓝紫色，胞质灰蓝色。
、注：①Wright染料对pH较敏感，因此用缓冲液稀释染液，可使染色作用稳定，便于识别和比较细胞的变化。
实验四血涂片的制备与染色
实验四血涂片的制备与染色【目的】掌握血涂片的制备和染色方法（preparation and staining of thin blood films）。
【原理】将一小滴血液均匀涂在玻片上，呈单层紧密分布，制成薄血片。
用含天青B和伊红的Romannowsky 类染料进行染色。
细胞中的碱性物质如RBC中的血红蛋白及嗜酸性粒细胞胞质中的嗜酸性颗粒等与酸性染料伊红结合染成红色；细胞中的酸性物质如淋巴细胞胞质及嗜碱性粒细胞质中的嗜碱性颗粒等与碱性染料亚甲蓝结合染成蓝色；中性粒细胞的中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染成淡紫红色。
【器材】1．载玻片使用前，必须仔细清洗，并用乙醇或软布清洁。
2．推片选择边缘光滑的载玻片，在两角分别作斜线标记，然后用玻璃切割刀裁去两角，制成约15mm宽度的推片。
3．吸耳球。
4．显微镜。
5．酒精灯或Bunsen灯。
6．采血针。
7．注射器和针头。
【试剂】1．瑞氏（Wright）染液（1）Ⅰ液：包含瑞氏染料1.0g、纯甲醇（AR级以上)600ml、甘油15ml。
将全部染料放入清洁干燥的乳钵中，先加少量甲醇慢慢地研磨（至少30min），以使染料充分溶解，再加一些甲醇混匀，然后将溶解的部分倒入洁净的棕色瓶内，乳钵内剩余的未溶解的染料，再加入少许甲醇细研，如此多次研磨，直至染料全部溶解，甲醇用完为止。
再加15ml甘油密闭保存。
（2）Ⅱ液：磷酸盐缓冲液（pH6.4～6.8），包含磷酸二氢钾（KH2PO4）0.3g、磷酸氢二钠（Na2HPO4）0.2g、蒸馏水加至1000ml。
配好后用磷酸盐溶液校正pH，塞紧瓶口贮存。
如无缓冲液可用新鲜蒸馏水代替。
2．吉姆萨染液包含吉姆萨染料0.75g、甘油35ml、甲醇65ml。
将吉姆萨染料、甘油和甲醇放入含玻璃珠的容器内，每天混匀3次，连续4天，最后过滤备用。
3．瑞-吉复合染液（1）I液：包含瑞氏染料1g、吉姆萨染料0.3g、甲醇500ml、中性甘油10ml。
血涂片及骨髓涂片的制片与读片
血涂片及骨髓涂片的制作与读片志强2006-3-30实验准备一．器材：载玻片：每只动物一块盖玻片：每只动物一块滴管：4个橡皮吸头：4个中号镊子：4把大剪刀：4把眼科镊：4把玻璃棒：4根烧杯：1000 ml，2个量筒：100ml、500 ml、1000 ml各一蜡笔棕色小口瓶碾钵载玻片处理：一般将载玻片先用洗衣粉水溶液煮沸20分钟，用流水冲洗，再经清洁液浸泡过夜，用流水反复冲洗，最后入95%酒精浸泡约1小时。
取出，以洁净布巾夹持玻片边缘擦干备用。
二．试剂：瑞氏染液240ml瑞氏染料粉剂0.1g纯甲醇（AR）60ml将粉剂放入洁净干燥碾钵，先加少量甲醇研磨使染料溶解，然后将已溶解的染料倒入洁净的棕色玻璃瓶，剩下未溶解的再加入少量甲醇研磨，如此反复，直至染料完全溶解为止。
新配制的染液需密封保存，室温放置1周后才能使用。
染料存放越久，染色效果越好。
磷酸盐缓冲液1%KH2PO4 30ml1%Na2HPO4 20ml加蒸馏水至800 ml，调PH值到6.5~7.0，定容至1000ml。
甲醇鸡蛋清：蒸馏水与鸡蛋清按1/1的比例稀释。
中性树胶：如果中性树胶过于粘稠，可将中性树胶与二甲苯按7/3的比例稀释。
二甲苯实验步骤一．涂片（一）血液涂片的制作（1）需载玻片2，分别称为玻片1和玻片2（推片）。
（2）用玻片1一端接约3mm直径的血滴，将此玻片1保持水平。
（3）取另一边缘平整的载玻片2（推片），将其前端放在血滴前，与片1保持30°角并稍向后移与血滴接触，即见血液沿片2（推片）下缘散开，使血液展开并充满整个推片的宽度。
（4）立刻将推片与载玻片呈30°角，边轻压推片边将血液按下图的箭头方向推动涂抹，至血液铺完血膜为止。
（5）挥动片1使血膜吹干，用蜡笔将血膜边缘圈画备染色。
（6）每只动物涂片一。
（7）一良好的血片，要求厚薄适宜，头、体、尾分明。
（8）置30min～1hr后较利于观察红细胞的形态。
注意事项：●如标本本身太短，可观察的部分会受局限，故以在离开载玻片另一端2cm地方涂抹为宜。
血涂片的制备及染色
图 １ 血涂片制备
·１６８·
２０ｍｉｎ，用热水将肥皂和血膜洗去，然后，用自来水对其反复
冲洗，擦干或烤干后备用。 取用载玻片时需用专用仪器，不
可用手接触玻片表面，以免污染玻片表面。 另外，还需对载
玻片两角作斜线标记，用剥离切割刀将载玻片两角裁去，制
成宽度约为 １５ｍｍ 的推片。
（ 二） 采血
准备好载玻片后，便可给受检者采血，可采用静脉采血
的着色效果较差。
（ 二） 姬姆萨染色法
姬姆萨染色法染色操作基本同瑞特染色法，不同的是其
采用的染料为姬姆萨染料，这是一种由天青和酸性染料伊红
组成的复合染料，可对细胞核结构和寄生虫进行良好的着
色，从而能清晰显示出这些物质的结构，但是，其对细胞质和
颗粒的着色效果较差。
（ 三） 瑞－姬染色法
瑞－姬染色法指的是将瑞氏染料与姬姆萨染料充分混
否存在血液疾病等，虽然该项检验技术在临床应用上极广，
但是，在实际检验过程中，受血涂片制备和染色不当等因素
的影响，常常会降低检验结果的准确性，从而会影响该项检
验技术的临床应用效果。 基于此，就需要检验人员掌握正确
的血涂片制备和染色方法。
一、 血涂片制备
（ 一） 载玻片和推片准备
一般需选用高纯度、耐腐蚀性强、抗水的玻璃制成的载
缘平滑的一端从血滴前方后移接触血液，使血滴沿推片边缘
展开，然后是推片与载玻片保持 ３０ ～ ４５° 夹角，平稳匀速地向
前推动，使血液沿推片散开，在载玻片上形成厚薄适宜、边缘
整齐的薄层血膜（ 边缘需留有一定的空隙） ，且还需保证血
涂片呈舌状，头体尾三部分明显，如图 １ 所示。
（ 四） 血涂片干燥
完成血涂片制备后，还需对其进行干燥处理，可采用空
实验四静脉采血血涂片的制备与染色
取血
待酒精干后，刺破皮肤，使血自然流出， 勿挤。取干净载片，让血滴在离载片一端 中4～5毫米处，注意手指 持握载片的边缘 ，勿触及其表面。不能使载片接触取血部 位的皮肤。
推片 取一块边缘光滑的载片做推片。将其一
端置于血滴前方，向后移动到接触血滴， 使血液均匀分散在推片与载片的接触处。 然后使推片与载片呈30°～40°角，向另 一端平稳地推出。涂片推好后，迅速在空 气中挥干，使之自然干燥。
标记试管
在试管上贴上标签，著名患者姓名、项目名 称、采集日期、门诊或住院号。
消毒双手
采血前，操作人员应用肥皂或消毒液和水洗手。
选择静脉
采血前，要求受检者坐在实验台前。将前臂放在 实验台上，掌心向上，并在肘下放一枕垫。卧床 受检者要求前臂申展，暴露穿刺部位。常用采血 位置是肘前静脉，因其粗大、容易辨认。
检查注射器
静脉采血前要仔细检查针头是否安装牢固， 针筒内是否有空气和水分。所用针头应锐利、光 滑、通气，针筒不漏气。抽血时针栓只能向外抽 ，不能向静脉内推，以免形成空气栓塞，造成严 重后果。
扎压脉带
采静脉血时止血带压迫时间不能过长 、绑扎不能过紧，以避免淤血和血液浓缩 ，最好不超过1min，否则会影响某些试验 结果，如造成血红蛋白和血细胞比容增高 。
醇所固定;
3、 加等量PH6.4的磷酸盐缓冲液(或等量 超纯水)轻轻晃动玻片,均匀静置5-10分钟;
4、 水洗、吸干、镜检。
血涂片染色
涂片干燥后加瑞氏染色Ⅰ液5-8滴 覆盖整个血膜1分钟
勿冲洗再加瑞氏染色Ⅱ液5-8滴后将Ⅰ液和 Ⅱ液充分混匀静置10分钟
直接流水冲洗3-5分钟 （切勿先倒掉染液）
血涂片的制备和瑞氏染色
5、实验员作好有关实验记录。
前期准备
↓
采血
↓
干燥
↓
标记
↓
染色
↓
冲洗
↓
观察结果
↓
后期分析处理
6、冲洗：1分钟后，用流水冲去染液，待干。
7、观察结果：将干燥后的血涂片置显微镜下观察。用低倍镜观察血涂片体尾交界处的血细胞。
四、后期分析处理。
1、学生填写实验报告。
2、各组实验结果是否满意，分析造成偏差的原因。
3、器材由各组学生清洗完毕，实验员清点数目后放回准备室，打扫卫生，打扫完毕关闭门窗水电。
2、推片：左手平执载波片，右手持推片从后方或前方接近血滴，使血液沿推片边缘展开成适当的宽度，立即将推片与载波片呈30度到45度角，轻压推片边缘将血液推制成厚薄适宜的血涂片，血涂片应呈舌、头、尾三部分。
3、干燥：将推好的血涂片在空气中晃动，使其迅速干燥。
4、标记：在载玻片的一端用记号笔编号。
5、染色：待血涂片干透后，将波片平置，滴加快速瑞氏染液数滴，使其快速盖满血涂片，
血涂片的制备和瑞氏染色
操作规程
操作流程
一、实验目的：
掌握血涂片的制备和染ห้องสมุดไป่ตู้的方法。
二、前期准备
1、抗凝血和快速瑞氏染液
2、学生分组（每二人一组）分放器材。毛细管、瑞氏染液、载波片、推片、纱布块、显微镜。
3、实验题目内容，操作步骤在黑板上写明。
三、步骤
1、采血：用微量吸管在距载玻片一端1cm处加1滴抗凝血。
血涂片制作与染色
血涂片制作与染色1.血涂片的制备血涂片的制备需要用到标本采集工具如无菌化的注射器、针头、试管、硅化玻璃片以及一些实验室试剂如无菌生理盐水、巴氏溶液和电解溶液等。
具体步骤如下：（1）将患者指尖的表面清洁卫生。
（2）选择一个适合的静脉穿刺点，通常是患者的中指或无名指。
（3）用酒精棉球清洁穿刺点，使其干燥。
（4）将无菌化的注射器连接到无菌生理盐水的瓶口上，并抽取一定量的生理盐水。
（5）将针头插入穿刺点后，将生理盐水匀速注射入患者的静脉内。
（6）在生理盐水滴入试管的同时，用眼微观检查，如果有血液进入注射器和管道内，即可采集。
宜用自来水洗净试管外表面，先不带盖座放倾空液。
（7）用试管夹夹住注射针，将针头推入试管内，然后轻轻射入试管底部液面下，同时向上抽手，保持抽液缓慢，可避免气泡产生。
（8）将采集到的血液缓缓带走，同时注入试管内，让其与100ml巴氏溶液进行搅拌。
（9）将混合液倾入瓷漏斗中，从中取出干燥了的血细胞。
2.血涂片的染色血涂片染色可使用湿涂片法或干涂片法，其中湿涂片法应用更广泛。
下文将以湿涂片法为例进行介绍。
（1）取一根硅化玻璃片，用纸巾或棉球擦拭干净。
（2）用血涂片染色钳将准备好的血涂片床放在玻璃片上。
（3）将一滴适量的Wright液倒在血涂片的中段。
Wright液包含了染色剂和辅助剂，其中主要成分是吡啶基甲重氮盐和三氧二氮菲盐。
（4）用另一根玻璃片的尾部将液滴均匀地扩开，并迅速在血涂片上来回涂抹，在染液与血涂片上充分接触并混合。
（5）保持血涂片在室温下静置5-10分钟，以促进染色反应的进行。
（6）用蒸馏水冲洗玻璃片上的染料，并将其晾干。
3.血涂片的观察与分析观察血涂片需用光学显微镜，常规放大倍数为1000倍。
观察血涂片时，应注意血细胞的形态、大小、核形态、细胞质染色情况及相关细胞间的比例等。
根据各种细胞的数量和比例，可以初步评估出是否存在异常细胞，及其可能的病理性质，如感染、贫血等。
总结：血涂片制作与染色是血液检查中重要的步骤之一，它能够帮助医生判断病情，制定治疗方案。
血涂片的制备与染色
血小板
染色结果
血小板呈淡蓝色或蓝紫色，染色质呈 颗粒状或块状。
观察指标
观察血小板数量、形态、大小等，判 断是否存在血小板减少症、血小板增 多症等。
04 染色注意事项
CHAPTER
染色时间
染色时间过短
染色时间适中
染色效果不佳，细胞结构不清晰，颜 色偏淡。
染色效果良好，细胞结构清晰，颜色 适中，便于观察。
染色温度过低
染色效果不佳，细胞结构不清晰，颜色偏淡。
染色温度适中
染色效果良好，细胞核和细胞质对比度明显，易 于观察。
05 染色问题处理
CHAPTER
染色过深或过浅
染色过深
可能是由于染色时间过长或染色液浓 度过高所致。为避免这一问题，应严 格控制染色时间和染色液的浓度，确 保染色过程的一致性。
染色过浅
详细描述
瑞氏染色法使用瑞氏染料和伊红染料进行染色，能够使细胞核呈紫红色，细胞 质呈粉红色，便于观察和鉴别细胞的形态和结构。该方法具有染色鲜艳、对比 度高的优点，适用于多种血细胞染色。
姬姆萨染色法
总结词
姬姆萨染色法是一种特殊的血涂片染色方法，能够更好地显示出细胞的内部结构 和核仁。
详细描述
姬姆萨染色法使用姬姆萨染料进行染色，能够使细胞核呈蓝色或深紫色，细胞质 呈浅红色或粉红色，便于观察细胞的内部结构和核仁。该方法具有较高的染色敏 感性和特异性，适用于鉴别异常细胞和病原体。
采血量
采集适量血液，一般为 20-50微升，根据实验需 求而定。
推片
载玻片
选择清洁、无划痕的载玻片，用 纱布擦拭干净。
推片方法
将血液滴在载玻片的一端，用边缘 平滑的推片从血滴一侧轻轻推动， 使血液均匀展开成一层薄膜。
血涂片制备和染色
（二）姬姆萨染色法
[原理]
吉姆萨染液由天青，伊红组成。染色原理和结 果 与瑞特染色法基本相同。但本法对细胞核和寄生虫着 色较好，结构显示更清晰，而胞质和中性颗粒则着色 较差。
[试剂]
吉姆萨染料 甘油 甲醇（AR）
1.0g 66.0ml
66.0ml
[染色方法] 1. 甲醇固定干燥血膜3-5min 2. 将血膜在染液中浸染10-30min 3. 流水冲洗,待干后镜检
该法计数误差较大，费时、费力，已不能适应大批量 标本的测定，将逐渐被血细胞分析仪所取代。
Xingyue
【试剂】 各种不同的专用稀释液或染色稀释液。 【器材】 （1） 显微镜 （2） 微量吸管：Hb吸管：10、20μl两刻度
★毛细玻璃吸管：10、20μl两刻度 一人一管，定期用水银称重法进行校正 误差应< ±1% （3）计数板：血细胞计数板，常用改良Neubauer计数板
图1-4 瑞氏染色原理示意图
[PH对细胞染色有影响]
细胞各种成分均为蛋白质，由于蛋白质系两性电 解质，所带电荷随溶液PH而定，在偏酸性环境中正电 荷增多，易与伊红结合，染色偏红；在偏碱性环境中 负电荷增多，易与美蓝或天青结合，染色偏蓝。因此 细胞染色对氢离子浓度十分敏感，染色用玻片必须清 洁，无酸碱污染。配制瑞氏染液必须用优质甲醇，稀 释染色必须用缓冲液，冲洗用水应近中性，否则可导 致各种细胞染色反应异常，以致识别困难，甚至造成 错误。
血液一般检验 主讲人:李学民
复习 血液标本采集和抗凝剂选择
血标本：
全血：血细胞+血浆;临床血液学检查，血细胞计数、分类和形态 学检查
血浆：全血除去血细胞；血浆病理性和生理性化学成分的测定， 内分泌激素、凝血因子（钙除外）、血栓和止血检查
血涂片的制备与染色(29)
血涂片的制备
◈ 制备合格的血涂片，是血液学检查的最基本的技 术和方法， ◈ 血片的质量及染色的好坏，直接影响到细胞形 态的观察、和诊断。
（一） 载玻片的清洁
1. 新玻片：常带有游离碱质，用1mol/L HCl 浸泡24h， 清水冲净，干燥备用。
2. 用过的玻片：肥皂（洗涤剂）水煮沸20 min，再用 热水将肥皂和血膜洗净，清水反复冲洗，干燥备用。
3. 自动推片机法
标准化 自动化 智能化
第四部分 血细胞常用的染色方法
细胞染色技术
细胞涂片，在光学显微镜观察之前需要固定、染色。
固定：将细胞蛋白质和多糖等成分迅速交联和凝固，
以保持细胞原有的形态结构不发生变化。
染色目的：使细胞的主要结构（细胞质、细胞核、
细胞器等）染上不同的颜色，便于显微镜下观察。
Hale Waihona Puke 碱性美蓝结合，偏碱：出现异常蓝染。 ⓑ PH<PI: 酸性环境，蛋白质分子带正电荷多，易与酸
性伊红结合，因此偏酸：氢离子较多，降低对碱性染料 的亲和力，增强伊红着色，出现异常红染。
最佳PH：6.4～6.8，应使用缓冲液。
同时使用优质甲醇（AR）和清洁的中性玻片。
【染色方法】
以血涂片为例 ① 血膜干后，在两端用蜡笔化线，平放在染
色架上； ② 加染液数滴，固定1min； ③ 加等量或稍多的缓冲液，与染液充分混匀，
有一定的空隙（0.3cm和1.5cm），血膜长度
占载玻片的2/3左右。玻片的一端应留有贴标
签的地方。
0.3cm
临
沂 市
1.5cm
人
民
医
院
制血膜
白细胞显微镜分类
瑞氏染色
骨髓涂片瑞氏染色步骤
骨髓涂片瑞氏染色步骤
骨髓涂片瑞氏染色步骤如下:
1. 采集骨髓涂片:通常使用新鲜骨髓或骨髓提取物制备涂片。
在采集过程中,需要使用一次性手套和消毒工具,确保不会对样本造成污染。
2. 处理骨髓涂片:将骨髓涂片放入含有酒精的消毒溶液中浸泡,以去除表面的细胞和血小板。
然后,将涂片放入含有单克隆抗体的溶液中浸泡,以识别不同的细胞类型和生物标记。
3. 标记细胞:使用标记抗体将骨髓涂片上的细胞类型进行分类。
常用的标记包括CD3、CD4、CD8、CD10、CD19、CD30、CD45、CD133、B220等。
在采集骨髓涂片之前,需要使用标记抗体进行预处理,以确保涂片上有足够的细胞类型。
4. 染色:将骨髓涂片与瑞氏染色液混合,并轻轻地涂抹在涂片上。
染色后,涂片会被染成红色或深红色,以显示不同的细胞类型。
常用的瑞氏染色液包括瑞氏试剂盒和瑞氏试剂管。
5. 分析细胞类型:将染色后的骨髓涂片放入显微镜下观察,以确定细胞类型。
可以使用光学显微镜或电子显微镜进行观察和分析。
骨髓涂片是一种常用的细胞学检测方法,可以用于诊断多种血液疾病和其他疾病。
通过使用瑞氏染色步骤,可以识别不同的细胞类型,帮助医生确定病情和制定治疗方案。
血涂片制备
1、血涂片制备将一滴血液滴在干净的载玻片上，用另一张载玻片边缘与其接触，呈30°角拉回与血液接触。
当血液蔓延至接近玻片的宽度时，将玻片平稳快速地向前推出。
将玻片在空中轻轻会动，快速风干。
2、血涂片染色采用瑞氏染色法。
本法的特点是将固定和染色合并在一起进行，手续简便，染色时间短，对白细胞特异性颗粒着色较好，但对核的着色略差。
瑞氏染料是由酸性染料伊红（使细胞的碱性成分染成红色，如血红蛋白和嗜酸性颗粒）和碱性染料亚甲蓝（使细胞的酸性成分染成蓝色，如白细胞）组成的复合染料。
（1）用蜡笔在血膜两头划线，以防染液溢出，然后将血膜平放在染色架上。
(2)用瑞氏染液3～5滴覆盖整个血膜，固定细胞0.5～1分钟。
(3)滴加等量或稍多的缓冲液（pH6.4～6.8的磷酸盐缓冲液，其作用是使染色环境维持在弱酸性，达到最佳的染色效果），用吸球将其与染液吸匀，或者摇动玻片染色5～10分钟。
(4)慢慢摇动玻片，然后用流动水从玻片的一侧冲去染液，待血片自然干燥后(或用滤纸吸干)，即可镜检。
3、染色效果正常情况：血膜外观呈淡粉红色或琥珀色。
显微镜下，成熟红细胞呈粉红色。
白细胞胞质中颗粒清楚，并显示出各种细胞特有的色彩，细胞核染紫红色，核染色质结构清楚。
附：瑞氏染液配制：瑞氏染料 830gm或1g甲醇（AR） 500ml或600ml1）先称干燥（事先放入温箱干燥过夜）瑞氏染料放置乳钵内，用乳棒轻轻敲碎染料成粉末，再行研磨至听不到研芝麻声即呈细粉末，加少许甘油或甲醇溶解研磨，使染料在乳缸内显“一面镜”光泽，而无染料粉粒沉着。
2）再加较多量甲醇研磨呈一面镜光亮，静置片刻，将上层液体倒入一清洁储存瓶内（最好用甲醇空瓶），再加甲醇研磨，重复数次，至乳钵内染料及甲醇用完为止，摇匀，密封瓶口。
3）存室温暗处，储存愈久，则染料溶解、分解就越好，一般储存3个月以上为佳。
骨髓涂片检查方法及报告内容
骨髓涂片检查方法及报告内容（1）骨髓涂片制作、染色方法1）制片骨髓涂片制作方法与血片制作方法基本相同，但因有骨髓小粒和脂肪滴，有核细胞较多，因此较血液黏稠，推片略难于血片，推片时角度要小一些，速度要慢一些，避免骨髓片过厚。
2）染色临床常用的染色方法主要有：①瑞氏(Wright)染色②吉姆萨(Giemsa)染色③Marshall提出的标准化的Romanowsky染色④R-G(Romanowsky- Giemsa)染色⑤wittekind1987年介绍的R-G染色（2）骨髓片检查的程序及方法1）检查步骤[骨髓涂片检查]①低倍镜Ⅰ.观察取材、涂片、染色是否满意等。
Ⅱ.判断有核细胞增生程度低倍镜下选择细胞分布均匀部位观察骨髓片有核细胞增生情况，根据骨髓片中有核细胞的密度或有核细胞与成熟红细胞的比例来估计有核细胞的增生程度。
骨髓有核细胞增生程度通常分为五级，如表2-1。
表2-1骨髓有核细胞增生程度五级估计标准增生程度成熟红细胞：有核细胞有核细胞均数（高倍镜视常见病例野）增生极度活跃1：1＞100各种白血病增生明显活跃10：150-100各种白血病、增生性贫血增生活跃20：120-50正常骨髓象、某些贫血增生减低50：15-10造血功能低下增生极度减低200：1<5再生障碍性贫血Ⅲ.观察全片巨核细胞的数量巨核细胞数量变化较大，如将骨髓膜标准化为×，则参考值为7-35个。
Ⅳ.观察骨髓片边缘和尾部有无体积较大的或成堆的特殊病理细胞。
②油镜分类计数200或500个有核细胞（不包括分裂型细胞和破碎细胞）。
按各细胞的种类、发育阶段分别记录，并计算出百分比。
同时仔细观察各系、各阶段细胞的形态是否正常。
[血涂片检查]分类记数100-200个白细胞，计算各类白细胞的百分率，描述红细胞形态，血小板数量和分布情况。
如见到幼红细胞按分类100个白细胞中幼红细胞的数量来报告，并说明其阶段性。
（3）骨髓报告1）结果计算计算出各系和各阶段细胞占有核细胞总数的百分数；再算出各阶段粒细胞百分数的总和与各阶段幼红细胞百分数之总和，将前者除以后者即得出粒：红比值（G:E）。
血片、骨髓片制备
血片、骨髓片制备血片、骨髓片标本制备中，有直接检查法与许多细胞化学检查法，通过辨认细胞形态特征并结合临床资料，一般可做出正确诊断。
为了达到这一目的，首先应做好血涂片、骨髓涂片和端氏染色，这是成功的关键。
一、准备工作：（一）清洁玻片：玻片须边缘光滑，十分清洁干燥，不带有油质，新玻片要先浸在清洁液（重铬酸钾2份，硫酸3份，水25份）内，除去游离碱质（否则染色偏碱，不适于观察），用自来水冲洗，再浸在70％酒精内，用时取出，并在火焰高处烘干。
旧的玻片要先用肥皂水煮10余分钟后，再用温水冲洗干净。
边缘玻碎、玻面有划痕的不能再用。
因手上带有油渍，在取用玻片时只可用两手指挟住玻片的两边，不可触及玻面。
（二）推片：推片推端要光滑（常用凹玻片做推片）并将其中锐角用镊子掰掉lmm左右（既宽度较载片窄2~3mm），在油石上平磨光滑。
因异常细胞如瘤细胞等，体积大比重轻，只在涂片边缘尾端才易找到，如涂膜宽至边缘，容易漏诊。
二、制片方法：用推片蘸取骨髓液或血液少许（若看上去很浓，蘸量要少；如果稀薄，可多蘸些），置于载物玻片右端1／3处（右端空白处留贴标签），放直径1~2mm大小的血液或骨髓液一滴，使推片和此滴血液或骨髓液接触，当血液或骨髓液扩散成一均匀的粗线（亦可来回或左右移动推片，使之成为一粗线）。
然后使推片与载玻片成30~45°角（骨髓液较浓时，角度要小，推的速度要慢；骨髓液较稀时，角度应大，推速要快），自右向左，均匀地向前推，直至玻片的尾部，尾部应结束在载玻片左侧1／6处。
上述制作过程应尽快完成，否则骨髓液凝固，将影响标本质量。
三、注意事项：（一）玻片：玻片洁净，手指不能触及玻片面，将玻片一张一张地摆开，准备5张以上。
（二）推片：如置于载片上的血滴液或骨髓液滴较小，应推得较慢，且成＜30°角时涂片较薄；如血滴或骨髓滴较大，应推得较快，且成＞30°角时涂片较厚。
推时要注意用力均匀，动作不快不慢，不可复推。
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一、目的
掌握血涂片、骨髓涂片的制作及染色技术。 鉴别外周血中各种白细胞的形态特点及分 类计数方法。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
二、原理
瑞氏染液是由伊红美兰所组成的复合物， 经物理吸附及化学作用对细胞进行染色。
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三、材料
与叶之间有细丝状相连或完全断开，核 染色质浓集或呈小块状，染深紫红色。 胞质丰富，呈淡红色，布满细小紫红色 的中性颗粒。
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嗜酸粒细胞
嗜酸粒细胞胞体直径11－16um， 胞核多分为近似对称的两叶。 胞质中充密集粗大、大小均匀的桔红色嗜酸
• 圆形或不规则形，直径12-20um，边缘常见伪足 突出。
• 胞核形状不规则，常呈肾形、马蹄形、笔架形、 “S”形等，并有明显扭曲折叠。染色质疏松细致， 呈淡紫红色丝网状。
• 胞质丰富，呈淡灰蓝色或淡粉红色，可见多数细 小、分布均匀、细尘样淡紫红色颗粒。
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⒉ 蘸取骨髓适量（选择骨髓小粒部分），以 30~45度角，用力推开，速度适宜。然后将玻片于 空中挥动，使之干燥，以免细胞缩小或细胞皱缩。
⒊ 骨髓片制备好后，用标记笔在膜的头部注明病 人的姓名、取材部位及穿刺部位。
五、结果 资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
杆状核粒细胞 (Stab Granulocyte)
细胞呈圆形，直径10－15um。 胞核狭长，弯曲呈带状，两端钝圆。核染色质
粗糙呈块状，染深紫红色。 胞质中含特异性颗粒的不同，也可分为中性、
嗜酸性、嗜碱性杆状核粒细胞三种，颗粒特点 同中幼粒细胞。
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中性分叶核细胞
细胞呈圆形，直径10－15um。 胞核常分为2－5叶，以分3叶者多见，叶
性颗粒。
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嗜碱性粒细胞
嗜碱性粒细胞胞体直径10-12um 胞核分叶不明显，或融合呈堆集状。 胞质中有稀疏的大小不一、分布不均、呈紫
黑色的嗜碱性颗粒，颗粒常掩盖在核上，致 使核的轮廓和结构模糊不清。
血 小板
直径2-5um ，约为成熟红细胞的1/4--3/4， 类圆形，星形与不规则形，淡红色，无核。
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成熟红细胞
正常形态呈双凹盘形，直径7.5um，瑞氏染色为 红色中心稍淡染
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• 呈圆形或椭圆形，直径6-10um • 胞核圆形或椭圆形，或有切迹，核着边，染色质
粗糙致密，呈大块状，染深紫红色。 • 胞质量极少，仅在核的一侧见到少量淡蓝色胞质，
有时几乎不见而似裸核，一般无颗粒。
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单核细胞 资料仅供参考,不当之处，请联系改正。 (Monocyte)
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大淋巴细胞
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呈圆形，直径13-18um。
胞核圆形或椭圆形，偏于一侧或着边。染 色质常质密呈块状，排列均匀，深染呈深 紫红色。
胞质丰富，呈透明天蓝色，可有少量大而 稀疏的嗜天青颗粒。
• 小淋巴细胞
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⒉ 待血片干后，滴加瑞氏染液数滴（盖住血膜）， 静置40 秒，加缓冲液等量混匀，染10~20分钟， 用水冲洗，干燥后镜检。
⒊ 镜检计数：在血膜头尾交界处，计数100个白 细胞，并对其进行分类。
㈡
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骨髓片的制备
⒈ 将临床医生所取骨髓至玻片高端（在准备涂片 时，将两玻片倾斜放置），使过多血液流下。
血针、玻片、酒精棉光学显微镜、香柏油、 二甲苯、一次性采血针
四、方法
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㈠ 血涂片的制作
⒈ 采血：每组两个同学，练习耳垂采血（包括消 毒、扎针、挤压、取血），用推片取血液一滴， 于玻片右端，从其右侧接触血液，使之成40度角， 均匀平稳地向左侧推进，，至血滴推尽为止，其 厚度要适中，且有头体尾之分。