血涂片的制备及染色

血涂片的制备及染色摘要血涂片是世界上使用最广泛的实验室检测方法之一，应用于疾病的筛查，发现，诊断以及监控。

本文提供了在临床检验中制备及染色出优质血涂片的一种参考。

虽然在如何人工制备血涂片上仍存在某些“工艺”，但是已尽可能采用了客观标准使得临床实验室能准备和染色出优质血片。

本参考中包含固定和染色手工工艺中的问题解决方法。

关键词：血涂片制备，染色前言血涂片是世界上使用最广泛和最频繁的检测方法之一，但似乎没有关于血涂片制备要求，程序及潜在问题等的综合性文献。

虽然血涂片的制备是个简单的过程，但作为一种检测方法，有很多因素可导致检测失败或比其预期低效。

本文应国际血液学标准化委员会的请求所写，并作为实验室血细胞计数板的指导方针。

本文旨在提供临床检验中用于形态评价的血涂片制备及其染色的指导和标准化。

显微镜分析过程和解释不在本文的范围内。

列举的方法中包括最先进的技术以及发展中国家实验室的适用方法。

发展中国家不具备最高水平的指标，但应在所有条件下可达到其规定的指标，以确保诊断测试的质量，以免降低病人护理。

这点尤其重要，因为无论对于病例发现，诊断或疾病监测，血涂片显微镜分析所得数据通常在临床情况中起最终和决定性的作用。

为了方便参考使用，本文采用一种特殊的格式来描述涉及血涂片制备和染色的各个步骤。

血涂片制备载玻片载玻片应由最高纯度的耐腐蚀玻璃制成；通常不可接受其他材料如塑料。

典型玻片为75×25mm，约有1mm厚度，必须平整，无扭曲和波痕，而且必须澄清无色（“水白，无色透明”）。

荧光显微镜检测必须使用无自发荧光的玻片。

最好使用预洗过的载玻片，但至少实验室必须确保载玻片无划痕，干净无尘、绒线，油脂（指纹），而且必须干燥。

这就意味着在潮湿环境中，载玻片必须能抗水。

在所处密闭容器开启后，载玻片必须保存于干燥器或装有无水（甲基）乙醇或乙醇与丙酮混合液（3:1）的容器内直至被使用。

载玻片需一直保存于密闭容器中，只能在立即使用前开启。

载玻片可以是平面的或有磨砂或涂层面以供书写。

与有直角边缘的载玻片相比，圆边或有破口的载玻片使用上更安全，降低了皮肤和手套割破或刺破的几率。

载玻片的清洗脏的载玻片需浸透在60℃的清洁剂中清洗15-20分钟，然后用热水冲洗并干燥。

新载玻片需置于重铬酸钾洗涤液中（20g Cr2K2O7溶于100mL水并加入900mL浓硫酸）48小时。

之后用流动自来水彻底冲洗。

载玻片应保存于95%甲醇中，使用前小心擦拭干净并干燥。

血涂片制备方法典型的血涂片制备方法是：人工（楔入，盖玻片），半自动（楔入，旋转），以及自动（楔入）。

楔入法（“推”）人工、半自动及自动化环境中常用此法。

若正确使用楔入法，可有足够大的区域供显微镜检测使用：这种区域中所有的细胞彼此几乎不接触或分离（单层部分）。

对于显微镜检查来说，涂片上距推动起始处最远的部分会很薄（导致产生形态改变），然而距推动起始处邻近的部分会很厚。

自动化装置能够制得优质的血涂片，比通过人工方法得到的血涂片相比更具一致性。

楔入法制备的主要问题是不同类型细胞的不均匀分布。

特别是单核细胞（以及其他大的白细胞）被推向铺展膜（“羽状”边缘）底部以及两侧。

与以单克隆抗体为基础的流式细胞术分类计数仪相比，上述情况将导致单核细胞数被低估5%-10%（正常个体经显微镜检测的比例计算常限上限为11%，非10%）。

盖玻片法（“拉”）小型盖玻片不能被恰当地标记，应避免使用。

此外与楔入法相比，本技术自身存在更高的生物危害风险。

这种方法被认为是过时淘汰的，不应使用。

旋式血涂片此法可谓是楔入法的替代方法。

经离心力大面积摊开血细胞后，单层血细胞可供显微镜检测。

虽然需注意避免污迹细胞的形成，但制备正确的旋式血涂片中所有类型的细胞形态通常是极好的。

建议使用经生理盐水稀释后的血液，但出色的准备工作一般都离不开这一步。

没有证据表明旋式血涂片制备会导致细胞类型的不均匀分布。

过去的旋转离心机在所有实验室仪器中最具危险性，因为可形成小滴和气溶胶以及机器内部的血液污染。

最近研制出的旋转离心机已能克服上述问题并且可安全使用。

对于旋转离心机来说，为了获得一致的单层，采用精确正好的血量是至关重要的。

因此，建议使用微量移液管滴涂血液，而不是毛细管。

血液样本的类型血液样本的两种类型为静脉血（抗凝）和毛细血管血，毛细血管血是由毛细血管采血法（非抗凝）得到。

已有些关于样品采集使用及操作设备的标准化文献发表，读者可以参考这些文本细节。

抗凝可使用的抗凝剂是K2EDTA或K3EDTA，柠檬酸钠以及枸橼酸盐葡萄糖（ACD：储血稳定剂）。

不建议使用肝素，因易发生血小板凝聚，进而干扰血小板形态解释和血小板计数的估测。

肝素也会导致染色涂片上紫色/蓝色色调的变化。

样品保存影响血样应在采集后尽可能快速地进行处理。

随着保存时间的延长以及时间和温度的影响，样品会发生较大的形态改变。

为了获得最佳实验结果，血涂片应在血样采集后两小时内就制备好。

保存温度如下：短期（＜8小时），4℃较好，但室温下保存也可；长期，4℃。

通常在长期保存后需经至少10次完全（180°）倒置混合血样。

毛细管推荐使用塑料（聚苯乙烯或类似物）管（不易破损）把血滴滴至于载玻片上。

应避免使用玻璃管，因为有破损的可能，这会导致生物危害。

毛细管应光滑平整，不含肝素。

可以选择使用专门为制备血涂片设计的血液容器螺旋帽打孔装置。

血量滴加的血量应使楔入法制得的血涂片拥有合适的厚度，长度在 cm。

使用旋转离心机时，应使用微量移液管以确保单层细胞的均一性。

对于典型的旋式涂片，30μL 血量能制得足够大的单层细胞，但是不同的血量需用不同的离心机。

血滴位置血滴的位置应距载玻片末端大约1cm （与标记端相反）。

或者选择距标签（或载玻片磨砂部分）1cm处。

确定离心机中的位置时应按照制造商的说明。

涂布器理想情况下，为了降低分配作用，涂布器应比载玻片略窄。

实际上，经常使用另一载玻片充当涂布器。

充当涂布器的载玻片应有圆滑边缘或坡口，这使得载玻片的展宽比实际的载玻片宽度窄。

涂布器使用后应丢弃或者在重新使用前彻底清洗并干燥。

涂布器的边缘应总是平滑，以确保血涂片整宽的厚度均匀一致。

在涂布器边缘若有先前样本的血细胞将导致血细胞明显移行到相邻血涂片中，包括红细胞中的疟原虫以及白血病白细胞。

涂布器提取血样当血滴置于载玻片时，涂布器应以相对血滴大约30°-45°角缓慢向后移动。

血滴应沿着涂布器边缘快速铺展。

一旦血滴沿着整个边缘铺展，涂布器就应成45°角并以稳定的相对较快的速率向前移动，直到全部血液铺展成膜。

制备贫血患者的血涂片时，涂布器应保持更加垂直，一边制得较厚的涂片。

铺展/旋转速度血液在载玻片上铺展愈快，涂片愈厚。

为了获得一致和合格的结果，需要一定的训练和经验。

众所周知的是，某些样本很难由楔入法制备血涂片，例如新生儿的血样。

对于旋式载玻片，离心速度和次数可从制造商处获知。

血涂片厚度血滴的大小，病人的血红蛋白水平，涂布器的角度（角度愈大，血涂片愈厚愈短）以及铺展速度会影响血涂片的厚度。

血涂片的干燥一般无强制空气循环下就足以晾干。

在潮湿环境中，建议在采取适当的预防措施下进行强迫通风干燥，以防止气溶胶的形成。

当采用强制干燥时，建议在配有高效微粒空气（HEPA）过滤器的生物危害罩中进行。

制造伪像常见的伪像通常是由欠佳的涂布技术，潮湿环境中的缓慢干燥，固定不充分或迟缓以及固定液含水造成的。

不干燥的载玻片造成血涂片铺展欠佳或不规则，通常伴有较差的形态。

某些细胞类型会在涂片制备时被轻易破环。

特定条件包括大量的非典型淋巴球，慢性淋巴细胞白血病（CLL），以及急性白血病。

有时这些破裂的细胞（“污迹”细胞）可通过在血涂片制备前添加白蛋白来避免。

缓慢干燥导致细胞收缩，然而当甲醇固定液中水含量超过3%时就会造成明显的形态伪影，例如细胞形态的脆性降低（尤其是红细胞和细胞核）以及假液泡的形成。

退行性病变，例如单核细胞、中性粒（白）细胞的细胞质液泡化，核分叶或者有核细胞分裂以及凋亡通与其说是制备造成的，而不如说是由样品长期保存或保存不当造成的。

可能的干扰影响血涂片制备和质量的病情有：贫血、红血球增多症,脐带血，血小板凝集，冷凝集素，严重的溶血性贫血中的抗红细胞抗体，严重的红细胞叠连以及新生儿的血样。

用于疟疾检测的血涂片制备公认的是通过血涂片中（厚或薄）的疟原虫形态识别不是检测疟疾最灵敏的方法。

分子生物学方法更具灵敏性，但也很昂贵。

因此，在今后有一段时间，疟疾的形态识别法会在很多实验室中存在并成为发现和监测疟疾的主要方法。

薄或厚血涂片都可用于疟原虫的形态检测。

用厚涂片识别疟疾比薄涂片灵敏10倍左右，但厚涂片中疟原虫类型的实际识别很难进行。

对于厚血涂片的制备，小血滴置于玻璃载玻片上，铺展至比起始表面大约四面积倍。

充分干燥后，最好在50℃-60℃下操作，时间控制在7-10分钟，载玻片可以染色。

若干燥不充分，细胞会被洗掉。

两种染色程序：常规血涂片在30秒内快速染色，姬姆萨染色用于厚滴制备，大约需30分钟。

有一种厚滴制备的替代方法，即经皂素的血细胞溶菌作用后离心分离除去杂质。

网织红细胞制备抗凝血必须首先在体外活体染料中温育，网织红细胞中的RNA（主要是核糖体）被染色，这将导致RNA聚集成形态上典型的深蓝色网状（网状组织）和粒斑。

染色液和血液在试管中等分混合，室温下温育15分钟。

10次完全倒置再混合后，在显微镜分析之前，至少制备出2张风干的血涂片。

固定/染色为了获得最理想的结果，应在血涂片完全风干后迅速固定并染色。

建议在染色前对血涂片进行固定，但许多实验室有在血涂片完全风干后就立即染色的习惯。

这一过程经常产生不合格的结果。

然而如果载玻片不能立即染色，那么在甲醇中固定4小时就变得很重要了，但是这一过程最好在风干1小时后；否则的话，血浆会产生灰/蓝背景影响。

染色剂和固定液必须尽可能无水（＜3%），以防形态伪像。

若进行人工染色操作，建议将载玻片沉浸于装有试剂（科普林氏缸）的广口瓶中而不是用染色剂覆盖载玻片，因为蒸发后可能会形成沉淀。

若在极热环境下进行染色，必须防止染色过程中的蒸发，例如在一密闭广口瓶或密闭有盖培养皿中进行染色。

自动化染色装置拥有其自己特定的染色程序，此程序由制造商提供。

使用者可以修改这些程序来满足细胞染色的要求。

不同实验室间的染色方案不同，不存在被普遍接受的常规染色方法或结果。

染色和染色结果的指导方针能在血液学和实验室指南和教科书中找到。

国际血液学标准化委员会（ICSH）已经发布了一种基于纯天青B和曙红Y染色剂的血涂片“参考”染色方法。

判断染色血涂片质量的一种通则是实验室必须确保血涂片中所有细胞类型可通过染色过程被可靠识别。

此规则同样适用于人工和自动化的方法。

血涂片通常由罗氏染料（含有各种噻嗪类和曙红）染色。