血涂片的制备

实验二血涂片的制备

Preparation of Blood Smear

实验原理

使用推片将血液在载玻片制成血膜。

试剂器材

载玻片（清洁、干燥、无尘、无油脂、25cm×75cm，厚度0.8mm~1.2mm）、推片。

操作步骤

（1）采血静脉采血后，使用玻璃棒、毛细管、注射针头等在距载玻片一端1cm处加1滴（约0.05ml）抗凝血，如果使用手指采血则直接用洁净玻片蘸 1 滴血。

（2）推片左手平执载玻片，或放在类似桌子等平

坦地方，右手持推片从后方或前方接近血滴，使血液沿

推片边缘展开成适当的宽度，立即将推片与载玻片呈

30。~45。角，轻压推片边缘将血液推制成厚薄适宜的血

涂片（图1-6），血涂片应呈舌状，头、体、尾清晰可见。

（3）干燥将推好的血涂片在空气中晃动，使其迅

速干燥。天气寒冷或潮湿时，应于37 ℃温箱中保温促

干，以免细胞变形缩小。

图1-6 推片（4）标记在载玻片的一端用记号笔编号。

注意事项

1．要制备良好的血细胞涂片，玻片必须干净。新购置的载玻片常带有游离碱质，必须用约1mol/L HCl浸泡24h后，再用清水彻底冲洗，擦干后备用。用过的载玻片可放入含适量肥皂或其他洗涤剂的清水中煮沸20min，洗净，再用清水反复冲洗，蒸馏水最后浸洗后擦干备用。边缘破碎、玻面有划痕的玻片不能再用。使用玻片时，只能手持玻片边缘，切勿触及玻片表面，以保持玻片清洁、干燥、中性、无油腻。

2．最好使用非抗凝血制备血涂片，也可用EDTA抗凝血制备。使用抗凝血标本时，应充分混匀后再涂片。抗凝血标本应在采集后4h内制备血涂片，时间过长可引起中性粒细胞和单核细胞的形态学改变。制片前标本不宜冷藏。涂片的厚度、长度与血滴的大小、推片与载玻片之间的角度、推片时的速度及红细胞比容有关。一般认为血滴大、血粘度高、推片角度大、速度快则血膜厚，反之则血膜薄。故针对不同病人应有的放矢，对血细胞比容高、血粘度高的病人应采用小血滴、小角度、慢推；而贫血患者则应采用大血滴、大角度、快推。

3．血膜应厚薄均匀适度，头尾及两侧有一定的空隙。如血膜面积太小，可观察的部分会受到局限，故应以在离开载玻片另一端2cm的地方结束涂抹为宜。一些体积特大的特殊细胞常在血膜的尾部出现，因此画线应注意保存血涂片尾部细胞。

4．血涂片必须充分干燥后方可固定染色，否则细胞尚未牢固地吸附在玻片上，在染色过程中容易脱落。

实验评价

血涂片制备是血液学检查的重要基本技术之一。一张良好的血片，厚薄要适宜，头体尾要明显，细胞分布要均匀，膜的边缘要整齐，并留有一定的空隙。

血涂片制备时手工推片法用血量少、操作简单，是最广泛应用的方法。除可

获得满意的血涂片外，抗凝的血液病标本离心后取其灰白层涂片，可提高阳性检出率。此外，还可根据不同需要（如疟原虫、微丝蚴检查等）采用厚血涂片法。随着当今的自动化的发展，出现了自动血液涂片和染色装置。自动的血液涂抹装置主要有两类，一类是离心法，可以将少量细胞浓缩涂片；另一类是机械涂片法，其模拟手工涂片，适用于大量血涂片的制备。一般来说自动血液涂片装置可获得细胞分布均匀、形态完好的血片，但尚未普遍推广。

思考题

从外观来判断，一张好的血涂片有哪些特征？

血涂片的制备与染色

血涂片的制备:

【器材】

清洁、干燥、无尘、无油脂的载玻片(25㎜×75㎜,厚度为0.8～1.2㎜) .

【操作】

血涂片制备方法很多,目前临床实验室采用的是手工推片法,在玻片近一端1cm处.加一滴0.05ml充分混匀的血液,握住另一张边缘光滑的推片,以30°～45°角使血滴沿推片迅速散开,快速、平稳地推动推片至载玻片的另一端.

【附注】

1.血片通常分头、体、尾三部分.

2.推好的血涂片应在空气中晃动,使其尽快干燥.天气寒冷或潮湿时,应于37℃恒温箱保温促干,以免细胞变形缩小.

3.涂片的厚薄、长度与血滴的大小、推片与载玻片之间的角度、推片时的速度及红细胞的比容有关.一般认为血滴大、角度大、速度快则血膜厚；反之则血膜薄.

4.涂片应在1h内染色或在1h 内用无水甲醇固定后染色.

5.新购置的载玻片常带有游离碱质,必须用浓度约1mol∕LHCL浸泡24h后,再用清水彻底冲洗.

血涂片染色:

瑞士染色法

【原理】

瑞士染色法使细胞既有化学亲和反应,有又物理吸附作用.各种细胞由于其化学成分不同,对酸性及碱性染料的结合力也不同,因此,染色后各种细胞呈现出各自的染色特点.

【试剂】

瑞士染液

Ⅰ液: 瑞士染料0.1g , 甲醇60.0ml

瑞士燃料有酸性燃料伊红和碱性染料美蓝的氧化物(天青)组成.将瑞士染料放入清洁干燥研钵里,先加少量的甲醇,充分研磨使燃染料溶解,将已溶解的染料倒入棕色试剂瓶中,未溶解的在加少量甲醇研磨,直至染料完全溶解,甲醇全部用完为止.配好后放入室温下,一周后即可使用.新配染液效果较差,放置时间延长,染色效果越好.久置应密封,以免甲醇挥发或氧化成甲酸.染液中也可加中性甘油2～3ml,除可防止甲醇过早挥发外,也可使细胞着色清晰.

Ⅱ液: Ph 6.4～6.8磷酸盐缓冲液

磷酸二氢钾(KH2PO4) 0.3g

磷酸氢二钠(Na2HPO4) 0.2g

加蒸馏水加至1000ml. 配好后用磷酸盐溶液校正PH,塞进瓶口贮存.如无缓冲液可用蒸馏水代替.

【附注】

1.pH对细胞染色有影响.

2.未干透的血膜不能染色.否则染色时血膜易脱落.

3.染色时间与染色浓度、染色时温度成反比;而与细胞数量成正比.

4.冲洗不能先倒掉染液,应用流水冲去,以防染料沉淀在血膜上.

5.如血膜上有染料颗粒沉积,可加少许甲醇溶解.

【操作】

1.采血后推制厚薄适宜的血涂片.

2.用蜡笔在血膜两边划线,然后将血膜放在染色架上.

3.瑞士染液数滴,以覆盖整个血膜为宜,定血膜约1min.

4.滴加约等量的缓冲液与染液混合,室温下染色5～10min.

5.用流水冲去染液待干燥后镜检.

步骤：采血，推片，干燥，标记，染色

1.采血准备工作：按摩，消毒，针刺，吸血，止血

2.推片:

一张良好血涂片的要求：厚薄适宜，头体尾明显，细胞分布均匀，边缘整齐，两端和两边留有空隙

血涂片制备的注意事项：血滴愈大，角度愈大，推片速度愈快，则血膜愈厚；反之，血涂片愈薄。针对不同患者应有的放矢，对血细胞比容高、血粘度高的患者宜采用小血滴、小角度、慢推；贫血患者则相反。引起血涂片分布不均的主要原因：推片边缘不整齐（毛刷状）用力不均匀（阶梯状）载片

不清洁（有空泡）

3.干燥：将推好的血涂片在空气中晃动，使其迅速干燥。天气寒冷或潮湿时，应于37℃温箱中保温促干，

以免细胞变形缩小

4.标记

5.染色：

瑞氏染色法(Wr ight’s stain)

1. 染液成分：

①美蓝（亚甲蓝）：M＋碱性染料

②伊红（曙红）：E－酸性染料

③瑞氏染料：M＋＋E- ME↓（伊－美中性物）

④甲醇：溶解染料；固定细胞形态；蛋白质呈颗粒或网状，增加细胞与染料的接触

2. 染色原理：

①基本原理：物理吸附、化学亲和作用

②碱性物质（Hb、嗜酸性颗粒）――嗜酸性物质、染成粉红色（E－）

③酸性物质（核蛋白、RNA）――嗜碱性物质、染成蓝或紫蓝色（M＋）

④中性颗粒（中性细胞胞浆）――嗜中性物质、染成淡紫红色（M＋E－）

pH 的影响：

H＋（pH

OH－（pH>PI）：蛋白质与酸性染料（E-）亲和力下降，增强美蓝着色，出现蓝染

PBS缓冲液：pH : 6.4－6.8 以维持恒定的pH环境

3. 染色方法

①固定：滴加染液3 ~ 5滴，覆盖整个血膜固定细胞0.5－1 min

②染色：加1 ~ 2倍PBS 缓冲液，混匀染5 ~ 10min

③冲洗：平衡摇动，于自来水龙头上平置冲洗（从一端开始），或加PBS 缓冲液冲洗

4. 染色结果

①外观：淡紫红色