生物材料的冷冻保存方法
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
NaHC03配制而成的基础液。与渗透性抗冻剂l，2一丙二醇(PG)、甲醇(MeOH)、甘油(Gly)、乙二醇(EG)、二_甲基甲酰胺(DMF)、二甲基业砜(DMSO)、酒精(EtOH)，非渗透性抗冻剂聚乙烯毗咯N(PVP)、蔗糖(Suct-ose)、葡萄稀(Glucose)、葡聚糖(Dex)、D果糖(D—fructose)配成不同浓度的抗冻液(液体试剂v／v，固体试剂m／V)
细管型冷冻精液解冻后的存活率显著高于颗粒型冷冻精液(P<0．01)。细管型冷冻精液解冻后的顶体完整率为0．613±0．049，颗粒型冷冻精液解冻后的顶体完整率为0．4760．057(n=20)，两者差异显著(P<0．05)。颗粒型冷冻精液的受精率显著高于细管型(p<0．01)。
洪山公鸡精液冷冻保存方法及效果的研究
颗粒型精液的冷冻方法从不同个体采集到的新鲜精液混合后用BPSE加甘油(Sigma公司产品)(甘油占最终体积的11％，v／V)以1：2稀释后置5℃冰箱平衡1h。之后，用吸管直接将精液滴入液氮当中，每一滴大约为0．1mL。
细管型精液的冷冻方法用与冷冻颗粒型精液相同的程序将精液作1-2稀释(甘油浓度同上)，然后将一端用铁珠封口的细管(0.5mL)倒置插入盛经稀释后精液的烧杯，置5℃冰箱lh后取出，并将细管平铺在铜筛(直径20cm)上，吊人液氮罐。通过调节铜筛底距液氮面的距离，并用低温温度计的探头(MCT-11一T)监测温度下降的速度，将温度下降的速度控制在3～5。C／min之间，温度降到-35％时将细管浸入液氮。
材料的个体特性
使用的冷冻液体（配方等）
冷冻的程序
效果
来源文献
洪山公鸡精液
PSE(Beitsville Poultry
Semen Extender，BPSE) J，谷氨酸钠0．867 g，果糖0．500 g，磷酸氢二钾1．270g，TES
0．195g，柠檬酸钠0．064 g，醋酸钠0．430g溶于100mL双蒸水，高压灭菌后，4℃冰箱保存待用。
常规冷冻保存的卵母细胞进行体外受精后卵裂率为26．06％，远远低于正
常体外受精的比例(67．7％)。
绵羊卵母细胞冷冻保存方法的研究
作者：李辉，张居农
刊名：云南畜牧兽医
年，卷(期)：2002(4)
莎能奶山羊皮肤成纤维细胞
细胞悬液：胎牛血清：DMs()=7：2：1的比例配制成细胞冷冻保存悬液
纯化后传代培养的成纤维细胞贴壁生氏达90％左右，倒去培养液，用生理盐水清洗，每个25mI，组织培养瓶加入300μL Trypsin—EDTA(0．25％Trypsin，lmmol／L EDTA、4Na)消化3～5min，在显微镜下观察细胞的收缩情况，DMEM／F12+20％胎牛清+100Iu／mL双抗完全培养液终止消化后，用移液枪将细胞轻轻吹打下来，1000r／min、离心5min．弃上清液后并收集细胞，重悬于DMEM双抗完全培养液，经过两次离心和收集细胞，得到的细胞按细胞悬液：胎牛血清：DMs()=7：2：1的比例配制成细胞冷冻保存悬液，加入到1．8mI冻存管(Corning)中，然后将冻存管分类冻存。先在4C预冷平衡0.5h液氮罐口气念氮悬挂4h，然后沉人液氮。
活细胞率为84．8％，培养48h后细胞贴壁率为85．4%
莎能奶山羊皮肤成纤维细胞几种冷冻保存方法的研究
作者：王亮，刘婷婷，彭涛，帅志强，张达江，朱海，陈军，李卫华，汪汉卿
刊名：西北农业学报
年，卷(期)：2005,14(6)
牙鲆(Paralichthys olivaceus)不同时期的胚胎
采用以NaCl、KCI、CacCl·2H20、MgCI，·6H2O、
快速冷冻条件下各处理均无组织块生长
猪皮肤组织块冷冻保存方法的研究
作者：程旭梅，倪黎纲，吴晓伟，孙鹏翔，葛剑辉，戴建明，李碧春，
刊名：扬州大学学报（农业与生命科学版）
年，卷(期)：2008,29(3)
作者：刘建忠，朱艳君，张一玲
刊名：武汉科技大学学报（自然科学版）
年，卷(期)：2005,28(2)
绵羊卵母细胞
冷冻基础液、卵黄、糖类、sTM、sDs(十二烷基磺酸钠)配制成的冷冻液
成熟卵母细胞(成熟培养22h)移入5％冷冻液平衡5min。再移人10％冷冻液平衡5min，然后每20枚左右卵母细胞迅速装入0．25 mL细管。放人冷冻仪进行冷冻，起始温度20℃，l℃／min的速度降温至一6．3℃植冰．平衡lOMin后，0．3℃／min的速度降温至一33℃，投入液氮保存。
按1．5筛选到的PM与DMsO混合比例(体积比3：1)配置总体积分数为35％的混合抗冻液，添加5％的非渗透性抗冻剂蔗糖配成玻璃化液。室温条件下平衡牙鲆尾芽期至心跳期胚胎：分步平衡足先在1／4浓度的玻璃化液中平衡90 min，再于1／2浓度的玻璃化液Il-平衡10min，最后放入玻璃化液中立即开始冷冻，10min后停止冷冻，冷冻胚胎中包括最后一步平衡时间为lmin至20min的胚胎；一步平衡时，将胚胎直接加入玻璃化液平衡5 min，然后开始冷冻，直至胚胎在玻璃化液平衡20min时停止冷冻。
猪皮肤组织块
甲基亚砜、甘油和乙二醇为冷冻保护剂
直径9 cm玻璃培养皿硅化处理后，分区滴加浓度不同的9种冷冻保护液和对照组DMEM液，随机挑取3～6块组织块分别浸入冷冻保护液中，22℃渗透平衡25rain；平衡后将组织块分别加入盛有0．5mL不同浓度保护液的冷冻管(1．8mL)中，采用快速降温方法进行冻存。快速冷冻：组织块加入冷冻管后直接投入液氮中保存。
不同时期牙鲆胚胎在玻璃化液中的存活率随着胚胎发育期不同，尾芽期以前逐步升高，心跳期以后逐步降低，尾芽期与心跳期存活率最高，心跳期略高于尾芽期，但差异不显著
不同抗冻剂对牙鲆胚胎毒性研究以及玻璃化颗粒冷冻保存方法的应用
作者：刘本伟，陈松林，田永胜，孔晓瑜，王春花
刊名：中Fra Baidu bibliotek水产科学
年，卷(期)：2007,14(5)
细管型冷冻精液解冻后的存活率显著高于颗粒型冷冻精液(P<0．01)。细管型冷冻精液解冻后的顶体完整率为0．613±0．049，颗粒型冷冻精液解冻后的顶体完整率为0．4760．057(n=20)，两者差异显著(P<0．05)。颗粒型冷冻精液的受精率显著高于细管型(p<0．01)。
洪山公鸡精液冷冻保存方法及效果的研究
颗粒型精液的冷冻方法从不同个体采集到的新鲜精液混合后用BPSE加甘油(Sigma公司产品)(甘油占最终体积的11％，v／V)以1：2稀释后置5℃冰箱平衡1h。之后，用吸管直接将精液滴入液氮当中，每一滴大约为0．1mL。
细管型精液的冷冻方法用与冷冻颗粒型精液相同的程序将精液作1-2稀释(甘油浓度同上)，然后将一端用铁珠封口的细管(0.5mL)倒置插入盛经稀释后精液的烧杯，置5℃冰箱lh后取出，并将细管平铺在铜筛(直径20cm)上，吊人液氮罐。通过调节铜筛底距液氮面的距离，并用低温温度计的探头(MCT-11一T)监测温度下降的速度，将温度下降的速度控制在3～5。C／min之间，温度降到-35％时将细管浸入液氮。
材料的个体特性
使用的冷冻液体（配方等）
冷冻的程序
效果
来源文献
洪山公鸡精液
PSE(Beitsville Poultry
Semen Extender，BPSE) J，谷氨酸钠0．867 g，果糖0．500 g，磷酸氢二钾1．270g，TES
0．195g，柠檬酸钠0．064 g，醋酸钠0．430g溶于100mL双蒸水，高压灭菌后，4℃冰箱保存待用。
常规冷冻保存的卵母细胞进行体外受精后卵裂率为26．06％，远远低于正
常体外受精的比例(67．7％)。
绵羊卵母细胞冷冻保存方法的研究
作者：李辉，张居农
刊名：云南畜牧兽医
年，卷(期)：2002(4)
莎能奶山羊皮肤成纤维细胞
细胞悬液：胎牛血清：DMs()=7：2：1的比例配制成细胞冷冻保存悬液
纯化后传代培养的成纤维细胞贴壁生氏达90％左右，倒去培养液，用生理盐水清洗，每个25mI，组织培养瓶加入300μL Trypsin—EDTA(0．25％Trypsin，lmmol／L EDTA、4Na)消化3～5min，在显微镜下观察细胞的收缩情况，DMEM／F12+20％胎牛清+100Iu／mL双抗完全培养液终止消化后，用移液枪将细胞轻轻吹打下来，1000r／min、离心5min．弃上清液后并收集细胞，重悬于DMEM双抗完全培养液，经过两次离心和收集细胞，得到的细胞按细胞悬液：胎牛血清：DMs()=7：2：1的比例配制成细胞冷冻保存悬液，加入到1．8mI冻存管(Corning)中，然后将冻存管分类冻存。先在4C预冷平衡0.5h液氮罐口气念氮悬挂4h，然后沉人液氮。
活细胞率为84．8％，培养48h后细胞贴壁率为85．4%
莎能奶山羊皮肤成纤维细胞几种冷冻保存方法的研究
作者：王亮，刘婷婷，彭涛，帅志强，张达江，朱海，陈军，李卫华，汪汉卿
刊名：西北农业学报
年，卷(期)：2005,14(6)
牙鲆(Paralichthys olivaceus)不同时期的胚胎
采用以NaCl、KCI、CacCl·2H20、MgCI，·6H2O、
快速冷冻条件下各处理均无组织块生长
猪皮肤组织块冷冻保存方法的研究
作者：程旭梅，倪黎纲，吴晓伟，孙鹏翔，葛剑辉，戴建明，李碧春，
刊名：扬州大学学报（农业与生命科学版）
年，卷(期)：2008,29(3)
作者：刘建忠，朱艳君，张一玲
刊名：武汉科技大学学报（自然科学版）
年，卷(期)：2005,28(2)
绵羊卵母细胞
冷冻基础液、卵黄、糖类、sTM、sDs(十二烷基磺酸钠)配制成的冷冻液
成熟卵母细胞(成熟培养22h)移入5％冷冻液平衡5min。再移人10％冷冻液平衡5min，然后每20枚左右卵母细胞迅速装入0．25 mL细管。放人冷冻仪进行冷冻，起始温度20℃，l℃／min的速度降温至一6．3℃植冰．平衡lOMin后，0．3℃／min的速度降温至一33℃，投入液氮保存。
按1．5筛选到的PM与DMsO混合比例(体积比3：1)配置总体积分数为35％的混合抗冻液，添加5％的非渗透性抗冻剂蔗糖配成玻璃化液。室温条件下平衡牙鲆尾芽期至心跳期胚胎：分步平衡足先在1／4浓度的玻璃化液中平衡90 min，再于1／2浓度的玻璃化液Il-平衡10min，最后放入玻璃化液中立即开始冷冻，10min后停止冷冻，冷冻胚胎中包括最后一步平衡时间为lmin至20min的胚胎；一步平衡时，将胚胎直接加入玻璃化液平衡5 min，然后开始冷冻，直至胚胎在玻璃化液平衡20min时停止冷冻。
猪皮肤组织块
甲基亚砜、甘油和乙二醇为冷冻保护剂
直径9 cm玻璃培养皿硅化处理后，分区滴加浓度不同的9种冷冻保护液和对照组DMEM液，随机挑取3～6块组织块分别浸入冷冻保护液中，22℃渗透平衡25rain；平衡后将组织块分别加入盛有0．5mL不同浓度保护液的冷冻管(1．8mL)中，采用快速降温方法进行冻存。快速冷冻：组织块加入冷冻管后直接投入液氮中保存。
不同时期牙鲆胚胎在玻璃化液中的存活率随着胚胎发育期不同，尾芽期以前逐步升高，心跳期以后逐步降低，尾芽期与心跳期存活率最高，心跳期略高于尾芽期，但差异不显著
不同抗冻剂对牙鲆胚胎毒性研究以及玻璃化颗粒冷冻保存方法的应用
作者：刘本伟，陈松林，田永胜，孔晓瑜，王春花
刊名：中Fra Baidu bibliotek水产科学
年，卷(期)：2007,14(5)