人源化抗体的制备
人源化单克隆抗体的构建技术
人源化单克隆抗体的构建技术摘要：单克隆抗体从问世到现在已广泛应用于临床,经历了一段曲折的发展历程。
其中人源化抗体是一个重要的里程碑，并伴随着一系列重大的技术革新，如PCR 技术、抗体库技术、转基因动物等。
抗体技术从最初的嵌合抗体、改型抗体逐渐发展为今天的人源化抗体。
本文综述了人源化单克隆抗体的构建技术。
关键词：人源化,单克隆抗体,构建从20世纪7０年代英国学者Milsteｉn和德国学者Koｈler利用细胞融合技术首次成功地制备出单克隆抗体以来[1],单克隆抗体在医学、生物学、免疫学等诸多学科中发挥了巨大的作用。
单克隆抗体可用于分析抗原的细微结构及检验抗原抗体未知的结构关系,还可用于分离、纯化特定分子抗原，甚至用于临床疾病的诊断和治疗等。
然而,单克隆抗体技术在临床治疗应用中的进展却很慢,主要原因是目前单克隆抗体大多是鼠源性的，而鼠源性单克隆抗体应用于人体治疗时存在诸多问题：一是不能有效地激活人体中补体和Fｃ受体相关的效应系统；二是被人体免疫系统所识别,产生人抗鼠抗体（human anｔiｇｅn mｏuｓe ａnｔiboｄy,ＨAMA）；三是在人体循环系统中被很快清除掉。
因此，在保持对特异性抗原表位高亲和力的基础上进行人源化改造,减少异源抗体的免疫原性,成为单克隆抗体研究的重点[2]。
随着对抗体基因的研究和ＤNＡ分子重组技术的应用,通过基因改造获得特异性抗体成为可能。
１989年Huse等首次构建了抗体基因库，从而使抗体的研究从细胞水平进入到分子水平，并推动了第3代抗体—基因工程抗体技术的发展。
至此,抗体的产生技术经历了三个阶段：经典免疫方法产生的异源多克隆抗体;细胞工程产生的鼠源单克隆抗体及基因工程产生的人源单克隆抗体。
人源化抗体就是指抗体的可变区部分（即Ｖh和Vl区）或抗体全部由人类抗体基因所编码。
人源化抗体可以大大减少异源抗体对人类机体造成的免疫副反应。
人源化抗体的形式也从最初的嵌合抗体、改型抗体等逐步发展为今天的人源化抗体。
阿达木单抗生产工艺
阿达木单抗生产工艺一、引言阿达木单抗是一种人源化的单克隆抗体，用于治疗不同类型的癌症。
本文将介绍阿达木单抗生产工艺，包括细胞培养、纯化和质量控制等方面。
二、细胞培养1. 细胞株选取阿达木单抗的生产需要使用CHO（Chinese Hamster Ovary）细胞株。
CHO细胞具有高度稳定性和良好的生长特性，适合大规模生产。
2. 培养基配制CHO细胞培养需要使用含有足够营养物质的培养基。
常用的培养基包括DMEM（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）和F-12（Ham's F-12 Nutrient Mixture）。
在培养基中添加适当浓度的血清和其他营养物质可以促进细胞生长。
3. 细胞培养条件CHO细胞需要在37℃、5% CO2下进行培养，通常采用滚动式或搅拌式培养罐进行大规模生产。
为了保证细胞的健康和稳定性，需要定期更换新鲜的培养基，并控制细胞密度和培养时间。
4. 转染为了生产阿达木单抗，需要将CHO细胞转染成含有阿达木单抗基因的质粒。
常用的转染方法包括电穿孔法、磷酸钙共沉淀法和聚乙烯醇法等。
三、纯化1. 细胞收获当CHO细胞达到一定密度后，可以进行细胞收获。
首先需要将细胞培养液离心分离，然后使用盐溶液或其他方法破坏细胞膜，释放出阿达木单抗。
2. 亲和层析亲和层析是一种常用的纯化方法，可以通过特定的亲和剂选择性地捕获目标分子。
对于阿达木单抗的纯化，可以使用含有Protein A或Protein G的树脂进行亲和层析。
3. 离子交换层析离子交换层析是一种基于分子带电性质进行分离的方法。
对于阿达木单抗的纯化，可以使用弱阳离子交换树脂进行分离和富集。
4. 尺寸排除层析尺寸排除层析是一种基于分子大小进行分离的方法。
对于阿达木单抗的纯化，可以使用分子量筛选树脂进行富集和纯化。
四、质量控制1. 阿达木单抗鉴定在生产过程中，需要对阿达木单抗进行鉴定，确保其纯度和活性。
人源化单克隆抗体制备工艺
速度极快, 最快在1 周内即可完成抗体的分离工作。
核糖体展示技术
1997 年Hanes 等在Mattheakis 等的多聚核糖体展示技术的基础上 进行改进建立了核糖体展示技术。
基本ne,September 26, 2012
一、Molecular Modeling and Structural Analysis of D9 Fv
D9 VH and VL mRNA was extracted from D9 hybridoma cells, amplified by Reverse Transcription-PCR and then sequenced. The deduced amino acid sequences are shown here.
抗体药物市场销售额增势不减，世界各国纷纷投入巨资开发这座“金 矿”，全球医药巨头，如辉瑞、罗氏、诺华等更是不惜重金开发抗体 药物。国内方面，成都康弘的郎沐表现出色，2014年上市8个月实现销 售额1亿元，2015年销售额约3亿元。
在临床实践中，抗体药物也呈现愈发活跃的状态。美国詹森研究开发 有限责任公司副总裁威廉·R·斯特罗尔表示，过去十年间，多种抗体治 疗方法和新平台已被设计研发，未来抗体治疗的范围将进一步扩大。 “目前一些针对免疫肿瘤学的抗体已被研发，即将进入临床，为癌症 患者、免疫功能紊乱、代谢障碍等患者提供更多治疗方法。”
抗体的现状
从1992年首个抗体药物Orthoclone上市以来，截至2016年03月，欧美日 等主要市场共上市了61个抗体药物。2014年上市了6个抗体药物，2015 年上市了9个抗体药物，连续两年打破历史记录。2015年，61个抗体药 物合计销售额达到906亿美元，与2014年相比增长了8.2%。从销售数据 来看，前21位的抗体药物都超过了10亿美元。
基因工程抗体PPT课件
cover illustration Antibody single-chain fragment stability-engineered by point mutations (A) and by a CDR-graft to the most stable human consensus framework (B). Insufficient thermodynamic stability can limit the use of particular antibody fragments as targeting moieties in therapeutic constructs, such as e.g. immunotoxins or immunoliposomes. This limitation can be overcome by a graft of the antigen combining site to a more stable antibody framework. However, such grafts sometimes fail to reach the superior stability of the acceptor framework. Comparison with the stabilization obtained with a set of designed point mutations shows that this is not always due to destabilizing interactions within the complementary determining regions, but to subtle structural differences between different classes of antibody frameworks that introduce strain in CDR grafts to divergent frameworks. For further details please see Kügler et al. (pp.135–148) and Honegger et al. (pp. 121–134).
抗体的人源化
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抗体导向酶-前药疗法 为了解决对恶性肿瘤化疗特异性差易对正常组织造 成破坏的问题而提出。 选用单抗导向原理，与前药专一性活化酶交联并选 择性地结合于肿瘤部位，使前药可区域特异性地在 肿瘤组织内转化为活性细胞毒分子，有效增加肿瘤 部位浓度降低正常组织中浓度。
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抗体治疗药物
目前的客观现实是：研究进展迅速，但未达到常规治疗的 应用阶段 障碍（原因）：抗体相对分子质量大，穿透力低，不能达 到靶部位或摄取量低。鼠源性抗体的排斥反应
一，放射性同位素标记的抗体治疗药物
二，抗癌药物偶联的抗体药物
三，毒素偶联的抗体药物
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抗体诊断试剂
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一、血清学鉴定用的抗体试剂
血清学鉴定是指用已知抗体来鉴定未知的抗原型， 主要用于疾病病原菌诊断和血型鉴定。包括： 鉴定病原菌的抗体试剂 乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg)的反向被动血 凝诊断试剂 妊娠诊断试剂
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一、放射性同位素标记的抗体治疗药物
优点：操作简便，用量少，能观察到药物在体内的 分布和药物动力学。放射性同位素标记抗体杀伤范 围较大，相对分子质量又小，更容易穿透到达肿瘤 部位。
缺点：有些同位素来源困难，需放射线保护和污物 处理。
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二、抗癌药物偶联的抗体药物
常用的抗癌药物：氨甲喋呤（methotrexate, MTX）、阿霉素(adriamycin,ADM) 丝裂霉素 (mitomycin, MMC)、环磷酰胺 (cyclophosphamide, CTX) 、新抑癌蛋白 (neocarzinostatin, NCS) 、正定霉素 (doxorubicin, DOX)等。
人源化单克隆抗体的制备方法
人源化单克隆抗体的制备方法人源化单克隆抗体的制备方法1. 引言人源化单克隆抗体作为一种重要的生物药物，在医学诊断和治疗上发挥着重要的作用。
它们能够通过特异性结合目标物质，如病毒、癌细胞等，以识别、中和或破坏它们，具有广泛的应用前景。
人源化单克隆抗体通过将小鼠源的初始抗体进行改造和人源化，弥补了小鼠抗体在人体内产生反应的缺陷，进而提高了其临床应用的安全性和有效性。
2. 人源化单克隆抗体的制备方法2.1 选择目标抗原在制备人源化单克隆抗体之前，首先需要明确目标抗原。
这是指研究人员要制备对特定疾病或病原体具有高度特异性的抗体。
目标抗原的选择对于后续的实验设计和结果分析至关重要。
2.2 制备小鼠源的初始抗体为了制备人源化单克隆抗体，通常需要使用小鼠或其他动物作为初步制备抗体的源头。
研究人员通过免疫注射小鼠来激发其免疫系统产生特定抗原的抗体。
之后，从小鼠体内提取抗体进行初步鉴定和筛选。
2.3 克隆筛选通过克隆和筛选的过程，选择那些对目标抗原具有高度特异性的抗体克隆。
这一步骤的目的是从小鼠源的初始抗体中挑选出性能最佳的抗体克隆，为后续的人源化操作打下基础。
2.4 人源化改造人源化改造是将小鼠源的初始抗体转化为具有人源特性的抗体。
在这一步骤中，研究人员会通过基因工程技术将小鼠源抗体的大部分小鼠特异性区域替换为人源的同源区域，以减少人体对外源蛋白的免疫反应。
这可以通过重组DNA技术，将人源抗体的DNA序列嵌入到小鼠源抗体的DNA序列中，使其具有人源性。
2.5 生产和纯化经过人源化改造的抗体需要进行大规模的生产和纯化。
这通常通过基因工程的方法，在合适的细胞系中表达和生产抗体。
随后，使用各种纯化技术，如亲和层析、离子交换层析等，将抗体从混合物中纯化出来，以获得高纯度的人源化单克隆抗体。
3. 个人观点和理解人源化单克隆抗体的制备方法是一项复杂的过程，其中涉及到多个关键步骤和技术。
通过人源化改造，可以将小鼠源的初始抗体转化为具有人源特性的抗体，从而提高其在人体内的安全性和有效性。
人源化抗体的制备
通过细胞实验和动物实验，验证了人源化抗体能够特异性地识别并结合目标抗原，从而发 挥相应的生物学功能。
探讨了人源化抗体的应用前景
人源化抗体在疾病治疗、诊断和预防等领域具有广泛的应用前景，如肿瘤免疫治疗、自身 免疫性疾病治疗、抗感染治疗等。
对未来研究的建议
深入研究人源化抗体的作用机制
稳定性与安全性评价
稳定性评价
在不同温度、pH值及缓冲液条件下，测定抗体的稳定性及半衰期，以评估抗 体的储存及应用稳定性。
安全性评价
通过体内外毒性试验、免疫原性试验等，评估抗体的安全性及潜在毒性。
数据统计与分析方法
数据统计
采用描述性统计方法，对实验数据进行整理、归纳和可视化展示，如平均数、标 准差、箱线图等。
抗体。
B
C
D
体外重组技术
利用体外重组技术将抗体基因片段进行拼 接、优化和表达，制备出具有特定功能的 人源化抗体。
B细胞永生化技术
从人类B细胞中提取抗体基因，将其转入 永生化细胞系中表达，获得人源化抗体。
02 人源化抗体的基本原理
抗体结构与功能
抗体的基本结构
抗体是由两条重链和两条轻链组成的 Y字形蛋白质，具有识别和结合抗原 的能力。
完全人源化抗体阶段
03
利用噬菌体展示技术、转基因小鼠等技术制备出完全人源化抗
体，实现了抗体的全人源化。
制备技术概述
转基因小鼠技术
通过基因工程手段将人类抗体基因转入小 鼠基因组中，使小鼠能够产生人源化抗体。
A 噬菌体展示技术
将抗体基因片段插入噬菌体外壳蛋 白基因中，使抗体片段展示在噬菌 体表面，通过筛选获得高亲和力的
人源化抗体的制备
人源化抗体：构建的核心原则与策略
人源化抗体：构建的核心原则与策略第一代人源化抗体是通过将鼠源McAb的可变区与人抗体的恒定区相结合，形成了一种嵌合抗体。
尽管这两部分在空间结构上相对独立，使得其独特的抗原亲和力得以保持，但由于嵌合抗体中仍然包含鼠源McAb的可变区，因此在应用时仍可能引发强烈的HAMA反应。
为了克服这一问题，科学家们进一步进行了改进，将鼠源McAb可变区中的相对保守的骨架区（Framework region,FR）替换为人的FR，而仅保留抗原结合部位的互补决定区（Complementarity-Determining region,CDR）。
这种改进使得抗体真正实现了人源化。
然而，FR作为抗体的脚手架，不仅为CDR提供了空间构象环境，有时还参与抗体结合位点正确构象的形成，甚至与抗原的结合。
因此，简单的CDR移植往往会导致原抗体亲和力的丧失或降低。
为了解决这一问题，目前科学家们已经探索出了四种策略，旨在优化FR和CDR之间的相互作用，以恢复或提高人源化抗体的亲和力。
这些策略的实施将有助于进一步提升抗体人源化的效果，为医学研究和治疗提供更多的可能性。
人源化抗体构建原则与策略1.模板替换在使用与鼠对应部分有较大同源性的人抗体FR替换鼠FR时，通常有两种途径可供选择。
第一种途径是采用同一个（或少数几个）具有已知晶体结构数据的人源抗体可变区框架（如VH中的NEW、KOL，VL中的REI等）作为基本模板，通过序列比较与分子模建，确定人、鼠间存在种源差异的氨基酸残基，特别是与鼠CDR密切作用的氨基酸残基，在替换过程中予以保留。
为了确保CDR的空间构象得以维持，需要特别关注原来抗体CDR下方的堆积残基以及周围的残基。
这种方法的优势在于，已知的人源FR晶体结构为残基替换提供了明确的信息。
然而，其不足之处在于可能难以保持鼠CDR的天然构象，从而可能导致抗体亲和力的降低或丧失。
第二条途径是在已有的抗体序列库中搜索与鼠McAb FR具有最大同源性的人源FR进行替换。
人源化抗体制备的主要方法1
1）特异性结合抗原 2）激活补体 3）结合Fc受体 4）穿过胎盘 5）免疫调节
SCID The recombination –activating genes (RAG-1/2) required for synthesis of the functional Ig and TCR that characterize mature B and T cells.
SDR grafting—a new approach to antibody humanization
构建表达载体
SDR grafting—a new approach to antibody humanization
difference between the SDR grafting and the CDR grafting
抗体的检测
1. ELISA用于检测针对可溶性抗原(蛋白 质)和细胞表面抗原的mAb。 2. FACS(流式细胞仪)用于检测细胞表面抗原的mAb。 3. 用western blot 检测单抗的特异性。 克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。 因为经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。 在实际工作中，可能会有数个甚至更多的克隆，可能包括抗体分泌细胞、 抗体非分泌细胞；所需要的抗体(特异性抗体)分泌细胞和其它无关抗体分 泌细胞。要想将这些细胞彼此分开，就需要克隆化。克隆化的原则是， 对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞 会被抗体非分泌的细胞所抑制，因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体 分泌的细胞生长速度快，二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。即 使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞的突 变或染色体丢失，从而丧失产生抗体的能力。 用克隆化的方法很多，而最常用就是有限稀释法和软琼脂平板法。
人源抗TNF-α骆驼化抗体的制备研究的开题报告
人源抗TNF-α骆驼化抗体的制备研究的开题报告一、选题背景与意义TNF-α是一种T淋巴细胞产生的细胞因子，在机体的免疫反应、炎症反应、细胞凋亡、肿瘤发生等方面都发挥着重要的作用。
在某些疾病的发生过程中，特别是类风湿关节炎、克罗恩病、结肠炎等自身免疫疾病中，人体血液中的TNF-α水平显著升高，导致炎症反应加剧。
因此，抑制TNF-α的生物学效应，成为了治疗这些疾病的关键之一。
TNF-α的抗体是抑制其生物学效应的主要策略之一，抗TNF-α单克隆抗体（mAb）已经成为治疗类风湿关节炎、克罗恩病、结肠炎等自身免疫疾病的标准疗法。
目前市场上的抗TNF-α单克隆抗体主要有英夫利昔单抗（Infliximab）、阿达鲁木单抗（Adalimumab）、高尔司肽单抗（Golimumab）等，这些抗体均为外源抗体，并存在着免疫原性、耐药性等问题。
为了解决这些问题，开发人源化、骆驼化的抗TNF-α单克隆抗体，已经成为当前抗体药物制备的研究热点。
二、研究内容与方法本研究旨在制备一种人源抗TNF-α骆驼化单克隆抗体，具体研究内容如下：1.构建骆驼源天然单克隆抗体文库。
从天然阳性骆驼血清中筛选出对人TNF-α高亲和性的单克隆抗体，并利用RT-PCR技术将其DNA序列克隆到表达载体中。
2.表达和纯化骆驼化单克隆抗体。
将构建好的表达载体转染到选择性细胞系中，并进行大规模发酵和纯化，得到骆驼化抗体。
3.人源化。
利用人-骆驼嵌合抗体的策略，人源化骆驼化抗体。
选取骆驼化抗体中的可变区，将其与人IgG的框架区连接起来，得到人源化骆驼化抗体。
4.表达和纯化人源化骆驼化抗体。
将人源化骆驼化抗体的表达载体转染到选择性细胞系中，并进行大规模的发酵和纯化，得到制备好的人源化骆驼化抗体。
三、预期结果与意义本研究的最终目标是制备一种高活性、高亲和力、无免疫原性和易于大规模生产的人源抗TNF-α骆驼化单克隆抗体。
该抗体可以用于治疗类风湿关节炎、克罗恩病、结肠炎等自身免疫疾病，解决外源抗体存在的免疫原性、反应性等问题，提高治疗效果和疗效持续时间，具有重要的临床应用前景和经济价值。
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寻找靶向抗原——基本要求
寻找靶向抗原——不同功能
ADCC、CDC、调理吞噬 • 为了免疫效应细胞和补体能最大限度利用 抗体Fc域，理想的靶抗原抗体复合物必须 不会被迅速内化，否则来不及发挥效应 递呈毒素或药物 • 靶抗原具有良好的内化功能则最为理想 应对肿瘤的免疫逃逸
寻找靶向抗原——应对逃逸机制
所以，构建人源化抗体的关键在于选择合适的人抗体轻链和重链作为鼠 cDRs的框架区。
鼠单抗人源化
• 将小鼠Ig基因敲除，转染人Ig基因，在小鼠 体内产生人Ab，再经杂交瘤技术，产生大 量完全人源化抗体 • 恒定区人源化——人-鼠嵌合抗体 • 可变区人源化——人改型抗体 • 用抗体库技术进行人源化
鼠单抗人源化
抗体在杀伤肿瘤中的作用
抗体的直接作用
结合相应受体， 阻断或激活相应 反应，诱导凋亡
介导免疫杀伤 调理吞噬
破坏肿瘤组织 特异性毒 杀肿瘤血 管和基质
ADCC
经典途径 激活补体
呈递药物或细 胞毒性剂毒害 肿瘤
治 疗 性 单 抗 识 别 的 肿 瘤 相 关 抗 原 分 类
自1997年至今，共有12 种抗体获得了FDA【美 国食品药品管理局 】的 批准用于治疗各种实体 瘤和血液系统恶性肿瘤
为什么要制备人源化抗体？
※鼠源单克隆抗体
——神奇的子弹
※单克隆抗体的若干缺陷
•人抗鼠抗体 Human antigen mouse antibody （HAMA） •不能有效激活人体中补体和受体相关的效应系 统 •体内半衰期较短
※人源化抗体优点
• 减少降低了机体的免疫排斥反应 • 募集效应因子或效应细胞 • 在体内的半衰期长
制备针对某种肿瘤抗原并应用 于临床治疗的人源化抗体
4月刊《自然综述癌症》（Nature. Reviews. Cancer.） “Antibody therapy of cancer”
概述了开发癌症患者抗体治疗的基本策略及发展状况
/nrc/journal/v12/n4/full/nrc3236.html
3.鼠源可变区编码基因进行PCR定点突变
• • • •
根据突变位点设计引物 进行多轮突变，获得重塑的鼠源可变区基因 质粒转化大肠杆菌，培养 测序鉴定
4.构建真核表达系统
基因片段 插入含有 人IgG重轻 链恒定区 的表达载 体 转染酵母 产生抗体
2.重轻链可变区基因片段分别连接克隆载体
获得的体 转化 原核表达系统检测
抽质粒、测序鉴定
第一代人源化抗体：人鼠嵌合抗体
CDR序列
CDR序列
鼠单克隆抗体
人抗体
人源化抗体
在选择人 FR 时一般有两条途径：
起初的一条是，根据已有晶体结构数据的人源抗体的可变区框架，借助序列 比较与分子模建确定在人、 鼠间的种源差异，由其是鼠 FR 中与 CDR 有密切 作用 的氨基酸残基，要保留在替换的人源 FR 中。 第二条途径是，在已有的抗体序列库中搜寻与鼠单克隆抗体FR 有最大同源性 的人源 FR 用以替换。在选择同源的人 FR 时,先前倡导将 VL 和 VH 作为一个整 体来考虑,寻找最高同源的人 FR。 后来则认为 ,将 VL 和 VH 分开考虑,分别寻找 最高同源的对应序列
对于该现象的解释是：人源化抗体中的Fc段可以特异结合人血管内皮 细胞上的Fc受体（FcRn)，使抗体内化到血管内皮细胞而不被降解，并能 够回到血液中参与循环。鼠抗体由于不能有效的与人FcRn结合而很快从循 环系统中清除。
抗体人源化的基本原则
• 保持或提高抗体的亲和力和特异性 • 大大降低或基本消除抗体的免疫原性
表面氨基酸残基人源化
鼠抗体（红）和人源化抗体（绿）Fv结构的叠合图
方法步骤
获得鼠源单抗重轻链可变区基因 可变区基因定点突变 构建人鼠嵌合基因 构建真核表达系统
1.获得鼠单抗重轻链可变区的基因片段
肿瘤抗原免疫小鼠
取小鼠脾细胞（含B细胞）
骨髓瘤细胞
PEG
杂交瘤细胞株 设计引物 RT-PCR 分别获得抗体VH、VL基因 参照发表的该鼠源单抗重 轻链可变区基因