柱层析的实验方法和技巧

3.4洗脱和收集
3.4.1洗脱
洗脱的方式可分为简单洗脱、分步洗脱和梯度洗脱三种。
简单洗脱：柱子始终用同样的一种溶剂洗脱，直到层析分离过程结束为止。如果被分离物质对固定相的亲合力差异不大，其区带的洗脱时间间隔（或洗脱体积间隔）也不长，采用这种方法是适宜的。但选择的溶剂必须很合适方能使各组分的分配系数较大。
湿法上样就是用少量溶剂（最好就是初始淋洗剂，如果淋洗剂的溶解度不好，则可以用一极性较大的溶剂，但必须少量）将样品溶解后，用胶头滴管沿着层析柱内壁均匀加入，然后用少量溶剂洗涤后，再加入。湿法较方便，省事，一般用淋洗剂溶解样品，也可以用二氯甲烷、乙酸乙酯等，但溶剂越少越好，不然溶剂就成了淋洗剂了。很多样品在上柱前是粘乎乎的，一般没关系。可是有的上样后在硅胶上又会析出，这一般都是比较大量的样品才会出现，是因为硅胶对样品的吸附饱和，而样品本身又是比较好的固体才会发生，这可以先重结晶，得到大部分的产品后再柱分，如果不能重结晶，也不用管，直接过柱就是了，样品随着淋洗剂流动会溶解。
干法装柱是直接往柱子里填入硅胶，然后再轻轻敲打柱子两侧，至硅胶界面不再下降为止，然后再填入硅胶至合适高度，最后用油泵直接抽，这样就会使得柱子装的很结实（抽真空时间不要太长，以免柱子装的过实，流速过慢而导致扩散），接着是用淋洗剂“走柱子”。干法装柱较方便、快速且溶剂耗量少，但是其分辨率低、柱效差，故适于大量样品的粗步分离。在干发装柱时应注意：不要过分剧烈地震动和敲打侧壁，过分剧烈地震动和敲打侧壁会使得硅胶因自身粒径的不均匀性而产生柱子整体的不均匀。
Fra Baidu bibliotek3.3装柱和上样
3.3.1装柱
在柱层析分离中柱子装的质量好与差也是能否成功分离纯化物质的一个关键性环节。柱子应装的要严实（均匀），不能分层等，否则重新装柱。
装柱分为干法和湿法，不论干法还是湿法，硅胶（固定相）的上表面一定要平整。装完的柱子都应该要适度的紧密，柱子下面的活塞一定不要涂润滑剂，会被淋洗剂带到产品中，可以采用四氟节门的。柱子不要开裂，无论怎样的开裂都会影响分离效果，甚至使柱层析分离作废。
3.3.2上样
上样量的多少也直接影响到分离效果，一般讲，加样量尽量少些，这样分离效果比较好，但是具体情况应根据分离目的和分离难度而定，比如进行粗分时上样量可以多些。
上样也分干法和湿法：干法就是把待分离的样品用少量溶剂溶解后，再加入硅胶，拌匀，再挥干溶剂后装入柱中。样品和硅胶用量有个说法是1:1，但是硅胶用量应越少越好，只要保证在挥干溶剂后，看不到明显的固体颗粒（说明样品完全吸附在硅胶上）这样的硅胶量就合适了。如此得到的粉末再小心加到柱子的顶层。干法上样较麻烦，但可以保证样品层很平整。
3.2流动相的选择
在柱层析分离中流动相（淋洗剂）的选择尤为关键，直接影响到柱层析的分离效果，如果选择不当常常导致几十毫克样品，用了几百毫升淋洗剂都还没有完全分离，甚至不能分离。
以硅胶柱为例，具体选择哪种流动相以及流动相的极性，多是通过薄层色谱（TLC）来确定。一般来说流动相采用TLC分析得到的展开剂的比例再稀释一倍后的溶剂。
3.4.5最后的处理
柱层析分离后的产品，由于使用了大量的溶剂，其中的杂质也会累积到产品中，所以如果想送分析，最好用少量的溶剂洗涤一下，因为大部分的杂质是溶在溶剂里的，一洗基本就没了，必要时进行重结晶。
一般用到的淋洗剂多是大包装的（便宜），应注意这些工业品的纯度较低，经常能从送来的大桶底部看见有色的杂质，所以在比较严格的柱分时要对溶剂重蒸。进行粗分时就不必，反正下面还要提纯，以节省时间和精力。
一般在过柱同时要进行减压旋蒸，流动相为混和溶剂时（如石油醚和乙酸乙酯），流动相的比例由于挥发度的不同会有所改变，从而导致极性的变化（一般会使得极性变大），在梯度淋洗时比较合适，正好所需流动相的极性也是越来越大。
湿法装柱是先把硅胶用适当的溶剂（一般用淋洗剂）拌匀，在硅胶颗粒还没有沉降前装入层析柱中。此法最大的优点是柱子装的比较结实，没有气泡，柱效高。在用湿法装柱时，先在层析柱中装入一定量的淋洗剂，放空一部分以排走所有的气泡，关闭柱子活塞，在柱中留1～2cm的淋洗剂，然后装入匀浆后，再用淋洗剂“走柱子”，直至硅胶界面不再下降为止。此时也可轻轻地敲打柱侧，以加速硅胶的沉降和排走带入的气泡。
而把固定相极性小于流动相极性的柱色谱方法称为反相柱层析，常用的流动相为甲醇、水等极性溶剂。较适宜分离极性较高的化合物。
二、凝胶层析——根据物质的分子大小进行分离
凝胶层析又称为凝胶过滤、分子筛层析等，是以具有网状结构的凝胶颗粒作为固定相，根据物质的分子大小进行分离的一种层析技术。常用的凝胶是葡聚糖凝胶（Sephadex)，如Sephadex LH-20。
第三，薄层板上点的展开的清晰程度和溶剂的极性和物质在该溶剂中的溶解性有关，只有两者比较合适了，才能有一个较好的分离效果。
在选择流动相时还应考虑到经济效益和环保。所以大多选用石油醚，乙酸乙酯。氯仿也是一种常用溶剂，但是要注意其毒性较大，所以要保持实验室通风良好。二氯甲烷也有用，但是它和硅胶的吸附是一个放热过程，所以夏天的时候经常会在柱子里产生气泡，天气冷的时候会好一些。甲醇能溶解部分的硅胶，产品最好经过后继处理，如重结晶等。其他的溶剂用的相对较少，要依据不同的需要选择。还有，在使用混合溶剂时，使用的两种溶剂的沸点应该相差不大，如：乙酸乙酯和石油醚(60～90)，而乙醚却要选择沸程为30～60的石油醚。
由于层析柱和薄层板不同，即使两者使用的硅胶都相同，但是在把TLC分析得到的展开剂用在柱层析时，也显得极性偏大，所以要稀释一倍，但又不能稀释太多，否则成了靠扩散作用来分离，效果也不会好。在用TLC选择流动相时一般先根据文献中报道的该中植物分离用什么样的流动相，就首先尝试使用该类展开剂，然后不断尝试比例，直到找到一个分离效果好的展开剂。很多时候，展开剂的选择要靠自己不断变换展开剂的组成来达到最佳效果，一般把两种溶剂混合时，采用高极性/低极性的体积比为1/3的混合溶剂，如果有分开的迹象，再调整比例，达到最佳效果，如果没有分开的迹象，最好是换溶剂。
洗脱时的流速也应控制好，流速的快慢将影响理论塔板高度，从而影响分辨率。流速太快，各组分在固液两相中平衡时间短，相互分不开，仍以混合组分流出。速度太慢，将增大物质的扩散，同样达不到理想的分离效果。
在洗脱过程中有时会出现气泡，一是和使用的溶剂有关，如果是易挥发的溶剂（如乙醚、二氯甲烷等），在室温稍高的情况下，很容易出现这种现象，因此，在室温高的时候，可以选择沸点较高，挥发相对小的溶剂。二是不论是用带砂板的还是塞棉花的层析柱，在装柱之前，都要将空气排干，这样就可避免柱中有空气。
三、柱层析实验操作
3.1层析柱的选择
这与样品的处理量、分离难度、所用的基质和分离目的有关。以基质是硅胶为例，当样品量较多，分离难度较大（相邻组分的△R较小，相差不到0.1）时，需选用较粗大的柱子以填充较多的硅胶。柱子长，相应的塔板数就高；柱子粗，上样后样品的原点就小（反映在柱子上就是样品层比较薄），这样相对地减小了分离的难度。试想如果柱子十厘米，而样品就有两厘米，那么分离的难度可想而知，而如果样品层只有0.5厘米，那么各组分就比较容易得到完全分离了。当然采用粗大的柱子要牺牲比较多的硅胶和溶剂，不过这些成本相对于产品来说也许就不算什么。如果所需组分和杂质分的比较开（是指在所需组分Rf在0.2～0.4，杂质相差0.1以上），就可以少用硅胶，用小柱子。
分步洗脱：这种方法按照递增洗脱能力顺序排列的几种洗脱液，进行逐级洗脱。它主要对混合物组成简单、各组分性质差异较大或需快速分离时适用。每次用一种洗脱液将其中一种组分快速洗脱下来。
梯度洗脱：当混合物中组分复杂且性质差异较小时，一般采用梯度洗脱。它的洗脱能力是逐步连续增加的，梯度可以指浓度、极性、离子强度或pH值等。最常用的是浓度梯度。
柱层析分离技术及其实验技巧
一、胶柱层析（正、反相柱层析）——根据物质的极性不同进行分离
根据固定相和流动相之间的极性不同，硅胶柱层析可以分为：正相柱层析、反相柱层析。
通常把固定相极性大于流动相极性的柱色谱方法称为正相柱层析，常用的流动相为有机溶剂，如石油醚、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、甲醇等。较适宜分离化合物为低级性、中等极性化合物。
此外，在整个洗脱过程中，最好保持洗脱不间断，若不得不停止洗脱过程，一定要保持整个柱子充满淋洗液，千万不能让柱子走干，否则分离纯化将会前功尽弃。
3.4.2收集
一份收集量的多少要以样品量和样品的性质而定，分离样品量多收集多一点，量少收集少一点，多了可能一分就收到了几个样品。如果是粗分，一份收集可以多一些，到最后纯化时就要注意不要收集多了否则可能把本已分开的成分又收集在一起了。具体每一分收集多少，应由具体情况而定。
此外在采用TLC选择洗脱剂时还应注意：
第一，某种样品在这种展开剂中只显示一个点，并不等于在别的展开剂中也只显示一个点。因此在寻找展开剂时，多尝试几种比例不同，成分不同的展开剂。展开剂的极性太小，点分不开；极性太大，也分不开。
第二，点不能点得太浓，否则容易重叠，不易判断，因为如果两个点相近的话，一浓就变成一个点了。但也不能太淡，否则含量较少的成分可能斑点模糊或不显出斑点。点样时还应避免损伤薄层。