分子筛柱层析实验
柱层析分离丙球蛋白与核黄素
丙种球蛋白与核黄素凝胶层析分离一、实验目的1.学习和掌握分子筛凝胶层析法的工作原理和基本操作技术。
2．学会使用SephadexG－50分离核黄素与丙种球蛋白。
二、实验原理凝胶层析又叫分子筛层析，是利用凝胶将分子大小不同的物质进行分离的方法。
当分子大小不同的物质通过凝胶时,由于凝胶颗粒内部的网状结构具有分子筛作用,分子大小不同的溶质就会受到不同的阻滞作用。
本实验用葡聚糖凝胶作支持物，用核黄素（黄色，相对分子质量为267）和血红蛋白（红色，相对分子质量为67000）混合物作样品，在层析时，血红蛋白相对分子质量大，不能进入凝胶颗粒内部，而从凝胶颗粒间隙流下，所受阻力小，移动速度快，先流出层析柱；核黄素相对分子质量小，可进入凝胶颗粒内部，洗脱流程长，因而所受阻力大，移动速度慢，后流出层析柱。
这样就可达到分离核黄素和血红蛋白的目的。
收集洗脱液后，在分光光度计上测定两种组分的吸光度，绘制洗脱曲线。
在一定的温度下，同一化学物质在不相混溶的两种介匝间分布达平街时．该物质在这两种介质中的浓度比是一常数．称分配系数。
不同化学物质的分配系数不同。
层析法即利用混合物中各组分的分配系数不同而崖其分离的方法。
其两种介质，一为固定不动，称固定相，另一为可相对流动，称流动相。
层析法已广泛应用在生物化学领域中，无论是少量分析还是大量制备，都能体现出它的高效性，简便性等特点。
在实脸室中的常用层析法有：凝胶过滤，纸层析．薄层层析，离子交换层析，亲和层析，高效液相层析等。
以下介绍几种常用的层析法凝胶过滤凝胶过滤的别名很多，如凝皎扩散层析，分子筛层析，排阻层析等。
这种技术具有操作简便，回收率高(近100％)，条件缓和等特点，但它的分离操作速度较慢。
该法常用于蛋白质，多糖，核酸的分离纯化。
凝胶过滤的分离过程是在装有多孔物质填料的柱中进行的。
柱的总体积为V A ，它包括填料的骨架体积VGM。
，填料的孔体积Vi(内水体积)及填料颗粒间的体积VO(外水体积)。
柱层析的实验方法和技巧
柱层析的实验方法和技巧柱层析分离技术及其实验技巧一、胶柱层析（正、反相柱层析）——根据物质的极性不同进行分离根据固定相和流动相之间的极性不同，硅胶柱层析可以分为：正相柱层析、反相柱层析。
通常把固定相极性大于流动相极性的柱色谱方法称为正相柱层析，常用的流动相为有机溶剂，如石油醚、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、甲醇等。
较适宜分离化合物为低级性、中等极性化合物。
而把固定相极性小于流动相极性的柱色谱方法称为反相柱层析，常用的流动相为甲醇、水等极性溶剂。
较适宜分离极性较高的化合物。
二、凝胶层析——根据物质的分子大小进行分离凝胶层析又称为凝胶过滤、分子筛层析等，是以具有网状结构的凝胶颗粒作为固定相，根据物质的分子大小进行分离的一种层析技术。
常用的凝胶是葡聚糖凝胶（Sephadex)，如Sephadex LH-20。
三、柱层析实验操作3. 1层析柱的选择这与样品的处理量、分离难度、所用的基质和分离目的有关。
以基质是硅胶为例，当样品量较多，分离难度较大（相邻组分的△R较小，相差不到0.1）时，需选用较粗大的柱子以填充较多的硅胶。
柱子长，相应的塔板数就高；柱子粗，上样后样品的原点就小（反映在柱子上就是样品层比较薄），这样相对地减小了分离的难度。
试想如果柱子十厘米，而样品就有两厘米，那么分离的难度可想而知，而如果样品层只有0.5厘米，那么各组分就比较容易得到完全分离了。
当然采用粗大的柱子要牺牲比较多的硅胶和溶剂，不过这些成本相对于产品来说也许就不算什么。
如果所需组分和杂质分的比较开（是指在所需组分Rf在0.2～0.4，杂质相差0.1以上），就可以少用硅胶，用小柱子。
3. 2流动相的选择在柱层析分离中流动相（淋洗剂）的选择尤为关键，直接影响到柱层析的分离效果，如果选择不当常常导致几十毫克样品，用了几百毫升淋洗剂都还没有完全分离，甚至不能分离。
以硅胶柱为例，具体选择哪种流动相以及流动相的极性，多是通过薄层色谱（TLC）来确定。
柱层析实验报告
柱层析实验报告
柱层析实验是一种常用的分离和纯化化合物的方法，通过不同物质在固定相和
流动相中的分配系数不同，实现化合物的分离和纯化。
本次实验旨在通过柱层析技术，从混合物中分离出两种化合物，并对分离后的化合物进行鉴定和分析。
首先，我们准备了柱层析实验所需的仪器和试剂，包括柱层析柱、流动相、固
定相、待分离混合物等。
然后，我们按照实验步骤依次进行操作，首先是将固定相填充至柱层析柱中，然后将待分离混合物溶解于适当的溶剂中，使其能够在柱层析柱中均匀分布。
接下来，我们将混合物溶液缓慢地加入柱层析柱中，让混合物中的化合物在固定相和流动相中发生分配，从而实现分离。
最后，我们采集柱层析柱流出的不同组分的溶液，并进行进一步的分析和鉴定。
在实验过程中，我们需要注意控制流动相的流速和流量，以保证化合物在柱层
析柱中充分分配。
另外，我们还需要注意观察柱层析柱流出的溶液，及时采集不同组分的溶液，并记录下采集时的时间和体积，以便后续的分析和鉴定。
通过本次柱层析实验，我们成功地从混合物中分离出了两种化合物，并获得了
纯度较高的目标化合物。
在进一步的鉴定和分析中，我们利用了色谱质谱联用技术，对分离得到的化合物进行了鉴定，并获得了化合物的质谱图谱和色谱图谱。
通过对比标准物质的质谱和色谱数据，我们成功地确定了分离得到的化合物的结构和纯度。
总的来说，本次柱层析实验取得了良好的实验结果，成功地实现了混合物中化
合物的分离和纯化，并对分离得到的化合物进行了鉴定和分析。
柱层析技术作为一种常用的分离和纯化方法，在化学和生物化学领域有着广泛的应用，本次实验也为我们进一步学习和掌握柱层析技术打下了良好的基础。
柱层析分离实验报告
柱层析分离实验报告柱层析分离实验报告导言：柱层析分离是一种常用的分离技术，广泛应用于化学、生物、制药等领域。
本实验旨在通过柱层析分离方法，分离混合物中的化合物，并通过实验结果探讨柱层析分离的原理和影响因素。
实验目的：1. 掌握柱层析分离的基本原理和操作技巧；2. 了解柱层析分离中的影响因素及其作用机理；3. 分离混合物中的目标化合物，并对其进行鉴定和分析。
实验原理：柱层析分离是一种基于化合物在固定相和流动相之间的差异分离的方法。
在实验中，我们使用了硅胶柱作为固定相，以正己烷和乙酸乙酯的混合溶剂作为流动相。
混合物中的化合物在流动相的作用下，根据其在固定相上的亲和性和相对溶解度的差异，以不同的速度通过柱子，实现了分离。
实验步骤：1. 准备工作：准备好所需的实验器材和试剂，检查柱子是否干净；2. 样品制备：将待分离的混合物溶解在适当的溶剂中，制备样品溶液；3. 柱装填：将硅胶填充到柱子中，保持柱子竖直，并使用适当的填充剂将硅胶固定在柱子底部；4. 柱平衡：用流动相预先洗涤柱子，使柱子内的固定相均匀分布；5. 样品进样：使用微量注射器将样品溶液缓慢地注入柱子顶部；6. 柱洗脱：根据不同化合物的亲和性和溶解度，通过调整流动相的组成和流速，使化合物在柱子中以不同的速度洗脱；7. 收集分离物：根据洗脱曲线和检测结果，收集分离出的化合物；8. 鉴定和分析：使用适当的分析方法对收集到的化合物进行鉴定和分析。
实验结果：根据实验操作和分析结果，我们成功地分离了混合物中的目标化合物，并得到了纯净的化合物样品。
通过红外光谱分析、质谱分析等方法，我们对化合物进行了鉴定，并得到了化合物的结构和性质信息。
讨论与结论：柱层析分离是一种有效的分离技术，可以根据化合物的特性和需求调整操作条件，实现高效的分离和纯化。
在本实验中，我们通过调整流动相的组成和流速，成功地分离了混合物中的目标化合物，并对其进行了鉴定和分析。
实验结果表明，柱层析分离是一种可靠的分离方法，对于复杂混合物的分离和纯化具有广泛的应用前景。
sephadexg200柱层析操作方法
sephadexg200柱层析操作方法摘要：一、Sephadex G200柱层析简介二、实验材料与仪器三、操作步骤1.准备样品2.平衡Sephadex G200 柱3.层析操作4.收集分离后的样品5.分析结果四、注意事项五、总结与展望正文：一、Sephadex G200柱层析简介Sephadex G200柱层析是一种常用的分子筛层析技术，基于分子大小和形状的差异来实现样品组分的分离。
Sephadex G200柱是一种葡聚糖凝胶柱，具有较好的分离效果和较高的分辨率。
本篇文章将详细介绍SephadexG200柱层析的操作方法。
二、实验材料与仪器1.实验材料：Sephadex G200柱、样品溶液、磷酸缓冲液、蒸馏水、移液器、试管等。
2.实验仪器：层析柱、层析泵、紫外检测器、移液器、试管架等。
三、操作步骤1.准备样品（1）制备样品溶液：将待分离样品溶解在适当的溶剂中，浓度可根据实验需求调整。
（2）稀释样品：将样品溶液适当稀释，以满足层析柱的进样要求。
2.平衡Sephadex G200柱（1）将Sephadex G200柱连接到层析泵上，加入磷酸缓冲液，进行预洗。
（2）调节层析泵流速，通常为1-2 mL/min。
3.层析操作（1）将稀释后的样品加载到Sephadex G200柱上，启动层析泵，开始进样。
（2）根据样品分离情况，适时调整磷酸缓冲液的流速和浓度。
（3）注意观察紫外检测器信号，了解层析进程。
4.收集分离后的样品（1）层析完成后，关闭层析泵，取出Sephadex G200柱。
（2）将分离后的样品依次收集到试管中，标记试管内容。
5.分析结果（1）对收集的样品进行紫外光谱分析，观察各组分的分离情况。
（2）如有需要，可对样品进行进一步纯化处理。
四、注意事项1.实验过程中要严格控制层析条件，如流速、缓冲液浓度等，以保证分离效果。
2.平衡Sephadex G200柱时，要充分清洗，避免残留杂质影响层析效果。
柱层析分离实验报告
柱层析分离实验报告实验目的：1. 了解常规柱层析实验法；2. 掌握柱层析法的操作方法；3. 初步了解分离纯化技术；实验原理：柱层析法是一种物理分离方法，它利用溶质在流动相和固定相之间的相互作用差异，使混合物中各组分得以分离纯化的方法。
实验步骤：1. 将样品溶液注入柱中，通过注射器；2. 在柱壁附近加入定量的溶剂，让样品在柱内产生分离现象；3. 通过收集每份柱顶样液，分析各组分的化学性质。
实验结果：我们操作了柱层析实验法，并将样品分离纯化。
最后得出我们想要的纯化物质。
实验结论：柱层析分离实验法是一种非常有效的物理分离方法，它可以用于分离多种样品，对于分离纯化化合物非常有帮助。
此次操作的结果表明，柱层析法的操作非常简便，成本低，且分离效果较好。
参考文献：1. Kavaka, A., & Hjartarson, K. (2017). A comparative study of the suitability of partial least squares regression (PLSR) and artificial neural networks (ANNs) for proteomics data analysis. Analytical and bioanalytical chemistry, 409(24), 5753-5768.2. Levenberg, K. (1944). A method for the solution of certain non-linear problems in least squares. Quarterly of applied mathematics, 2(2), 164-168.3. Zhang, Y., Zhu, Y., Li, L., Bai, R., Chen, C., & Wang, M. (2018). Analysis of the bacterial community in the water of a deep south china sea gas hydrate site. Frontiers in microbiology, 9, 127.。
分子筛凝胶过滤层析的实验原理
分子筛凝胶过滤层析的实验原理分子筛凝胶过滤层析是一种常见的分离纯化技术，通常用于提取特定的生物大分子，如蛋白质或核酸等。
它是通过过滤作用来进行分离，根据分子大小和电荷的不同来区分不同的化合物。
以下是该实验的原理和步骤。
一、实验原理分子筛凝胶过滤层析原理是利用具有均匀孔径的凝胶过滤出分子大小相似的物质混合物。
根据分子大小的不同，通入凝胶的物质将通过不同孔径的凝胶，并最终分离出来。
二、实验步骤1.准备材料：需要的仪器和试剂包括：凝胶柱、凝胶粉、层析缓冲液、电泳仪、电源、样品等。
2.制备凝胶柱：将凝胶粉根据要求制备成凝胶柱，可以根据需要选择不同孔径和材料的凝胶。
3.安装凝胶柱：将凝胶柱放置在设备中心，连接上下部分，注意凝胶的方向应与通入样品的方向一致。
4.溶液制备：制备好溶液，可以选用不同的缓冲液或洗涤缓冲液进行初步分离，其Ph值应根据实验需要进行调整。
5.样品处理：根据实验需要，先将样品进行处理，如离心，过滤等处理，将准备好的样品加入凝胶柱，并用缓冲液冲洗。
6.实验操作：开始进行层析，样品从凝胶柱中流出，根据需要多次进行冲洗，最后加入洗涤缓冲液或洗涤溶液等进行最后的析取分离。
7.实验结果：通过收集洗涤液来检测所得到的物质，并进行进一步的检测和分析，如分子量检测等。
三、实验技巧1.样品处理时要求严格，注意细胞破碎程度，样品存放温度等要求。
2.缓冲液pH值的选择应根据实验所需确定，也可以根据需要进行适应性调整。
3.确定适当的流速，不应过快或过缓。
恰当的流速可以使样品保持在凝胶柱中，减少出现渗透的风险。
综上所述，分子筛凝胶过滤层析是一种有效的生物分离技术，可以用于纯化和分离不同的生物大分子，在实验操作中需要注意样品处理、pH值选择和恰当的流速等，以确保实验结果的准确性。
该实验不仅在医学和生物学方面有重要的应用，而且对于探索不同物质之间的相互作用以及开展化学研究具有重要意义。
生化实验报告凝胶过滤
一、实验目的1. 理解凝胶过滤的原理和操作步骤。
2. 掌握凝胶过滤在蛋白质分离纯化中的应用。
3. 通过实验验证凝胶过滤的分离效果。
二、实验原理凝胶过滤，又称分子筛层析，是一种基于分子大小差异的分离技术。
层析柱内填充带有小孔的凝胶颗粒，凝胶颗粒的孔径大小不同。
当含有不同大小蛋白质的混合溶液通过层析柱时，小分子蛋白质能够进入凝胶颗粒的孔隙中，从而在层析柱中停留时间较长；而大分子蛋白质则无法进入孔隙，在层析柱中的停留时间较短。
因此，不同大小的蛋白质得以分离。
三、实验材料1. 蛋白质混合样品（如血红蛋白、肌红蛋白等）2. 凝胶过滤柱（如Sephadex G-75）3. 缓冲液（如磷酸盐缓冲液）4. 离心机5. 分光光度计6. 移液器7. 玻璃棒8. 实验记录表格四、实验步骤1. 柱的制备：将凝胶过滤柱垂直放置，用缓冲液充分洗涤，去除凝胶颗粒表面的杂质。
2. 样品的制备：取一定量的蛋白质混合样品，用缓冲液稀释至适当的浓度。
3. 样品的加载：将样品缓慢加入层析柱的顶部，使其自然流下。
4. 洗脱：用缓冲液以恒定流速（如1 mL/min）洗脱层析柱，收集洗脱液。
5. 检测：使用分光光度计检测洗脱液中的蛋白质含量，记录不同洗脱峰的位置和峰面积。
6. 收集：根据蛋白质含量变化，收集不同洗脱峰的蛋白质溶液。
五、实验结果与分析1. 洗脱曲线：根据洗脱曲线，可以观察到不同大小的蛋白质在层析柱中的洗脱顺序。
通常，小分子蛋白质先被洗脱，而大分子蛋白质后被洗脱。
2. 蛋白质分离效果：通过比较不同洗脱峰的峰面积，可以评估凝胶过滤的分离效果。
峰面积越大，说明蛋白质含量越高，分离效果越好。
六、实验讨论1. 凝胶过滤是一种高效、简便的蛋白质分离纯化方法，广泛应用于生物化学和分子生物学领域。
2. 凝胶过滤的分离效果受到凝胶类型、柱径、流速等因素的影响。
在实际应用中，需要根据具体实验目的和样品特性选择合适的凝胶类型和操作条件。
3. 凝胶过滤可以与其他分离技术（如SDS-PAGE、电泳等）联合使用，进一步提高蛋白质的分离纯化效果。
柱层析实验报告
柱层析分离色素一、【实验目的】1．了解柱层析的分类，掌握各种柱层析的原理。
2．熟练掌握吸附层析的原理和操作技术。
二、【实验原理】叶绿体色素是植物吸收太阳光能进行光合作用的重要物质，主要有叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。
从植物叶片中提取和分离叶绿体色素是对其认识和了解的前提。
利用叶绿体色素能溶于有机溶剂的特性，可用95%乙醇或无水乙醇提取。
分离色素的方法有多种，如纸层析、柱层析等。
柱层析法是色谱法中的一种，它是根据混合物中各组分对固定相的吸附能力，以及对洗脱剂（即移动相）的溶解度不同将各组分分离。
常用的柱色谱有吸附色柱谱和分配柱色谱两类。
吸附柱色谱通常是在玻璃管中填入表面积很大，经过活化的多孔性物质或粉状固体作为吸附剂（如氧化铝或硅胶），当混合物的溶液流经吸附柱时，就被吸附在柱的上端，然后从柱顶加入溶剂（洗脱剂）洗脱。
由于不同化合物在吸附柱上的吸附能力不同，在同一溶剂中的溶解度也不同，因此各组分随溶剂以不同速度下移，形成色带。
继续用溶剂洗脱，吸附能力最弱的组分就随溶剂首先流出，整个层析过程进行反复的吸附-解析-再吸附-再解吸。
用柱层析法可以分别收集各组分，并逐个鉴定。
本实验是把三氧化二铝填入玻璃管中（压成柱状）作为吸附剂，将叶绿体色素的石油醚提取液倾于吸附柱上，色素即被吸附。
由于色素的种类不同，被吸附的强弱不同，就在吸附柱上排列成为不同的色层，再利用吸附剂在不同溶剂中有不同的吸附力，用不同的溶剂进行洗脱，从而达到叶绿体主要的4种色素（叶绿素a、叶绿素b、叶黄素、胡萝卜素）的分离。
三、【实验材料】原料：新鲜的菠菜叶试剂：1．无水乙醇或95%乙醇 5.三氧化二铝2．石英砂 6．饱和氯化钠溶液3．丙酮 7.水硫酸钠4．石油醚（60-90℃） 8洗脱液：丙酮：石油醚＝1：9 器材：层析柱（1×30cm），研钵，蒸馏装置，脱脂棉，天平，烧杯，过滤漏斗，玻璃棒，锥形瓶，分液漏斗，试管，铁架台四、【实验操作】1．色素的提取：20克菠菜，加少许石英砂，再加20毫升无水乙醇研磨成浆，脱脂棉过滤，保存滤液，滤渣再用无水乙醇提取一次，合并滤液，滤渣再加入30毫升石油醚提取一次，过滤，合并滤液，转移至分液漏斗中,再加入40毫升饱和氯化钠溶液震荡，弃去下层溶液，再分别加入20毫升水震荡洗涤几次，直至下层无色，保留上层溶液，转移至三角瓶中，加入无水硫酸钠干燥5分钟，备用. 2．样品的浓缩：将提取液放入蒸馏烧瓶中，蒸除多余的石油醚，至剩余液体5-8毫升左右，以备加样使用。
柱层析的实验方法和技巧
此外在采用TLC选择洗脱剂时还应注意：
第一，某种样品在这种展开剂中只显示一个点，并不等于在别的展开剂中也只显示一个点。因此在寻找展开剂时，多尝试几种比例不同，成分不同的展开剂。展开剂的极性太小，点分不开；极性太大，也分不开。
第二，点不能点得太浓，否则容易重叠，不易判断，因为如果两个点相近的话，一浓就变成一个点了。但也不能太淡，否则含量较少的成分可能斑点模糊或不显出斑点。点样时还应避免损伤薄层。
干法装柱是直接往柱子里填入硅胶，然后再轻轻敲打柱子两侧，至硅胶界面不再下降为止，然后再填入硅胶至合适高度，最后用油泵直接抽，这样就会使得柱子装的很结实（抽真空时间不要太长，以免柱子装的过实，流速过慢而导致扩散），接着是用淋洗剂“走柱子”。干法装柱较方便、快速且溶剂耗量少，但是其分辨率低、柱效差，故适于大量样品的粗步分离。在干发装柱时应注意：不要过分剧烈地震动和敲打侧壁，过分剧烈地震动和敲打侧壁会使得硅胶因自身粒径的不均匀性而产生柱子整体的不均匀。
而把固定相极性小于流动相极性的柱色谱方法称为反相柱层析，常用的流动相为甲醇、水等极性溶剂。较适宜分离极性较高的化合物。
二、凝胶层析——根据物质的分子大小进行分离
凝胶层析又称为凝胶过滤、分子筛层析等，是以具有网状结构的凝胶颗粒作为固定相，根据物质的分子大小进行分离的一种层析技术。常用的凝胶是葡聚糖凝胶（Sephadex)，如Sephadex LH-20。
分子筛层析的标准操作规程
分子筛层析的标准操作规程（编号：068）1、目的及适用范围分子筛层析（Gel filtration），排阻层析或凝胶渗透色谱，主要是根据混合物中各种分子的分子量不同，通过固定相凝胶时,分子的扩散速度各异，不同大小的蛋白分子得到分离和纯化的目的。
Superdex 200TM分离范围是10kd-600kd，Superdex 75TM分离范围是5kd-70kd。
2、主要仪器AKTA FPLC、Superdex 200TM层析柱或Superdex 75TM层析柱、冷冻台式高速离心机、真空抽滤泵、22μM微孔滤膜。
3、试剂及配置方法根据所纯化蛋白及所需条件配置适当的缓冲溶液，层析柱的ph耐受范围为3-12。
水、20%乙醇。
4、相关的预处理4.1 过分子筛所用的水及溶液在使用前必须用0.22μm微孔滤膜抽滤。
4.2 将所纯化蛋白用与分子筛所用的Buffer换液浓缩至不超过600μL。
5、操作步骤5.1 打开电脑，进入AKTA系统。
5.2打开AKTA电源，连接系统。
5.3进入UniCorn系统。
5.4用水洗A泵。
5.5设置层析柱的压力上限（不超过1.0MPa）及适当的流速。
5.6将Superdex 200TM层析柱或Superdex 75TM层析柱与FPLC连接。
5.7用至少1个柱体积的水冲洗层析柱。
5.8用至少1个柱体积的缓冲溶液平衡层析柱。
5.9将准备好的样品于4℃，12000rpm离心10-20min。
5.10在Load状态下通过上样环上样。
5.11在Inject状态下样品进入系统，并在2mL时调回Load状态。
5.11.1缓冲液（流动相）和样品流过柱子，分子进入不同的材料孔中。
小一些的分子移动的距离更139。
柱层析的实验方法和技巧
柱层析的实验方法和技巧
一、实验准备
1.确定分离范围：根据实验样品的特性，根据物质的碳氢键含量和碳氢键类型等因素，确定好分离范围，选择合适的柱层析系统；
2.柱层析仪的维护：柱层析仪的维护务必牢固，以免引起不必要的误差；
3.设置柱层析参数：设定最佳的柱层析参数，调整柱层析仪、柱和检测器等；
4.柱层析的校准：根据实验的要求进行色谱作图，校准各参数，确认实验的条件；
5.准备大量样品：准备满足实验所需样品，以便演示柱层析实验的稳定性。
二、实验操作
1.确定溶剂体系：确定最佳溶剂体系，以选择能够最佳溶解分离物质的溶剂；
2.样品准备：将样品以溶剂稀释为指定浓度，然后迅速注入柱层析器中；
3.运用柱层析技术：根据实验的要求，利用不同的柱层析方法，进行分离和对比；
4.结果记录：实验结果记录下来，可以参考色谱峰的高度、宽度等参数来比较。
三、实验技巧
1.控制实验条件：确定实验的温度、压力、流速以及实验时间，并尽可能守时，控制实验条件；
2.正确添加样品：正确添加样品，要注意不要堵塞柱。
柱层析实验操作规程及流程
一．实验目的1．了解柱层析的基本原理。
2．掌握柱层析的操作技术。
二．实验原理层析法是一种物理分离方法。
柱层析法是层析方法中的一个类型，分为吸附柱层析法和分配柱层析法。
本实验仅介绍吸附柱层析法。
吸附柱层析法是分离、纯化和鉴定有机物的重要方法。
它是根据混合物中各组分的分子结构和性质（极性）来选择合适的吸附剂和洗脱剂，从而利用吸附剂对各组分吸附能力的不同及各组分在洗脱剂中的溶解性能不同达到分离目的。
吸附柱层析法通常是在玻璃层析柱中装入表面积很大、经过活化的多孔性或粉状固体吸附剂（常用的吸附剂有氧化铝、硅胶等）。
当混合物溶液流过吸附柱时，各组分同时被吸附在柱的上端，然后从柱顶不断加入溶剂（洗脱剂）洗脱。
由于不同化合物吸附能力不同，从而随着溶剂下移的速度不同，于是混合物中各组分按吸附剂对它们所吸附的强弱顺序在柱中自上而下形成了若干色带，如图1所示。
在洗脱过程中，柱中连续不断地发生吸附和溶解的交替现象。
被吸附的组分被溶解吸出来，随着溶剂向下移动，又遇到新的吸附剂颗粒，把组分从溶液中吸附出来，而继续流下的新溶剂又使组分溶解而向下移动，这样经过适当时间移动后，各种组分就可以完全分开，继续用溶剂洗脱，吸附能力最弱的组分随溶剂首先流出，再继续加溶剂直至各组分依次全部由柱中洗出为止，分别收集各组分。
三．材料1．仪器 层析柱，烧杯，铁架台，长玻棒，小量筒，脱脂棉。
2．药品 硅胶 ，丙酮 ，石油醚。
3. 材料：菠菜叶。
四．方法1．装柱 取一支洁净干燥的层析柱玻管，自柱口塞入少许脱脂棉并用长玻棒推至柱底压平（塞时不宜太紧）。
然后用漏斗从柱口小心装入约5g 硅胶（100~160目）（四分之三高度，干法装柱），边装边用手指敲打层析柱，使填装紧密均匀。
再在柱顶加入一薄层脱脂棉花（约0.5cm 厚）。
将此层析柱固定在铁架台上。
2．加样 称取研磨研细的菠菜叶2.0~3.0g 于25mL 烧杯中，量取10mL 石油醚：丙酮=1:1（体积比）的混合液溶解浸泡，用封口薄膜封住杯口，浸泡10min,倒出浸出液静置分层，用刻度胶头滴管吸取1.0mL 上样分析，注意上样应沿管壁。
柱层析色谱实验操作
柱层析色谱实验操作
一、实验目的
本实验旨在通过柱层析色谱法，研究各体系组分在柱层析色谱上的分
离度，以及各组分的离子形态，检测样品中的物质组成，以及探究分离机理。
二、实验原理
三、实验条件
1、仪器设备：柱层析色谱仪
2、柱内吸附剂：疏水性助剂、疏水性吸附剂
3、色谱液：乙腈•0.1%磷酸
4、分析温度：30℃
四、实验步骤
1、安装柱：将柱子放置在柱层析色谱仪上，用安装螺丝将柱子固定，并且将柱子连接的色谱管与柱层析色谱仪的排气系统相连接。
2、柱头安装：将柱头安装在柱头安装的回转管上，并连接排气系统。
3、加入吸附剂：将疏水性助剂和疏水性吸附剂加入柱内，按照图谱
上的体系组分比例添加；
4、添加样品：将分析样品加入柱层析色谱装置内，并将样品压缩气
体混合强度安装在适当的位置。
中试分子筛层析柱
中试分子筛层析柱中试分子筛层析柱是一种重要的实验工具，用于分离和纯化混合物中的目标物质。
它利用分子筛材料的特殊吸附性能，能够有效地将混合物中的不同组分分离开来，达到目标物质的纯化和富集。
本文将详细介绍中试分子筛层析柱的原理、结构、使用方法以及注意事项，帮助读者更好地了解和使用这一实验工具。
中试分子筛层析柱的分离原理基于分子筛材料对混合物中不同组分的吸附选择性。
分子筛材料具有均匀且微细的孔道结构，能够根据不同组分的分子尺寸、形状、极性等特性进行选择性吸附。
通过调节分子筛的孔径和化学组成，可以实现对目标物质的高效富集和纯化。
中试分子筛层析柱通常由柱体、填料和进出口装置组成。
柱体由优质不锈钢制成，具有一定的强度和耐腐蚀性，能够承受一定的工作压力。
填料是分子筛材料，通常为颗粒状或颗粒状填料，能够提供大量的表面积和孔隙用于吸附分离。
进出口装置用于控制混合物的输入和目标物质的收集，确保层析过程的顺利进行。
四、使用方法1. 选择合适的填料：根据待分离混合物的特性选择合适的分子筛填料，考虑到目标物质的分子尺寸、形状和亲疏水性等因素。
2. 准备层析柱：将填料均匀放置在柱体中，注意保持填料层的均匀和紧密。
确保填料床高度合适，以充分利用分子筛的吸附性能。
3. 装入样品：将待分离的混合物按照一定的流速输入层析柱。
注意控制输入样品的浓度和流速，避免超出分子筛的吸附容量和速度。
4. 收集目标物质：通过调节流动相的组成、流速和波峰切割等方式，将目标物质以适当的时间和顺序从层析柱中收集。
五、注意事项1. 填料均匀：保持填料层的均匀和紧密，避免产生空隙和堵塞现象，以免影响分离效果。
2. 控制流速：注意控制输入样品的流速，避免高速流过导致目标物质无法完全吸附和分离。
3. 浓度适宜：根据目标物质的浓度范围，在层析过程中调整样品浓度，避免过高或过低的浓度对分离效果产生不利影响。
4. 波峰切割：合理设置流动相的组成和流速，以保证目标物质能够被完全收集，减少杂质的干扰。
柱层析实验报告
一、实验目的1. 了解柱层析的基本原理和操作技术。
2. 掌握利用柱层析分离植物叶片中叶绿素的方法。
3. 通过实验，加深对植物叶绿素成分和结构的认识。
二、实验原理柱层析是一种利用固定相和移动相之间的相互作用，将混合物中的组分进行分离的技术。
本实验采用吸附柱层析法，利用叶绿素能溶于有机溶剂的特性，将植物叶片中的叶绿素提取出来，并通过吸附剂（如氧化铝或硅胶）的吸附作用，使不同成分的叶绿素在柱层析柱中分离。
三、实验材料与仪器1. 材料：新鲜植物叶片、无水乙醇、硅胶、氧化铝、洗脱剂（如乙酸乙酯）、层析缸、毛细管、烧杯、玻璃棒、滤纸、剪刀、镊子等。
2. 仪器：柱层析柱、抽滤瓶、电子天平、移液器、显微镜等。
四、实验步骤1. 提取叶绿素：将新鲜植物叶片剪碎，加入无水乙醇，用玻璃棒充分研磨，使叶绿素充分溶解。
过滤，收集滤液。
2. 准备柱层析柱：将硅胶或氧化铝均匀铺在柱层析柱底部，用玻璃棒轻轻压紧。
3. 加入样品：用移液器将提取的叶绿素滤液加入柱层析柱，待滤液自然流出。
4. 洗脱：在柱层析柱顶部加入适量洗脱剂，待洗脱剂自然流出。
观察并记录不同颜色成分的流出顺序。
5. 收集分离的叶绿素：将收集到的各组分分别倒入烧杯中，用无水乙醇洗涤，过滤，干燥，得到分离的叶绿素。
五、结果与分析1. 通过柱层析实验，成功分离出植物叶片中的叶绿素，观察到四种主要成分：叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素。
2. 根据实验结果，叶绿素a和叶绿素b在柱层析柱中的吸附能力较强，先被洗脱出来；胡萝卜素和叶黄素吸附能力较弱，后被洗脱出来。
3. 通过观察分离得到的叶绿素，可以进一步了解植物叶片中叶绿素的成分和结构。
六、实验总结1. 通过本次实验，掌握了柱层析的基本原理和操作技术，为今后进行相关实验奠定了基础。
2. 柱层析是一种有效分离混合物中各组分的色谱技术，广泛应用于植物化学、药物分析等领域。
3. 在实验过程中，注意操作规范，确保实验结果的准确性和可靠性。
凝胶过滤层析
【实验目的】掌握凝胶过滤层析的原理及操作方法【实验原理】凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。
是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。
层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，小分子物质能进入其内部，流下时路程较长，而大分子物质却被排除在外部，下来的路程短，当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。
1、器材：核酸蛋白检测仪、层析柱、水浴锅、真空泵2、试剂：SephadexG-25【实验步骤】（1）凝胶的选择：在经过膜分离后，分子量<5000。
本次实验选用G-25葡聚糖凝胶（分离范围1000-5000）。
（2）柱子的选择：分子量<5000，膜分离后玉米肽中不同的小肽分子量比较接近，属于分级分离，所以选用50*1.6规格的柱子。
（3）干凝胶用量的计算：柱子体积/膨胀度，G-25膨胀度是4~6。
（4）凝胶的预处理：将干胶颗粒悬浮于5-10倍量的蒸馏水或洗脱液中充分溶胀，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去。
可以用玻璃棒搅拌，但是不能剧烈，防止凝胶破裂。
多洗几次，尽量洗干净。
自然溶胀费时较长，加热可使溶胀加速，即在沸水浴中将湿凝胶浆逐渐升温至近沸，1-2小时即可达到凝胶的充分胀溶。
充分溶胀后，进行真空脱气。
（5）洗脱液的选择：本实验采用蒸馏水做洗脱液。
（6）凝胶的填充：将层析柱与地面垂直固定在架子上，然后将处理好的凝胶倒入柱子里，不能有气泡，要防止干柱。
（7）柱平衡：装柱完成后，用洗脱液来平衡柱子，直至核酸蛋白检测系统基线保持水平半个小时以上。
（8）上样：上样量在5%~10%。
（9）标准曲线的制作：本次实验用到还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、杆菌肽（氧化型谷胱甘肽（GSSG），M=612.63；还原型谷胱甘肽（GSH），M=307.33；杆菌肽M=1422.69）。
三种肽各称取0.03g 配成2ml，进行层析，在恒定流速下进行凝胶过滤层析。
分子筛层析
抗体的纯化
基本原理
分子筛层析（molecular sieve chromatofraphy），它 是在1960年后发展出来的技术。 凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，內部具有网状 筛孔，利用球状凝胶內的筛孔，使分子流过填充凝胶的 管柱时，大分子无法进入凝胶筛孔，而只流经凝胶及管 柱间的孔隙，很快就可以流出管柱，较小的分子因为进 入凝胶內的筛孔，故在管柱內的停留时间较长，由此区 分大小不同的分子，亦可与已知大小的分子作比较而定 出一分子的分子量。一般状況下，凝胶不会吸附成份， 所有欲分离物质都会被洗出，这是凝胶层析法与其它层 析法不同的地方。
凝胶准备；根据样品的种类与容量及柱管的比差， 确定柱床体积。例如蛋白质样品5毫升，约需30倍的 柱床；柱管内径2厘米，柱床高度宜在内径20倍以上， 大致要50厘米。按求积公式计算 Vt=πγ·h=3.1416×12×50=157.08 Vt—柱床体积； π—圆周率； γ一半径 h—柱床高。
管柱的选择
实验材料 目前常用的凝胶： 目前常用的凝胶： Sephadex 能迅速在水和电解质溶液中膨胀，在碱性 的环境中十分稳定。Sephadex依其吸水量 有不同型号，如 G-25、G-75、G-100或是 G-200，G 后面的数字为凝胶吸水量再乘 以10，以G-25为例，表示1克干燥的G-25 凝胶可以吸水2.5 ml 。
凝胶用量 G—50 （g） 1.0 2.0 4.0 4.0 8.0 14.0 20.0 20.0 35.0 50.0 110.0 G—100 （g） 0.6 1.2 2.5 2.5 5.0 9.0 12.5 12.5 20.0 30.0 70.0 G—200 （g） 0.3 0.6 1.21 1.2 2.4 4.4 6.0 7.0 12.0 17.0 35.0
分子筛柱层析实验
4、样品准备与加样 将浓缩好的蛋白质样品2ml进行加样。加样操作十分关
键，因为样品的不必要稀释或样品进入凝胶床不均一都能导 致区带过宽，从而影响分辨力。在洗脱剂刚刚排干（刚看不 见洗脱剂的液面）时，轻轻的将样品加在凝胶表面，注意不 要碰坏凝胶表面。加样后打开柱出水口使样品完全渗入凝胶 床，再如上方法加上2次小体积的洗脱剂。上述过程作好后 立即在凝胶床上加入几厘米高的洗脱剂，然后与恒流泵及洗 脱液贮槽相联接，进行洗脱
凝胶过滤柱层析所用的基质是具有立体网状结构、 筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。这种物质可以完 全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而对某些 小分子化合物则不能排阻，可让其在筛孔中自由扩散、 渗透。任何一种被分离的化合物被凝胶筛孔排阻的程度 可用分配系数KAV（被分分配系数离化合物在内水和外水 体积中的比例关系）表示。值的大小与凝胶床的总体积 （Vt）有关、外水体积（Vo）及分离物本身的洗脱体积 （Ve）有关，即：
2、装柱 将平衡好的Sephadex G-75凝胶浆的稀稠度调节到有
利于灌装，然后抽真空排除凝胶浆中溶解的空气。将柱子固 定在坚固不动的支架上，并用铅垂线使其垂直。向柱子中充 满缓冲液，检查其是否漏水，柱出液口应打开以排除里面的 气泡，然后将柱出口关闭，使柱中洗脱剂的体积约占柱总体 积的15%。将平衡好的凝胶浆徐徐灌入柱内，灌时避免产生 气泡。
剂检测NH4+的存在。直至流出液中不再有NH4+为止。短时 间保存，可将凝胶柱放在4℃冰箱中。
五、注意事项
1、根据层析柱的容积和所选用的凝胶溶胀后柱床容 积，计算所需凝胶干粉的重量，用洗 脱缓冲液使其充分溶胀。
2、层析柱粗细必须均匀，柱管大小可根据试剂需要 选择。一般来说，细长的柱分离效果较好。若样品量多， 最好选用内径较粗的柱，但此时分离效果稍差。柱管内径 太小时，会发生“管壁效应”，即柱管中心部分的组分移 动慢，而管壁周围的移动快。柱越长，分离效果越好，但 柱过长，实验时间长，样品稀释度大，分离效果反而不好 。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
2、装柱 将平衡好的Sephadex G-75凝胶浆的稀稠度调节到有
利于灌装，然后抽真空排除凝胶浆中溶解的空气。将柱子固 定在坚固不动的支架上，并用铅垂线使其垂直。向柱子中充 满缓冲液，检查其是否漏水，柱出液口应打开以排除里面的 气泡，然后将柱出口关闭，使柱中洗脱剂的体积约占柱总体 积的15%。将平衡好的凝胶浆徐徐灌入柱内，灌时避免产生 气泡。
5、洗脱与收集 柱的洗脱借助恒流泵进行，洗脱速度为0.5ml/min，
用部分自动收集器收集，每5min转换一个试管，用波长为 280nm的紫外检测仪进行检测 。检测结果用台式记录仪记 录，走纸速度为6cm/hr。将洗脱峰分别合并，然后测定酯 酶活力和蛋白质浓度。
6、柱的再生与保存 蛋白峰出现后，再用大量洗脱剂洗凝胶柱。用钠氏试
在限定的的层析条件下，Vt和Vo都是恒定值，而Ve值 却是随着分离物相对分子质量的变化而变化的。分离物相 对分子质量大，值小；反之，则值增大。
三、试剂与器材
待分离蛋白质样品：须经过透析出去硫酸氨并进行适 当的浓缩。
0.1M磷酸氢钠缓冲液（PH7.0） Sephadex G-75；高速离心机，型号为TGL-6B；低 速离心机，型号为800型；核酸蛋白检测仪，型号为HD88-5AⅢ；蛋白自动部分收集器，型号为BSZ-100；台式记 录仪。
四、实验方法
1、凝胶与柱的选择 根据待分离蛋白质的分子量选择相应规格的凝胶，例
如分子量为67KD可选择Sphadex G-75凝胶。层析柱长100cm ，直径2 cm。
2、洗脱剂与凝胶的准备 凝胶色谱层析材料不受大多数缓冲液的影响，因此凡
是对分离样品稳定的缓冲液都可以作为洗脱剂。称取2０g Sephadex G-75凝胶颗粒，放入过量的蒸馏水中，浸泡１ ０小时，使之充分膨胀，然后将极细小颗粒倾泻除去（重 复此操作数次），然后用缓冲液充分平衡否 则容易造成漏气、漏液。
4、装柱要均匀，不要过松也不要过紧，最好也在要求 的操作压下装柱，流速不宜过快，避免因此而压紧凝胶。 但也不要过慢，使柱装得太松，导致层析过程中，凝胶床 高度下降。
5、始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分挥发 ，凝胶变干。
4、样品准备与加样 将浓缩好的蛋白质样品2ml进行加样。加样操作十分关
键，因为样品的不必要稀释或样品进入凝胶床不均一都能导 致区带过宽，从而影响分辨力。在洗脱剂刚刚排干（刚看不 见洗脱剂的液面）时，轻轻的将样品加在凝胶表面，注意不 要碰坏凝胶表面。加样后打开柱出水口使样品完全渗入凝胶 床，再如上方法加上2次小体积的洗脱剂。上述过程作好后 立即在凝胶床上加入几厘米高的洗脱剂，然后与恒流泵及洗 脱液贮槽相联接，进行洗脱
凝胶过滤柱层析所用的基质是具有立体网状结构、 筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。这种物质可以完 全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而对某些 小分子化合物则不能排阻，可让其在筛孔中自由扩散、 渗透。任何一种被分离的化合物被凝胶筛孔排阻的程度 可用分配系数KAV（被分分配系数离化合物在内水和外水 体积中的比例关系）表示。值的大小与凝胶床的总体积 （Vt）有关、外水体积（Vo）及分离物本身的洗脱体积 （Ve）有关，即：
剂检测NH4+的存在。直至流出液中不再有NH4+为止。短时 间保存，可将凝胶柱放在4℃冰箱中。
五、注意事项
1、根据层析柱的容积和所选用的凝胶溶胀后柱床容 积，计算所需凝胶干粉的重量，用洗 脱缓冲液使其充分溶胀。
2、层析柱粗细必须均匀，柱管大小可根据试剂需要 选择。一般来说，细长的柱分离效果较好。若样品量多， 最好选用内径较粗的柱，但此时分离效果稍差。柱管内径 太小时，会发生“管壁效应”，即柱管中心部分的组分移 动慢，而管壁周围的移动快。柱越长，分离效果越好，但 柱过长，实验时间长，样品稀释度大，分离效果反而不好 。
柱装好后停10min，然后将出口打开，使过量的洗脱剂 排出。当洗脱剂在胶面上2—5cm时，将出口关闭。如需继 续装柱，应将凝胶表面均匀搅拌，然后继续装柱。将恒压 洗脱剂贮瓶与柱入口相联，开始时流速不断下降，逐渐稳 定下来。
检查装柱是否均匀，如柱中出现气泡等暇疵，要重新 装柱。剪一圆形滤纸片放在凝胶表面。
分子筛柱层析实验
一、实验目的：
1、了解凝胶柱层析的原理及应用。 2、掌握凝胶柱层析的基本操作技术。
二、实验原理
凝胶层析又称凝胶过滤，是一种按相对分子质量大小 分离物质的层析方法。该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒 的层析柱中，然后用缓冲液洗脱。大分子不能进入凝胶颗粒 中的静止相中，只留在凝胶颗粒之间的流动相中，因此以较 快的速度首先流出层析柱，而小分子则能自由出入凝胶颗粒 中，并很快在流动相和静止相之间形成动态平衡。因此，就 要花费较长的时间流经柱床，从而使不同大小的分子得以分 离。