抗体的分离纯化原理和测定优秀课件

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硫酸铵浓溶液的pH常在4.5—5.5之间，市售
的硫酸铵还常含有少量游离硫酸，pH往往在4.5
以下，需用氨水调节其pH至7.0左右。
(三)盐析时需注意的问题
• 1. 盐的饱和度
• 盐的饱和度是影响蛋白质盐析的主要因素， 不同蛋白质的盐析要求盐的饱和度不同。分离 几个混合组分的蛋白质时，盐的饱和度常由低 到高逐渐增加，每出现一种蛋白质沉淀进行离 心分离后，再继续增加盐的饱和度，使第二种 蛋白质沉淀。如用硫酸铵盐析分离血浆蛋白， 当饱和度达20％时，纤维蛋白原首先析出；饱 和度增至28％—33％时，优球蛋白析出；饱和 度达33％—50％时，球蛋白析出；饱和度大于 50％以上时，清蛋白析出。免疫球蛋白常在饱 和皮为33％开始析出。
• 可依据抗体的特性进行分离纯化： 据蛋白质疏水性的差异，以盐析的方法
将抗体与其他蛋白分开；据抗体带有电荷 的不同，用离子交换，电泳等技术分离….. 按分离方法： 沉淀、盐析、膜技术、电泳、色谱等。其 中只有电泳和色谱法可以将抗体精细分离 即纯化。
一、盐析法
• （一）原理
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蛋白质的溶解度在一定范围内随盐的浓度变
抗体的分离纯化原 理和测定
第一节 抗体的分离纯化
• 无论是将抗体用于研究还是用于检测 或临床治疗，均需对抗体进行分离与纯化。
• 分离：将抗体从其存在的体液或培养液 中分离出来并加以初步纯化。
• 纯化： 提高分离出来的抗体的纯度，并 将其中的杂质控制在所需的低水平。对治 疗性抗体尤为重要。
分离纯化的方法
• 2．截留分子量
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超滤膜的另一基本性能是标称截留分子量。
它的定义是指溶液中被截留的溶质中最小的分子
量。对于“截留分子量”这个指标，不应做机械
式的理解。例如，使用截留分子量5万的膜时， 分子量68万的牛血清白蛋白也可通透过去。这是
因为，一方面，膜上的孔的大小是不均匀的，一
般情况下，有一个孔径分布。另一方面，由于分
• ②蛋白质分子呈球形者其截留特性优于呈 线性者。因此，应注意厂家给出的截留分 子量是何种物质为样品所测定。一般情况 下，裁留率顺序为 ：球蛋白>支链高聚物> 直链(线型)高聚物。
• ③厂家给出的截留分子量是以单一蛋白质 (或水溶性大分子)为样品所测定的。但是， 实际样品往往极为复杂，如体系中有多种 蛋白质存在时，膜的特性会因为浓差极化 现象、‘‘凝胶层的形成”以及样品间形 成复合物等现象而有所改变。
二、膜分离技术
• 可以形象地将膜分离技术比喻成以多 孔膜进行过滤或过筛子的过程。在实际操 作时，由于膜上的孔很小，需使用一定的 压力，才能将含有待分离物质的液体驱动 通过分离膜，使具有不同分子量的物质或 通过膜、或截留于膜上而得到分离。有多 种膜技术可用于抗体的分离与纯化。
• 但最基本的是使用超滤膜。超滤膜的孔径 在1—100nm之间，其截止到分子量的范围 为几百至一百万，所需的驱动压力在0.1— 1.0MPa左右。
子的形状不同且分子链具有柔性，分子量相同的
线型分子和球型分子的透过率是不同的，线型分
子更容易透过。通常，厂家给出的截留分于量指
ห้องสมุดไป่ตู้
的是截留率90％时，相对应的蛋白质(或其它水
溶性高聚物)的分子量。在实际使用时应注意以 下几个问题：
• ①一般超滤膜的截留分子量曲线多呈S形 (如图8-1)。S形透过率曲线的线性部分越陡， 则截留性能亦越佳。
质分子相互聚集而沉淀。盐析法就是根据不同蛋
白质在一定浓度的盐溶液中溶解度不同面达到彼
此分离的方法。
（二）盐的选择
• 蛋白质盐折常用中性盐，主要有硫酸铵、硫 酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中应用最 广的是硫酸铵，其优点是温度系数小，溶解度大 (25℃时饱和溶解度为4.1mol/L，即767g/L)。在不 同饱和度的硫酸铵溶液内，不同蛋白质依次析出， 而且硫酸铵价廉易得，分段效果好，不容易引起 蛋白质变性。
化而变化。在低盐浓度下溶解度随着盐浓度升高
而增加，当盐浓度达到一定水平时，其溶解度又
以不同程度下降并先后析出。其原理是由于蛋白
质分子的极性基团有着静电引力，当水中加入少
量盐类时，盐类离子与水分子对蛋白质分子上的
极性基团的影响，使蛋白质在水个溶解度增大。
但盐浓度增加到一定程度时，水的活度降低，蛋
白质表面的电荷被中和，水化膜破坏，致使蛋白
(一)超滤膜的基本性能
• 作为膜分离材料，超滤膜的基本性能可 以用透水率和截留分子量加以表征。
• 1．透水速率 在一定的驱动压力下，单 位面积的膜在单位时间里所能透过的水的 量称为该膜的进水率(Jf)。
• 式中Jf为进水率，ρ为渗透系数，ΔP为压力 差， Δπ是料液的渗透压差，ι是透过水流通 道的长度，它正比于膜的厚度。通常情况 下，由于Δπ很小，所以可以忽略不计、此 时，透水率可简化表达为
• 即透水率与操作压力成正比，与膜厚呈反 比。由于膜在使用过程中会发生污染和孔
结构的改变，因而在使用过程中，其透水
率会逐渐发生变化。所以定义其初始运水 量Qz和稳定透水量Qs之比为稳定系数Sm， 即
• 一般情况下，Sm=0.6-0.8, 不同规格和品种 的膜的透水率相差很大。同时，不同的操 作条件与参数，也会对实际透水量产生影 响，这些参数包括操作压力、料液流速、 温度以及料液的性质等。一般情况下，在 膜使用的开始和结束时，可以实际测定一 下透水率。当透水率已经降低时，应考虑 将其清洗并再生，以恢复其透水率。
• 4．温度
• 出于高浓度的盐溶液对蛋白质有一定保 护作用，盐析操作一般可在室温下进行， 但在使用某些中性盐进行盐析时，温度对 盐溶解度的影响比较明显。
• 5. 脱盐
• 蛋白质用盐析沉淀分离后，常需脱盐 才能获得纯品。最常用的脱盐方法是透析。 通过透析袋内外的离子交换，最后使透析 袋内溶液的盐浓度与外界相一致。当然， 也可以使用凝胶过滤或超滤的方法除盐。
• 2. pH 在等电点时，蛋白质溶解度最 小．容易沉淀析出。因此，盐析时除个别 特殊情况外，pH常选择在被分离的蛋白质 等电点附近。
• 3. 蛋白质浓度 在相同盐析条件下，蛋白 质浓度越高越易沉淀，高浓度虽对沉淀有 利，但浓度过高，也容易引起其它蛋白质 的共沉淀，因此，必须选择适当浓度，尽 可能避免共沉淀作用的干扰。