第五章 植物离体快速繁殖和脱病毒技术

• (3)诱导胚状体形成
• 是由植物器官、组织和细胞培养直接发生类胚结构， 最后以肧状体成苗的方式。在组织培养条件下胚状体 的发育过程类似于合子胚的发育：细胞经脱分化后， 发生持续细胞分裂增殖，并依次经过原胚期、球形胚 期、心形胚期、鱼雷形胚期和子叶期，进而成为成熟 的胚状体。
• 肧状体途径优点是增值率高，同时具胚根和胚芽，免 去生根一步；可用于制作人工种子，便于运输和保存。 缺点是肧状体成苗率低，遗传性状不稳定。
② ③义：当植物材料不断地进行离体繁殖时， 有些培养物的嫩茎、叶片往往会呈半透明水 渍状，这种现象通常称为玻璃化。 特点：外观形态有明显异常；体内含水量、 矿质元素、糖类、纤维、蛋白质等基本成分 含量有变化，一些酶活和内源激素含量有变 化。
•
① ②
影响玻璃化苗发生的因素：
• （三）电子显微镜鉴定法
由于人的眼睛难以观察小于0.1mm的微粒，所以只
有通过电子显微镜才能分辨0.5μm大小的病毒颗粒。 这样采用电子显微镜既可以直接观察病毒，检查出有 无病毒存在，了解病毒颗粒的大小、形状和结构，又 可以鉴定病毒的种类。这是一种较为先进的方法，但 需一定的设备和技术。
这一方法的优点是灵敏度高和能在植物粗提取液 中定量测定病毒。
• 5.2.1 脱除植物病毒的方法 • （1）物理方法：X射线、紫外线、超短 波、热处理等。
热处理，原理是当植物组织处于高于正 常温度的环境中时，组织内部的病毒受热之后 部分或全部钝化，在高温下，不能生成或生成 病毒很少，这样持续一段时间，病毒自行消灭， 从而达到脱毒的目的。
① 温水浸渍处理 适用于休眠器官、剪下的接穗或种植 的材料，在50℃左右的温水中浸渍10min至数小时， 方法简便易行，但易使材料受伤。 ② 热空气处理 热空气处理对休眠组织和活跃生长的茎 尖效果较好，将生长的盆栽植株移入温热治疗室(箱) 内，一般在35—40℃。处理时间因植物而异，短则几 十分钟，长可达数月。 • 热处理方法主要缺陷是并非能脱除所有病毒，因此热 处理需与其他方法配合应用，才可获得良好的效果。
嫁接法：指示植物作砧木，被鉴定植物芽作接穗。
（二）免疫学方法 ① 抗血清(antisemm)鉴定法 用已知抗血清可以鉴定未知病毒的种类。 这种抗血清就是高度专一性的试剂，这 种方法特异性高，测定速度快，一般几 小时甚至几分钟就可以完成。所以抗血 清法成为植物病毒鉴定中最有用的方法 之一。
② 酶 联 免 疫 鉴 定 法 (Enzyme linked immunity absorption assay ELISA) 酶联免疫法是指采用酶标记抗原或抗体 的定量测定法。将抗原固定在支持物上，加 入待检血清，然后加入酶(过氧化物酶或碱性 磷酸酶)标记的抗体，使待检血清中与对应抗 原的特异性抗体结合，最后用特殊分光光度 计测定。此法是现在灵敏度较高和常使用的 方法。
方法：在进行脱毒培养时，由于微小的茎尖组织 很难靠肉眼操作，因而需用带有适当光源的简单解剖 镜(8—40倍)。在切取外植体之前一般须对茎芽进行表 面消毒。叶片包被严紧的芽，如菊花、兰花，只须在 75%酒精中浸蘸一下，而叶片包被松散的芽，则要用 0.1%次氯酸钠表面消毒10min。 将接种好的茎尖臵于22℃左右的温度下。每天以 16h 2000—30001x的光照条件下培养。

• （2）诱导不定芽形成
不定芽：从任何除现有芽之外的器官和组织上通过器官 发生重新形成的芽叫不定芽。 通常采用从器官中直接产生不定芽：A 有些植物具有从 各个器官上长出不定芽的能力如矮牵牛、福禄考、悬钩 子等。B 在离体培养条件下，培养基中提供连续不断植 物激素的供应，使植物形成不定芽的能力被大大地激发 起来。C 在许多常规方法中不能产生不定芽的种类，在 试管条件下却能较容易地产生不定芽，如柏科，松科， 银杏等一些植物。
• 5.2.2 脱病毒植株的鉴定 • （一）指示植物(indmatingplant)法
•
利用病毒在其他植物上产生的枯斑作为鉴别病毒 种类的方法。 摩擦接种法：最早是美国的病毒学家Holmes 1929年发 现的。他用感染TMV的普通烟叶的粗汁液和少许金刚砂 相混合，然后在烟叶子上摩擦，2—3d后叶片止出现了 局部坏死斑。这种方法条件简单，操作方便，故一直 沿用至今，
Fig. 4-2 Details of the interaction of various IAA concentrations with GA3 （A） and GA3 + BAP （B） on the growth and microtuberization of potato explants.
（四）分子生物学方法
具有快速、简便、灵敏度高、特异性强等特点。
核酸杂交技术
PCR技术
基因芯片技术
以马铃薯茎尖脱毒培养为例
图1-1 脱（无）毒试管苗生产程序
茎尖繁殖试管苗切断到试管薯繁殖过程
图4-2 不同浓度IAA与GA（A）、GA+BAP（B）互作对试管苗生长及试 管薯形成的影响
④连续转接 对容易褐变的材料可间隔12~24h的培养 后，再转移到新的培养基上，这样经过连续处理7-l0d 后，褐变现象便会得到控制或大为减轻。
5.1.2 培养物的增殖 （1）促进腋生分枝

促进腋芽的形成和生长：使用外源的细胞分裂素可以打破 顶端优势，促进腋芽生长，形成芽丛，经反复切割和继代 培养，可短期获得大量芽。有些植物即使在含有细胞分裂 素的培养基中其项端优势也不易被打破，接种的茎尖只能 长成不分枝的一根枝条，此时可以用切段法（每个切段带 有一个腋芽）加以繁殖。 这种繁殖方式不经过发生愈伤组织而再生，所以是最能使 无性系后代保持原品种遗传特性的一种繁殖方式。
5.1.5 快速繁殖中应注意的问题
（1）遗传稳定性
①
外植体的来源：不同种、同一种的不同品种以及同一植 株的不同器官发生变异频率不同。 继代培养：继代培养的时间和次数是造成变异重要因素。 再生植株发生方式：茎芽直接增殖、外植体直接形成不 定芽方式或愈伤组织诱导不定芽方式，变异率依次增强。 植物生长物质：是诱导变异的重要原因之一。
（4）防止褐变：外植体褐变是指在接种后，其表面开 始褐变，有时甚至会使整个培养基褐变的现象。它的 出现是由于植物组织中的多酚氧化酶被激活，将酚类 化合物氧化成醌类物质，它们多呈棕褐色，会抑制其 它酶的活性，从而影响所接种外植体的培养。
褐变的主要原因
①植物种类和基因型 由于多酚氧化酶活性上的差异， 不同品种间的褐变现象是不同的。 ②取材部位和生理状态 处于幼龄期的植物材料褐变 程度较浅，而从已经成年的植株采收的外植体，由于 含醌类物质较多，因此褐变较为严重。 ③培养基成分 无机盐浓度过高、细胞分裂素的水平 过高等都会刺激某些外植体的多酚氧化酶的活性，从 而使褐变现象加深。 ④培养条件不当 如果光照过强、温度过高、培养时 间过长等，均可使多酚氧化酶的活性提高，从而加速 褐变程度。
月季快速繁殖
5.2 无病毒植物的培养
• 病毒的危害 给植物生产带来的损失是很大的， 造成减产、品质变劣等严重后果。如草莓病毒 的危害，使草莓产量严重降低，品质大大退化。 葡萄扇叶病毒使葡萄减产l0%-18%，为害马铃 薯的病虫害则更多，花卉病毒的危害一般会影 响花卉的观赏价值等。 • 无病毒苗培育的意义 用组织培养方法生产无 毒苗，排除了使用药剂，所以对减少污染，防 止公害，保护环境都有积极的意义。
• 快速繁殖过程一般包括四个阶段，即无菌 培养物的建立、芽的增殖、诱导生根和试 管苗的驯化和移载。
5.1.1 无菌培养物的建立 初代培养：进行离体繁殖时首先必须建立的无菌培养 物。需注意以下几点： （1）保证无菌：外植体、培养基、培养室无菌状态。 （2）条件合适：合适的外植体；合适的培养基；适宜 的培养条件。 （3）技术过关：要熟练掌握无菌操作技术。
减轻褐变现象发生的方法
①选择合适的外植体 一般来说，最好选择生长处于 旺盛的外植体，这样可以使褐变现象明显减轻。 ②合适的培养条件 无机盐成分、植物生长物质水平、 适宜温度等均可以减轻材料的褐变现象。 ③使用抗氧化剂 在培养基中，使用半胱氨酸、抗坏 血酸、PVP等抗氧化剂能够减轻很多外植体的褐变现象。 另外，使用0.1%-0.5%的活性炭对防止褐变也有较为明 显的效果。
培养材料：材料种类和外植体不同都有影响。 环境因素：液体培养比固体培养更易玻璃化；蔗糖 浓度与玻璃化呈负相关；通气不良；温度过高等都 可导致玻璃化。 培养基成分：铵离子过多可致玻璃化；6-BA浓度与 玻璃化呈正相关等。
③
• 控制玻璃化苗的措施： 采用固体培养，提高蔗糖含量 通气，适当提高光强，控制温度 降低培养基中NH4+和细胞分裂素浓度 其它措施
第5章 植物离体快速繁殖和 脱病毒技术
5.1 植物快速繁殖技术 5.2 无病毒植物的培养
5.1 植物快速繁殖技术
• 概念：所谓快速繁殖，就是将外植体在人工培养基和合适 的条件下进行培养，以在短期内获得大量遗传性一致的个 体的方法。 • 特点：繁殖速度快；使用材料少，生产效率高，省时省工； 可大量繁殖脱毒苗；利于种质资源的保存和交换等；节约 空间，不受季节限制，有利于植物的工厂化生产；在无菌 条件下进行，不受病虫害侵害。
为提高小植株的光合能力，可将光强度增加到 3000-10000lux。
5.1.4 试管苗的驯化和移栽 • 驯化或炼苗：为了适应移栽后较低湿 度和较高光强等环境条件，能顺利进行 自养，必须有一个逐步锻炼和适应的过 程，这个过程叫驯化或炼苗。
• 移栽前的练苗
• 移栽前可将培养物不开口移到自然光照下锻炼 2—3d，让试管苗接受强光的照射，或培养基 中加入矮壮素等生长延缓剂等。使苗长得壮实 起来，然后再开口练苗1—2d，经受较低湿度 的处理，以适应将来自然湿度的条件。
5.1.3 诱导生根
MS、B5、White等培养基，都可用于诱导生根，但 是其含盐浓度要适当加以稀释，它们都抑制根的发生。 应将它们降低到1／2，1／3或1／4，甚至更低的水平。 生根培养基适当加大生长素的浓度，不用或少用 细胞分裂素，生长素浓度在1-10mg/l，使用较多的是 NAA，其次为IAA和IBA。 培养基中蔗糖的浓度降低到1.0-1.5%，以增强植 株的自养能力。培养基不宜过硬以免影响生根。