浅析植物离体快繁过程中常见的问题

目录摘要 (1)关键词……………………………………………………………………………………………1 Abstract……………………………………………………………………………………………1 Keywords (1)1 污染 (2)1.1 污染的种类 (2)1.2 污染的因素 (2)1.2.1 外植体本身 (2)1.2.2 外植体灭菌 (2)1.2.3 接种和培养环境 (3)2 褐化 (3)2.1 褐化原因 (3)2.2 影响褐变的因素 (3)2.3 防止褐变的方法 (4)2.3.1 外植体的选择 (4)2.3.2 适宜的培养基和培养条件 (4)2.3.3 加入抗氧化剂和吸附剂 (4)2.3.4 反复转接 (4)3 玻璃化 (4)3.1 玻璃化苗的特点与发生原因 (4)3.1.1 玻璃化苗的特点 (4)3.1.2 发生原因 (4)3.2 影响玻璃化苗的因素 (5)3.2.1 生长调节剂 (5)3.2.2 温度 (5)3.2.3 湿度 (5)3.2.4 消毒方法 (5)3.2.5 光照时间 (5)3.2.6 培养基 (5)3.2.7 继代次数 (5)4 其他常见问题及其解决措施 (5)4.1 初始培养阶段 (5)4.2 继代培养阶段 (6)致谢 (7)参考文献 (7)浅析植物离体快繁过程中常见的问题摘要探讨了影响了植物组织培养的主要因素，分析了污染、褐变、玻璃化及其他常见问题，并提出了解决措施。

认为：污染主要是由灭菌不彻底和环境不洁造成的，加强外植体和培养基的灭菌，对培养环境及其用具彻底消毒，可大大降低污染率。

植物品种、取材部位及环境条件与褐变的发生密切相关，选择适宜的外植体，进行外植体，调价抗氧化剂和吸附剂等可有效控制褐变。

培养基的种类、温度、通气状况等会影响玻璃苗的发生，选择适当培养基，降低温度，增强光照，改善通风等可使玻璃化率降低。

关键词组织培养；污染，褐化，玻璃化According to the rapid propagation process of in vitro incommon problemAbstractDiscusses the influence of the main factors of plant tissue culture, this paper analyzes the pollution, Browning, vitrification and other common problems, and proposes the measures. Think: pollution is mainly composed of sterilization is not complete and the environment caused by the unclean, strengthen the explant and culture medium sterilization for training environment and its appliance disinfection, can greatly reduce the rate of pollution. Plant variety, based site and environment and the occurrence of Browning closely related, the choice of appropriate explant, explant, introduce antioxidants and adsorbent, etc can effectively control the Browning. The kinds of culture medium, temperature and ventilation situation will influence the occurrence of glass seedlings, choose proper culture medium, reduce the temperature, and enhance the illumination, improve ventilation can make glass transition rate to decrease.KeywordsTissue culture; Pollution, Browning, vitrificatio1 污染污染是指在培养过程中由于外界真菌、细菌或植物材料的内生菌所侵染，从而使培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败。

1.1 污染的种类○1真菌真菌性污染主要指霉菌引起的污染，表现为培养基污染部位发霉，颜色黝黑、白、黄等。

一般接种后3~8d可在培养基中发现各种颜色的菌斑，真菌性污染一般由接种室内的空气不洁净，超净工作台的过滤效果不理想，操作不慎，真菌孢子通过瓶口进入瓶内等原因引起。

为了减少损失，提高工作效率，必须每个操作环节注意防止污染的发生。

○2细菌细菌性的主要症状是材料附近出现粘液状和发酵泡沫状物体，或在材料附近的培养基中出现浑浊和云雾状痕迹。

一般在接种后1~2d可发现，细菌性污染一般除外植体带菌和培养基灭菌不彻底外，主要是操作人员的不慎造成。

防止外植体带菌：避免在阴雨天在室外采集外植体，最好在晴天的下午采集；组培季节最好选择在春夏季；或者材料在室内用无糖营养液预先培养；根据材料的大小及幼嫩程度控制好灭菌时间。

1.2.影响污染的因素1.2.1外植体本身植物组织培养的成败除与培养基的成份有关外，另一个重要因素就是外植体本身，即从活体植物上切取下来，用以进行离体培养的那部分组织或器官，为了使外植体适于在离体条件下生长，使组织培养顺利进行，有必要对外植体进行选择与处理。

首先，应该从田间或温室中生长健壮的无病虫害的植株上选取发育正常的组织或器官作为外植体，离体培养易于成功。

不同的植物材料如种、品种、不同的取材部位、材料大小、取材年龄以及取材时期，其带菌量不同。

通常多年生木本材料比1、2年生的草本材料带菌多；老的材料比幼嫩材料带菌多；田间生长的材料比温室材料带菌多；带泥土的材料比清洁材料带菌多。

一年中以雨季的材料带菌多，一天中以中午阳光最强势时材料带菌少。

对于大多数植物来说，茎尖是最好的外植体，由于茎形态已基本建成，生长速度快，遗传稳定，病毒含量低或无病毒，所以是获取无病毒苗的良好途径。

但是，不同植物的不同部位，由于其本身的生长特点，在外植体的培养中存在各种差异性。

比如，各部位的分化再生能力不同，各部位接种后的污染率也不同，各部位培养形成的再生植株的脱毒率也不同。

所以，我们在选取外植体时应选择适当大小、病毒含量低的、易于消毒和灭菌的。

因此，应尽可能选取温室或人工气候室培养的材料，田间采取的材料，可在温室条件下培养一段时间，以使用新的生长部分；木本植物的枝条取回后可插入水中使它萌芽；对于那些容易污染的材料可在取材前进行杀菌剂、抗生素预处理。

由于有些污染需要相当长的时间才表现，所以，初步成功后还要对培养物进行进一步检测。

1.2.2外植体灭菌在开放有菌环境条件下采取的植物材料，去掉不用的地方，然后用适当的软毛刷或毛笔在流水中刷洗干净。

在刷洗过程中也可以使用洗涤剂，如洗衣粉或肥皂水，然后切成大小合适的小块，置于烧杯中并用流水冲洗几分钟至数小时。

去除植物材料体表的洗涤剂。

细小或容易漂浮的植物材料需用纱布、纱网或金属网扎住洗涤。

初步刷洗过的外植体需拿到茶经工作台上进行再次灭菌。

事先我们已准备好干净的空杯、无菌水、灭菌药品溶液、无菌的三角瓶或广口瓶，以及回收溶液的器皿等。

首先将洗涤干净的植物材料放入烧杯中，然后将材料沥干，放入无菌的三角瓶或广口瓶中，加灭菌溶液，计时。

为了使植物表面灭菌彻底和均匀，可以在灭菌溶液中滴加几滴吐温-80，轻轻摇动三角瓶，促进植物材料和灭菌溶液的充分接触，驱除气泡，提高灭菌效果。

在达到设定灭菌时间前，倾倒出灭菌溶液，并倒入无菌水。

植物材料应从加入灭菌溶液到加入无菌水的这段时间。

在用无菌水洗涤过程中应注意每次洗涤3min左右，一般洗涤3~10分钟即可除掉织物表面残留的灭菌药品。

1.2.3接种和培养环境每次接种前对接种室的地面进行清洁，并用紫外灯照射30min,接种前工作台用洁尔灭或75%酒精擦洗。

定期对过滤膜进行清洗。

定期打开臭氧发生器，定期打扫地面和擦洗培养架。

2.褐化2.1褐化原因外植体在培养过程中体内的多酚氧化酶被激活，酚类化合物被多酚氧化物氧化成褐色的醌类物质和水。

醌类物质又会与络氨酸酶发生作用使外植体蛋白质聚合，导致外植体生长停顿，直至死亡。

许多植物尤其是木本植物组织中含有较多的酚类化合物，褐变现象比较严重。

而控制褐变比控制污染、玻璃化更加困难。

因此，能否有效控制褐变是有些植物组培成功的关键。

2.2影响褐变的因素影响褐变的因素极其复杂，随着植物种类、基因型、外植体部位及生理状况的不同，褐变程度也有所不同。

（1）与基因型有关不同植物与品种之间褐变现象也不同，即褐变与植物的遗传性有关。

一般来说植物材料中单宁类和多种酚类化合物含量高，易引起外植体材料的严重褐化。

多数木本植物比草本植物易引起褐化，多年生草本植物比一年生草本植物易引起褐化。

（2）与取样外植体的年龄有关通常幼龄部位产生褐化较轻，随着组织的老龄化含醌类物质增多而褐化加重。

因此，在外植体接种时常需剥去鳞片和大叶片，尤其是以切取幼嫩的茎尖或切取茎尖分生组织更为理想。

（3）与外植体取材时间有关一般在春夏季，在春季采取生长旺盛的外植体产生褐化较轻。

已木栓化和木质化的枝条和处于休眠状态的枝条褐化严重。

即分生部位接种后醌类形成物质少，而分化部位形成醌类物质较多。

（4）与培养基有关固体培养基还是液体培养基、无机盐浓度、激素种类和浓度、培养基的pH等，都与外植体的褐变程度有关。

大量研究证实，液体培养基能有效防止外植体的褐变，加上滤纸桥效果更佳。

降低无机盐浓度，尤其是Mn2+和Cu2+离子浓度，可减少酚类物质外溢，外植体的褐变程度减轻。

培养基中的细胞分类素（BA、KT）不仅促进酚类物质的合成，而且还刺激多酚氧化酶的活性，较高浓度的BA和激动素加重外植体的褐变程度，相反，生长素类物质如2,4—D和NAA则延缓多酚合成，减轻褐变。

培养基的pH值较低时，常有利于减轻外植体的褐变。

当培养基合适时，外植体细胞分裂迅速，褐变也会受到抑制。

（5）培养条件不适宜外植体接种后，培养的温度和光照条件也常对外植体的褐变程度有一定的影响。

培养条件不合适，如温度过高或光照过强，都可以诱导多酚氧化酶的活性从而加速被培养的外植体褐变。

（6）外植体大小外植体大小影响其在培养过程中的褐变。