细菌重测序
细菌de novo测序
细菌de novo ，是基于高通量测序数据，对细菌基因组进行从头组装的方法。
基于组装结果，我们可以预测细菌基因组中所包含的基因，并通过功能数据库比对获得基因的功能信息。
根据不同组装精细程度的需求，我们提供细菌框架图、细菌精细图和细菌完成图三种策略，为您提供全面的细菌de novo解决方案。
技术参数参考文献[1] Liu F, Hu Y, Wang Q, et al . Comparative genomic analysis of Mycobacterium tuberculosis clinical isolates [J]. BMC genomics, 2014, 15(1): 469.[2] Salipante S J, Roach D J, Kitzman J O, et al . Large-scale genomic sequencing of extraintestinal pathogenic Escherichia coli strains [J]. Genome research,2014: gr. 180190.114.案例解析［案例一］ 结核分枝杆菌临床分离株的比较基因组学分析[1]结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）是引起结核病的病原菌，特别是多重耐药和泛耐药结核分枝杆菌菌株的出现对结核病的防治产生了挑战。
本文通过对7 株抗性范围不同的临床菌株进行了全基因组测序，并与其他7 株来源不同的菌株进行了比较。
通过对抗性数据库注释发现了39 处耐药相关的变异，包括14 处先前报道过的位点以及25处新的位点，并发现了主要抗原变异来源PE-PPE-PGRS 基因的16 处InDel。
通过对SNP、InDel 及CRISPR结构的查找和注释发现，多重耐药菌株和泛耐药菌株间在基因组水平上并没有显著的差异，表明临床结核分枝杆菌的耐药性进化过程是十分复杂而多变的。
细菌基因组测序方法
细菌基因组测序方法
细菌基因组测序方法主要有以下几种：
1. 整体基因组测序（Whole Genome Sequencing，WGS）：将
细菌的整个基因组进行测序，并通过比对参考基因组或组装建立一个完整的基因组序列。
2. 目标区域测序（Targeted Sequencing，TS）：针对特定基因、基因组区域或有意义的变异位点进行测序。
3. 细胞单体测序（Single-cell Sequencing，SCS）：将细胞单
体进行测序，通过技术手段将单个细胞的DNA扩增到足够浓
度后进行测序。
4. 转录组测序（RNA Sequencing，RNA-Seq）：将细菌转录产物测序，包括mRNA、ncRNA等，可以了解细菌的转录水平
和转录后调控。
5. 甲基化测序（Methylation Sequencing，Methyl-Seq）：对细
菌基因组进行甲基化修饰位点的检测以获得表观遗传信息。
6. 大肠杆菌的测序方法还包括平滑野百合花青素基因组测序（PacBio）和人工合成DNA 和4D核磁共振测序。
细菌鉴定测序-概述说明以及解释
细菌鉴定测序-概述说明以及解释1.引言1.1 概述细菌鉴定是一项关键的实验室技术，它能够帮助科学家们确定细菌的物种、种群和亚种信息。
通过细菌鉴定，我们可以了解到细菌的特性、生活习性以及与人类健康和环境的关系。
在过去的几十年中，细菌鉴定技术得到了快速的发展和进步，其中细菌鉴定测序技术的突破尤为显著。
细菌鉴定测序是利用DNA测序技术对细菌的基因组进行分析和比对，以确定细菌的物种和相关信息。
相比传统的细菌鉴定方法，如形态学观察或生化检测，测序技术的优势在于其高度准确性、高通量和高效率。
它能够迅速鉴定大量的细菌样本，并且对不同物种之间的差异性进行全面的分析。
目前，常用的细菌鉴定测序方法主要包括16S rRNA测序和全基因组测序两种。
16S rRNA测序是一种常用的DNA测序技术，通过分析细菌的16S rRNA基因序列来确定其物种和亲缘关系。
全基因组测序则是对细菌的整个基因组进行测序和分析，从而获得更加全面和详细的细菌信息。
细菌鉴定测序技术在许多领域都得到了广泛的应用，包括医学、农业、环境科学等。
在医学领域，细菌鉴定测序可以帮助医生准确诊断细菌感染病例，指导治疗和药物选择。
在农业领域，细菌鉴定测序可以帮助农民和科研人员了解农作物病害的病原菌，从而采取相应的防治措施。
在环境科学领域，细菌鉴定测序可以帮助我们了解细菌在自然环境中的分布和功能，从而指导环境保护和污染治理工作。
随着测序技术的不断发展和突破，细菌鉴定测序技术也将呈现出更加广阔的应用前景。
未来我们可以预见，细菌鉴定测序技术将在医学诊断、食品安全、环境监测等领域发挥更大的作用。
同时，随着测序技术的成本不断降低和分析方法的不断改进，细菌鉴定测序技术将变得更加便捷、高效和经济。
综上所述，细菌鉴定测序技术在现代生物学和医学领域具有重要的意义和应用价值。
随着技术的不断进步，我们相信细菌鉴定测序技术将进一步推动细菌学研究的发展，并为人类的健康和环境保护作出更大的贡献。
细菌重测序 注释全流程
细菌重测序注释全流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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细菌全基因组测序
• 细菌全基因组测序概述 • 细菌基因组的组成与结构 • 细菌全基因组测序的应用 • 细菌全基因组测序的挑战与前景 • 案例分析
01
细菌全基因组测序概述
定义与目的
定义
细菌全基因组测序是指对细菌的全基 因组进行测序，获取其完整的DNA序 列信息。
目的
细菌全基因组测序主要用于细菌种属 鉴定、基因功能研究、药物靶点发现 和抗药性分析等。
基因组的复制与表达
01
复制机制
细菌基因组的复制开始于特定的起点，称为复制原点。复制过程中，
DNA聚合酶沿着DNA链移动，并合成新的DNA互补链。
02
转录过程
在细菌中，DNA的转录过程由RNA聚合酶催化。转录从启动子开始，
沿着DNA模板链移动，直到遇到终止子并结束转录过程。
03
翻译过程
细菌中的mRNA通过核糖体进行翻译，生成蛋白质。每个核糖体都沿着
04
细菌全基因组测序的挑战与前景
数据解析与存储的挑战
1 2
数据量庞大
细菌全基因组测序产生大量数据，需要高效的数 据解析和存储技术，以确保数据准确性和完整性。
算法优化
针对基Байду номын сангаас组数据的算法需要进行优化，以提高数 据处理速度和准确性，满足实时分析的需求。
3
云计算平台
利用云计算平台，可以实现数据的高效存储、计 算和分析，为细菌全基因组测序提供强大的计算 资源。
通过比较病原菌基因组序列与已知病原体基因组数据库，可以发现新的病 原菌或变异株，提高疾病诊断的准确性。
病原菌基因组测序还可以帮助了解病原菌的传播途径和流行病学特征，为 防控措施的制定提供科学依据。
案例二
Iontorrent微生物全基因组重测序文库构建实验方案
“Iontorrent微生物（细菌）全基因组重测序文库构建实验方案”清晨的阳光透过实验室的窗户，洒在略显拥挤的操作台上，我的思绪开始像电流一样流转，10年的方案写作经验让我对每一个细节都了如指掌。
就让我们一起探索这个关于Iontorrent微生物（细菌）全基因组重测序文库构建的实验方案吧。
我们要明确实验的目的：通过Iontorrent平台，对微生物（细菌）进行全基因组重测序，以获取更准确、更全面的基因组信息。
那么，就是具体的步骤了。
一、实验材料与仪器1.材料：微生物（细菌）样本、DNA提取试剂盒、磁珠、PCR试剂、测序试剂盒等。
2.仪器：Iontorrent测序仪、离心机、PCR仪、磁珠分离器、凝胶成像仪等。
二、实验步骤1.样本处理：将微生物（细菌）样本进行适当的预处理，如离心、洗涤等，确保样品的纯净度。
2.DNA提取：使用DNA提取试剂盒，按照说明书操作，提取微生物（细菌）的基因组DNA。
3.DNA定量：利用纳米滴技术或紫外可见分光光度计，对提取的DNA进行定量，以确保DNA的浓度和纯度。
4.DNA片段化：将提取的DNA进行片段化处理，使其成为适合测序的片段大小。
5.文库构建：将片段化的DNA与测序适配器连接，通过PCR扩增，构建测序文库。
6.文库质检：利用凝胶成像仪，对构建的文库进行质检，确保文库的质量。
7.测序：将质检合格的文库上机测序，使用Iontorrent测序仪进行测序。
8.数据分析：将测序得到的原始数据进行质控、比对、组装等分析，得到微生物（细菌）的全基因组序列。
9.结果验证：对测序结果进行验证，如通过PCR、一代测序等方法，确保测序结果的准确性。
三、注意事项1.实验过程中，要注意无菌操作，避免样本污染。
2.操作过程中，要严格按照说明书进行，确保实验的准确性。
3.测序数据的质量控制和分析是关键步骤，要密切关注每个环节，确保结果的可靠性。
4.实验过程中，要随时记录实验数据和操作过程，以便后续的数据整理和分析。
细菌鉴定测序
细菌鉴定测序全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：细菌鉴定测序是一种通过测序细菌基因组DNA序列来确定细菌种类和特征的技术。
随着生物技术的发展和普及，细菌鉴定测序在医学、农业、环保等领域的应用越来越广泛，为研究人员提供了一种快速、准确的方法来识别细菌并了解其特性。
细菌是一类微生物，它们存在于地球上的各个环境中，包括土壤、水体、空气等。
细菌在生态系统中起着重要的作用，有些细菌对环境有益，有些则可能对人类和动植物造成危害。
正确鉴定细菌种类对于环境保护、疾病预防和治疗等方面具有重要意义。
传统的细菌鉴定方法包括形态学观察、生理生化试验和免疫学方法等，这些方法需要较长时间并且有一定的局限性。
而细菌鉴定测序技术则通过对细菌的DNA序列进行测序和分析，可以准确地确定细菌的种类和特征，同时还可以帮助研究人员深入了解细菌的生物学特性。
细菌鉴定测序的步骤主要包括DNA提取、测序反应、数据分析和结果解读等。
首先是DNA提取，通过将细菌培养物中的DNA提取出来，然后进行PCR扩增等处理来准备测序样本。
接着是测序反应，将DNA样本进行测序反应，得到细菌DNA的序列信息。
数据分析是整个过程中最关键的一步，通过对测序数据进行比对和分析，确定细菌的种类和特征。
最后是结果解读，根据数据分析的结果和相关数据库信息来判断细菌的鉴定结果。
细菌鉴定测序技术有许多优点，首先是快速性和准确性。
相比传统的鉴定方法，测序技术可以在较短的时间内完成细菌鉴定，而且结果更加可靠和准确。
其次是高通量性，测序技术可以同时对多个样本进行测序，大大提高了工作效率。
测序技术还可以帮助研究人员发现新的细菌种类和基因功能，对于科学研究具有重要的推动作用。
在医学领域，细菌鉴定测序技术被广泛应用于致病菌的鉴定和药物治疗方面。
通过对病原菌进行测序鉴定，可以为临床医生提供更准确的诊断结果和治疗方案，从而有效地控制传染病的传播。
在农业领域，细菌鉴定测序技术可以帮助农民鉴定土壤中的有益细菌，并设计出更加科学的农业生产方式。
Ion torrent微生物(细菌)全基因组重测序文库构建实验方案
Ion torrent微生物（细菌）全基因组重测序文库构建实验方案微生物（细菌）全基因组重测序文库构建实验方案一、重测序原理全基因组重测序是对已知基因组序列的物种进行不同个体的基因组测序，并在此基础上对个体或群体进行差异性分析。
二、技术路线培养至对数期的单一菌落↓基因组DNA提取细菌DNA（纯化）↓超声波打断 DNA片段化↓ 文库构建↓Ion OneTouch 乳液PCR、ES↓Ion PGM、Ion Proton 上机测序↓生物信息学分析DNA片段化↓ 末端修复↓纯化接头连接、缺口修复↓纯化文库片段筛选（E-Gel 法）↓ 文库片段扩增↓纯化 Agilent Test、Qubit定量↓ Ion OneTouch System 重测序三、实验方案 1.细菌总DNA的提取液氮速冻、干冰保存的细菌菌液：若本实验室可以提供该细菌生长的条件，则对菌液进行活化，培养至对数期时，对该细菌进行DNA提取；若本实验室不能提供该细菌的生长条件，则应要求客户提供尽可能多的样本，以保证需要的DNA量。
细菌DNA采用试剂盒提取法（如TianGen细菌基因组提取试剂盒）。
取对数生长期的菌液，按照细菌DNA提取试剂盒操作步骤进行操作。
提取完成后，对基因组DNA进行纯度和浓度的检测。
通过测定OD260/280，范围在1.8-2.0之间则DNA较纯，使用Qubit对提取的DNA进行定量，确定提取的DNA浓度达到文库构建的量。
2.DNA片段化采用Covaris System超声波打断仪（Covaris M220），将待测DNA打断步骤：1）对待打断的DNA进行定量，将含量控制在100ng或者1μg2）打开Covaris M220安全盖，将Covaris AFA-grade Water充入水浴容器内，至液面到最高刻度线（约15mL），软件界面显示为绿色3）将待打断DNA装入Ep LoBind管中，其中DNA为100ng或1μg，加入Low TE至总体积为50mL4）将稀释的DNA转移至旋钮盖的Covaris管中（200bp规格），转移过程中不能将气泡带入，完成后旋紧盖子5）选择Ion_Torrent_200bp_50μL_ScrewCap_microTube，将对应的小管放入卡口，关上安全盖，点击软件界面“RUN”6）打断结束后，将混合液转移至一支新的1.5mL离心管中3.末端修复及接头连接 3.1 末端修复使用Ion Plus Fragment Kit进行，以100ng DNA量为例，各组分使用前瞬时离心2s 步骤：1）加入核酸酶free水至装有DNA片段的1.5mL离心管中，至总体积为79μL 2）向体系中加入20μL 5×末端修复buffer，1μL末端修复酶，总体积为100μL 3）室温放置20min3.2 片段纯化片段纯化使用Agencourt AMpure XP Kit进行步骤：1）加入180μL Agencourt AMpure XP Reagent beads于经过末端修复的1.5mL离心管中，充分混匀，室温放置5min2）瞬时离心后，将离心管放置于磁力架（如DynaMag-2磁力架）3min，至溶液澄清，小心去除上清，离心管保持放置在磁力架上3）离心管放置于磁力架上不移动，配置新的500μL 70%乙醇，加入，30s后，盖上盖子颠倒混匀2次，使磁珠悬浮，放回磁力架至溶液澄清后，小心除去上清 4）重复第三步5）用20μL墙头小心吸去多余的液体6）将离心管留在磁力架上，室温风干不超过5min7）取下离心管，加入25μL Low TE缓冲液，盖上盖子，上下颠倒混匀5次，旋窝震荡10s，充分混合8）瞬时离心后，将离心管放于磁力架上至少1min，溶液澄清后，将上清移入一支新的1.5mL EP管中（不可吸到磁珠） 9）纯化的DNA片段用于下一步的接头连接4.接头连接、缺口修复和纯化片段两端的接头分别为barcode接头和P1接头 4.1 接头连接在0.2mL体系中加入（以100ngDNA为例）DNA 25μL10×Ligase Buffer 10μL Ion P1 Adaptor 2μL Ion XpressBarc ode X+ 2μL dNTP Mix 2μL Nuclease-free water49μL DNA Ligase 2μL Nick pair polymerase 8μL Total 100μL将体系配置好后，放入PCR仪按照下面的温度进行1个循环扩增25℃ 15min72℃ 5min 4℃ hold 循环×1立即转移至一个新的1.5mL离心管中 4.2 纯化片段纯化使用Agencourt AMpure XP Kit进行步骤：1）加入140μL Agencourt AMpure XP Reagent beads于经过末端修复的1.5mL离心管中，充分混匀，室温放置5min2）瞬时离心后，将离心管放置于磁力架（如DynaMag-2磁力架）3min，至溶液澄清，小心去除上清，离心管保持放置在磁力架上3）离心管放置于磁力架上不移动，配置新的500μL 70%乙醇，加入，30s后，盖上盖子颠倒混匀2次，使磁珠悬浮，放回磁力架至溶液澄清后，小心除去上清 4）重复第三步5）瞬时离心，用20μL墙头小心吸去多余的液体 6）将离心管留在磁力架上，室温风干不超过5min7）取下离心管，加入20μL Low TE缓冲液，盖上盖子，上下颠倒混匀5次，旋窝震荡10s，充分混合8）瞬时离心后，将离心管放于磁力架上至少1min，溶液澄清后，将上清移入一支新的1.5mL EP管中（不可吸到磁珠）5.文库片段筛选方案1E-Gel Agarose System采用E-Gel SizeSelect 2% Agarose Gel，在E-Gel电泳、成像系统中按照操作说明进行。
菌株基因组全序列测序及其多样性分析
菌株基因组全序列测序及其多样性分析引言随着现代生命科学技术的不断发展，基因组学在生物学研究中越来越重要。
其中，菌株基因组测序技术是一种重要手段，可以帮助我们深入了解菌株的生长、发育和适应环境的机制。
本文将重点介绍菌株基因组全序列测序技术及其在多样性分析中的应用。
术语解释在探讨菌株基因组全序列测序技术及其多样性分析应用之前，我们先了解一些术语的定义：1.基因组（genome）：指一个生物体所有基因组成的遗传信息的总和。
2.基因（gene）：指DNA序列中一段可以编码蛋白质或非编码RNA的区域。
3.序列（sequence）：指DNA或RNA的一连串碱基的排列顺序。
4.全序列（whole genome sequencing）：指对一个生物体的所有基因组进行测序。
5.测序（sequencing）：指将DNA或RNA样本进行分离、扩增、纯化、切割、测序等一系列步骤，最终得到一连串碱基的排列顺序的过程。
6.多样性（diversity）：指同一物种或同一系统中个体之间在形态、遗传、生理、生态等方面的差异。
基因组全序列测序技术菌株基因组全序列测序技术是指对一个菌株的所有基因组进行测序。
具体的测序方法有很多种，包括Sanger测序、454测序、Illumina测序、Ion Torrent测序、PacBio测序等。
选择何种方法进行测序，需要根据实际情况而定。
例如，Sanger测序虽然可以对单个DNA分子进行分析，但是速度相对较慢、成本较高，适合测序较小的区域；而Illumina测序虽然速度较快、成本较低，但是对特定的GC含量和重复序列存在局限性。
因此，实验者需要根据实验对象的大小、GC含量、复杂度和所需深度等，选择最适合的测序方法。
基因组全序列测序技术的应用1.挖掘独特基因通过对菌株基因组全序列测序，可以挖掘出该菌株独特的基因。
独特基因的存在，可能是某个生物体适应特定环境、对特定营养物的吸收、抵御重金属离子等环境压力所需。
细菌16SrDNA测序鉴定
细菌16SrDNA测序鉴定一、细菌总DNA提取二、16SrDNA的扩增1、以单菌落或菌悬液为模板的16SrDNA扩增体系25ul体系Buffer(含有Mg2+)：2.5 uldNTP：2.5 ul：3，-primer：0.5ul5，-primer：0.5ul模板：1个单菌落（或1 ul在LB培养液中37℃，12h的菌悬液）吐温20：2ulTaq酶：0.3水：16.7（或15.7ul）细菌16S rDNA的通用引物为Pf-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和Rf-TACCTTGTTACCACTT许敬亮博士论文66页：扩增采用通用的引物，其正向序列为：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，反向互补序列为： 5'-TTCAGCATTGTTCCAT-3'。
黄婷婷博士论文70页：5’端：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'（Escherichia coli bases 8 to 27），3’端：5'-TACCTTGTTACGACTT-3'（Escherichia coli bases 1507 to 1492）。
2、以总DNA为模板的16SrDNA扩增体系25ul体系Buffer(含有Mg2+)：2.5 ul (购买)dNTP：2.5 ul：3，-primer：0.5ul5，-primer：0.5ul模板：1 ulTaq酶：0.3（或0.2ul）双蒸水：17.7（或17.8ul）3、PCR反应条件94℃，5min；95℃，变性30s；50℃～52℃（可根据扩增情况进行适当调节），退火30s；72℃，延伸1min；30个循环；72℃，延伸15min；10℃(or4℃)，保温10min(or nh)。
4、检测扩增效果取1～3 ul扩增产物,适量load buffer，以DL2000为Marker，上0.75%琼脂糖凝胶跑电泳（电压挑低些80～100，胶长些，利于各扩增产物分离及回收切胶）注：扩增条件摸索时每个模板只扩1管即可三、16SrDNA的回收扩增出的每一管16SrDNA经0.75%琼脂糖凝胶电泳检测后，将效果好的各管16SrDNA合并使达到60～100ul样量，100ul16SrDNA+10ul溴酚蓝跑电泳回收胶(电泳液需换成新鲜的,DL2000为Marker)，EB染色后在紫外灯下切下16SrDNA 条带放入1.5ml离心管中(离心管事先称重)，按DNA凝胶回收试剂盒操作说明回收16SrDNA，取回收16SrDNA 2ul(Dl2000为Marker)跑电泳观察浓度(亮度)与纯度(条带数与位置)。
重测序-全基因组选择(GS)
首页 科技服务 测序指南 基因课堂 市场活动与进展 文章成果 关于我们全基因组选择1. Meuwissen T H, Hayes B J, Goddard M E.Prediction of total genetic value using genome-wide dense marker maps[J]. Genetics, 2001, 157(4): 1819 1829. 阅读原文>>2. Haberland A M, Pimentel E C G, Ytournel F, et al. Interplay between heritability, genetic correlation and economic weighting in a selection index with and without genomic information[J]. Journal of Animal Breeding and Genetics, 2013, 130(6): 456-467. 阅读原文>>3. Wu X, Lund M S, Sun D, et al. Impact of relationships between test and training animals and among training animals on reliability of genomic prediction[J]. Journal of Animal Breeding and Genetics, 2015, 132(5): 366-375. 阅读原文>>4. Goddard M E ,Hayes BJ. Genomic selection [J]. Journal of Animal Breeding and Genetics,2007,124:323:330. 阅读原文>>5. Heffner E L, Sorrells M E, Jannink J L. Genomic selection for crop improvement [J]. Crop Science, 2009, 49(1): 1-12. 阅读原文>>参考文献全基因组选择简介Meuwissen等[1]在2001年首次提出了基因组选择理论(Genomic selection , GS)，即利用具有表型和基因型的个体来预测只具有基因型不具有表型值动植物的基因组育种值(GEBV)。
【高通量测序服务】细菌基因组测序
【⾼通量测序服务】细菌基因组测序随着细菌基因组研究的迅速发展，全基因组测序已逐步成为微⽣物基础研究的重要⼿段之⼀。
截⾄2010年11⽉，全世界已发布了1748个细菌基因组、61个真菌基因组和103个古细菌基因组序列。
新⼀代⾼通量测序技术⼤⼤减少了基因组测序的成本和时间，让更多实验室可以开展微⽣物基因组测序项⽬。
根据不同的研究⽬的和测序要求，细菌基因组测序可分为四种类型：细菌基因组Scanning、细菌基因组框架图、细菌基因组精细图和细菌基因组完成图。
美吉⽣物灵活应⽤Roche 454长⽚段测序、Illumina Solexa短⽚段⾼覆盖测序，结合454双末端测序（Paired-End Sequencing）及Solexa末端配对测序（Mate-Pair Sequencing，MP）技术，针对不同的基因组测序类型，提供专业、合理、⾼性价⽐的测序服务。
美吉优势1.拥有⾃主实验室和⾼通量测序平台，可以根据合作伙伴要求灵活安排实验，实验周期短，质量可靠。
2.拥有ABI3730xl常规测序平台、Roche 454⾼通量测序平台和Illumina Solexa⾼通量测序平台，三种平台联合应⽤，优势互补，在微⽣物基因组测序中取得1+1+1>3的效果。
3.技术⼈员经验丰富，每年完成数百个BAC全长测序、⼏⼗个微⽣物基因组测序的Gap Closing⼯作。
4.拥有专业的⽣物信息团队和⼤型计算机平台，可以为合作伙伴提供个性化的⽣物信息分析服务。
⼀.细菌基因组Scanning细菌基因组Scannning采⽤Illumina测序技术，对基因组进⾏50×低深度测序，根据序列组装结果，以获取基因组序列的基本信息。
⼆.细菌基因组框架图细菌基因组框架图采⽤Illumina短⽚段测序技术和末端配对测序（MP）技术，对基因组进⾏100×深度测序。
MP测序数据⽤来确定Contigs之间的排列关系，结合100×测序深度，可以得到较佳的基因组拼接结果和较⾼的基因区覆盖度，为随后的基因组信息挖掘提供良好基础。
不能开展细菌测序情况说明
不能开展细菌测序情况说明
细菌测序是一种分子生物学技术，用于确定细菌菌株的基因组序列。
该技术可以提供有关细菌基因组的详细信息，包括基因组结构、功能基因、抗生素抗性基因等。
然而，不能开展细菌测序可能有以下情况说明：
1. 技术限制：细菌测序是一项复杂的技术，需要高度专业化的设备和实验室条件。
如果实验室没有相应的设备或经验丰富的技术人员，就无法进行细菌测序。
2. 样本问题：细菌测序需要使用细菌样本作为起始材料，如果没有合适的细菌样本，就无法进行测序。
可能有以下情况：无法获取到所需的细菌样本、细菌样本数量不足、细菌样本质量不理想等。
3. 经济限制：细菌测序需要耗费一定的费用，包括实验室设备的购买和维护费用、试剂的购买费用、技术人员的培训和工资等。
如果实验室没有足够的财力支持，就无法开展细菌测序。
4. 实验目的不明确：细菌测序通常用于科研目的，例如研究细菌的进化、抗生素抗性机制等。
如果研究者对细菌测序的目的和意义不清楚，或者无法将其与实际应用相结合，就可能没有充分的动力去开展细菌测序。
总之，不能开展细菌测序的情况可能是由于技术限制、样本问题、经济限制或实验目的不明确等原因所导致。
在开展细菌测
序之前，需要仔细评估实验条件和资源，并确保细菌测序的目的明确。
Ion torrent微生物(细菌)全基因组重测序文库构建实验方案
Ion torrent微生物（细菌）全基因组重测序文库构建实验方案微生物全基因组重测序文库构建实验方案一、重测序原理全基因组重测序是对已知基因组序列的物种进行不同个体的基因组测序，并在此基础上对个体或群体进行差异性分析。
二、技术路线培养至对数期的单一菌落↓基因组DNA提取细菌DNA↓超声波打断 DNA片段化↓文库构建↓Ion OneTouch 乳液PCR、ES↓Ion PGM、Ion Proton 上机测序↓生物信息学分析DNA片段化↓末端修复↓纯化接头连接、缺口修复↓纯化文库片段筛选↓文库片段扩增↓纯化 Agilent Test、Qubit定量↓ Ion OneTouch System 重测序三、实验方案 1.细菌总DNA的提取液氮速冻、干冰保存的细菌菌液：若本实验室可以提供该细菌生长的条件，则对菌液进行活化，培养至对数期时，对该细菌进行DNA提取；若本实验室不能提供该细菌的生长条件，则应要求客户提供尽可能多的样本，以保证需要的DNA 量。
细菌DNA采用试剂盒提取法。
取对数生长期的菌液，按照细菌DNA提取试剂盒操作步骤进行操作。
提取完成后，对基因组DNA进行纯度和浓度的检测。
通过测定OD260/280，范围在之间则DNA较纯，使用Qubit对提取的DNA进行定量，确定提取的DNA浓度达到文库构建的量。
片段化采用Covaris System超声波打断仪，将待测DNA打断步骤：1）对待打断的DNA进行定量，将含量控制在100ng或者1μg2）打开Covaris M220安全盖，将Covaris AFA-grade Water充入水浴容器内，至液面到最高刻度线，软件界面显示为绿色3）将待打断DNA装入Ep LoBind管中，其中DNA为100ng 或1μg，加入Low TE至总体积为50mL4）将稀释的DNA转移至旋钮盖的Covaris管中，转移过程中不能将气泡带入，完成后旋紧盖子5）选择Ion_Torrent_200bp_50μL_ScrewCap_microTube，将对应的小管放入卡口，关上安全盖，点击软件界面“RUN”6）打断结束后，将混合液转移至一支新的离心管中3.末端修复及接头连接末端修复使用Ion Plus Fragment Kit进行，以100ng DNA量为例，各组分使用前瞬时离心2s 步骤：1）加入核酸酶free水至装有DNA片段的离心管中，至总体积为79μL 2）向体系中加入20μL 5×末端修复buffer，1μL末端修复酶，总体积为100μL 3）室温放置20min 片段纯化片段纯化使用Agencourt AMpure XP Kit进行步骤： 1）加入180μL Agencourt AMpure XP Reagent beads 于经过末端修复的离心管中，充分混匀，室温放置5min 2）瞬时离心后，将离心管放置于磁力架3min，至溶液澄清，小心去除上清，离心管保持放置在磁力架上3）离心管放置于磁力架上不移动，配置新的500μL 70%乙醇，加入，30s后，盖上盖子颠倒混匀2次，使磁珠悬浮，放回磁力架至溶液澄清后，小心除去上清 4）重复第三步5）用20μL墙头小心吸去多余的液体6）将离心管留在磁力架上，室温风干不超过5min7）取下离心管，加入25μL Low TE缓冲液，盖上盖子，上下颠倒混匀5次，旋窝震荡10s，充分混合8）瞬时离心后，将离心管放于磁力架上至少1min，溶液澄清后，将上清移入一支新的 EP管中 9）纯化的DNA片段用于下一步的接头连接4.接头连接、缺口修复和纯化片段两端的接头分别为barcode接头和P1接头接头连接在体系中加入 DNA 25μL 10×Ligase Buffer 10μL Ion P1 Adaptor 2μL Ion Xpress Barcode X+ 2μL dNTP Mix 2μL Nuclease-free water 49μL DNA Ligase 2μL Nick pair polymerase8μL Total 100μL将体系配置好后，放入PCR仪按照下面的温度进行1个循环扩增 25℃15min72℃5min 4℃hold 循环×1立即转移至一个新的离心管中纯化片段纯化使用Agencourt AMpure XP Kit进行步骤： 1）加入140μL Agencourt AMpure XP Reagent beads 于经过末端修复的离心管中，充分混匀，室温放置5min 2）瞬时离心后，将离心管放置于磁力架3min，至溶液澄清，小心去除上清，离心管保持放置在磁力架上3）离心管放置于磁力架上不移动，配置新的500μL 70%乙醇，加入，30s后，盖上盖子颠倒混匀2次，使磁珠悬浮，放回磁力架至溶液澄清后，小心除去上清 4）重复第三步5）瞬时离心，用20μL墙头小心吸去多余的液体 6）将离心管留在磁力架上，室温风干不超过5min7）取下离心管，加入20μL Low TE缓冲液，盖上盖子，上下颠倒混匀5次，旋窝震荡10s，充分混合8）瞬时离心后，将离心管放于磁力架上至少1min，溶液澄清后，将上清移入一支新的 EP管中5.文库片段筛选方案1E-Gel Agarose System采用E-Gel SizeSelect 2% Agarose Gel，在E-Gel电泳、成像系统中按照操作说明进行。
菌液测序注意事项
菌落PCR (colony PCR) , 是一种快速、高通量筛选目的片段是否存在的方法,操作起来十分简单。
筛选目的是为了得到含有目的片段的菌株进行测序，提高效率。
以大肠杆菌为例,一般来说, 在转化了携带外源基因的质粒后,需要检查并确保所设计的质粒确实已经存在于细胞中了;那么，面对一整板的菌落,如何才能知道哪个小细菌携带了目标片段并且是完全准确的目的片段呢?按照一般的步骤，可以把每个菌落挑出来进行培养提取质粒,然后质粒进行测序或者酶切验证目的片段。
但是从培养细菌到最后送测序，花费太多时间。
如果说只有一个菌落去验证，那工作量倒不是很大；万一有100个菌落,怎么办呢?那么，我们就可以进行菌落PCR 筛选。
基本步骤1.单菌落挑取把L B培养基倒入排枪槽中,然后用排枪加400μL LB培养基到48孔深孔板,用镊子拿已灭菌的小白枪头挑取平板上的单菌落并放到48孔深孔板中,同时在48孔深孔板和相应的表单上做好记录，注意对于蓝白斑筛选的板子要挑的白斑。
挑好的48孔深孔板用封口膜盖好并做好相应标记(日期、板号等)，针头在封口膜打孔, 把它放在37°C摇床上摇一个小时。
2.菌落PCR反应配置好PCR反应的反应体系，把配好的反应液加到96孔反应板中，用排枪加2 .5μL的菌液到其中，注意在96孔反应板上做好标记。
把96孔反应板放在PCR仪器上盖好橡胶垫,按照PCR反应条件设置反应程序,意-定要把PCR仪器的盖子盖紧。
3.琼脂糖凝胶电泳一般先配置1.0%-1.2%琼脂糖凝胶(即称1 .2g的琼脂糖加100m的TAE)，在96孔反应板每个管中加0.5μL的溴酚蓝，震荡均匀,然后点样,电泳好的琼脂糖凝胶拍照，命名保存。
4.判断阳性克隆并测序根据琼脂糖凝胶电泳图条带来判断阳性克隆,把阳性克隆的菌液进行扩大培养,进行测序验证,看看是否有完全正确的列。
注意事项1.对于要求筛选出插入片段方向的。
首先我们要大量的挑选阳性克隆，然后根据具体情况, 挑选合适的引物配反应液。
细菌全基因组测序
H2O2，Mn，有机酸作 形成苯氧自由基，引起芳香环和C α之间化学键 为螯合剂，硫醇，不 的断裂；MnP-脂质体系可使非酚型β-O-4木质素
饱和脂质
模型中的C α-C β键和β-芳基-醚键降解
O2，介质（如羟基苯 并三唑或ABTS）
通过氧化C α键和使芳基烷基键断裂，催化β-1和β-O-4-木质素模型化合物中的C α-C β键的断裂； 在“介体”分子存在下，可氧化非酚型β-O-4木
松脂酚
苯基香豆满 二联苯愈创木基丙烷
二芳基（愈创木基）联丙 烷
愈创木基-β-芳基丙烷
木质素降解有关主要的酶和它们催化的主要反应
酶，简写
木质素过氧 化物酶， LiP
锰过氧化物 酶，MnP
漆酶，Lac
辅助因子或基质“介 体”
主要效应和参与催化的反应
H2O2，黎芦醇
催化木质素非酚型亚结构β-O-4模型中丙基侧链 上的C α-C β键的断裂反应、开环以及其他的反
C1C2C3片段 CO2
Lac MnP LiP
单体 二聚体 寡聚体
其他酶
Lac MnP LiP
开环产物 CO2 芳香醛酸
醌 + 氢醌 CO2
α βγ
HO
C C C HO
H3CO C C C HO
CCC
对羟苯基结构（10%）
H3CO
愈创木基结构（70%）
H3CO
紫丁香基结构（20%）
β-O-4型连接
基因组中来源相同，结构和功能相关的基因 聚集在一起形成基因家族。
基因家族的各个成员紧密成簇排列成大段的串联 重复单位，分布在某一条染色体的特殊区域
genefamily.xls
基因家族聚类结果
细菌传代测序
细菌传代测序
细菌传代测序是指对细菌进行多代传代培养，并在每代传代后对其进行基因组测序的过程。
这个过程通常用于研究细菌在不同生长条件下的遗传变化和进化过程，以及分析其遗传适应性和表型变化。
在细菌传代测序实验中，一般包括以下步骤：
1.细菌培养和传代：选择目标细菌菌株，进行预培养，然后进行第一代传代培养。
在每一代培养结束后，取部分细菌进行下一代的培养，以此类推，直至达到所需的传代次数。
2.DNA提取：在每代传代结束后，收集细菌样品，提取其总DNA。
DNA提取可以采用各种商业化的DNA提取试剂盒或自制提取方法。
3.建库和测序：对提取得到的DNA样品进行文库构建，一般采用Illumina、PacBio等常见的测序平台。
根据实验目的，可以选择全基因组测序、16S rRNA基因测序等不同的测序方法。
4.数据分析：对测序得到的数据进行生物信息学分析，包括序列质控、序列比对、变异检测、基因组组装等步骤。
通过比较不同代次的细菌测序数据，可以分析其在遗传水平上的变化。
5.功能分析：进一步对不同代次的细菌测序数据进行功能分析，包括基因功能注释、基因组结构分析、代谢通路预测等，从而揭示细菌在传代过程中可能发生的遗传适应性变化和表型特征。
细菌传代测序实验可以帮助科研人员深入了解细菌在不同生长条件下的遗传变化和进化机制，为解析微生物的适应性进化和资源利用提供重要线索。
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Morrisania Central Bronx Bronx Park Riverdale
Outer circle: Isolate type
clinical colonizer enviromental
图1 致病菌株进化规律及其地域属性
［案例二］ 不同测序平台在合成气发酵梭菌完成图构建中的比较[2]
Middle circle: Neighborhood
Inwood Fort George Washington Heights Hamilton Heights Harlem
East Harlem Hunts point, mott haven Houston, Texas San Diego, California San Francisco, California
[2] Brown S D, Nagaraju S, Utturkar S, et al. Comparison of single-molecule sequencing and hybrid approaches for finishing the genome of Clostridium autoethanogenum and analysis of CRISPR systems in industrial relevant Clostridia [J]. Biotechnol. Biofuels, 2014, 7: 40.
参考文献
图2 各平台对合成气发酵梭菌基因组装结果比较
[1] Uhlemann A C, Dordel J, Knox J R, et al. Molecular tracing of the emergence, diversification, and transmission of S. aureus sequence type 8 in a New York community [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2014, 111(18): 6738-6743.
在本研究中，分别应用Pacbio RS II、454 GS FLX 和 Illumina MiSeq平台对合成气发酵 梭菌Clostridium auto- ethanogenum进行全基因组测序研究。Pacbio 测序平台结果中6 核糖体rDNA区域组装效果明显优于其它平台。文献揭示了合成气发酵梭菌的生物合成代 谢通路，同时探讨了CRISPR结构与细菌抗逆基因的关联性，发现具有CRISPR结构的菌株 具有更强的噬菌体侵染抵抗力。
1
细菌重测序，是基于高通量测序数据，与近缘参考基因组进行比对，进行变异检测的方法。通过重测序可以获得目标基因组对于参考基因组的SNP、
InDel、SV等一系列变异信息，从中尝试对基因组之间的性状差异进行解析，或作为标记进行大规模的进化目周期
细菌重测序
无
重测序变异分析 SNP检测及注释 Indel检测及注释 SV检测及注释
30个自然日Байду номын сангаас
进化分析
系统发育树 Ka／Ks分析
案例解析
［案例一］ 重测序追踪纽约金黄色葡萄球菌产生、多样性和传播[1]
在过去的20年，区域范围的甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌（CA-MRSA）菌株有巨大的变 化，美国流行菌株以基因型ST8、表现型USA300为主，同时金黄色葡萄球菌的感染增加了 全球传染性疾病预防负担。本研究使用Illumina HiSeq 2000对387株ST8隔离菌株进行全 基因组重测序，探索其短期进化和传播模式，在测序菌株中发现了一些噬菌体基因信息， 导致USA300耐药株的出现。通过进化分析及贝叶斯模型推论，找到了病原祖先菌株，并 推测得到一些隔离菌传播事件及其发生时间。