荧光定量实验方法操作手册

举例来说如何进行设置 1、先进入软件，在板设置中选择所放样品的位置，并标上 unknow 或 standard 等信息。
2、选择要使用的荧光染料。
3、设置复孔。 如果有些孔有重复就用用样的数字标明，这样仪器就知道哪些是重复，最终结果处理的话也 可以取平均等操作。
有相同标号的系统就认为是同样的样品的重复。 4、标准品赋值 接下来要给标准品赋上值，系统要知道按照什么去计算 标准品赋值要先选上要赋值的标准品，然后在工具面板中输入相应的值。
1.3、方便而快捷的反应条件设定。可以很容易设定扩增反应条件和熔解曲线条件。
2、结果分析 2.1、多种分析结果可供选择 扩增曲线，其中红色表示目的基因，绿色表示看家基因（和板设置中选择的颜色相同）
标准曲线，看家基因和待测基因的标准曲线都能被作出来，并显示出分别的扩增效率。
如果不做标准曲线，用户也可以根据经验写入扩增效率的值，这样最后的计算结果也可以根 据用户写入的扩增效率进行计算。 扩增效率的引入方法是点软件操作界面上方的 Term settings 键 ，打开 Analysis term settings 对话框，点里面的 Efficiency Settings，在 efficiency 框中输入不同基因的扩增效率。
上图中的 ABCD 表示标号相同是来自同一份组织，ຫໍສະໝຸດ Baidu样就把同一份组织中的看家基因和目 的基因对应了起来。 选择对照样本：在基因表达实验中总要选择一个 cDNA 样本作为基因表达的基准，比如实 验中会有一个正常样本，最后的表达结果作为 1，所有其他的样本的基因表达量都和它相比 较，这个作为基准的样品称为 Calibrator。在板上选中这个 cDNA 样品对应的目的基因和看 家基因，在 well type 中选择 calibrator。
然后再选择使用的荧光染料，这里由于只用到了 SYBR GreenI 一种荧光染料，所以就选上 SYBR。如果实验当中用了几种荧光染料，就可以将这几种荧光染料都选中。
当选中了荧光染料之后，板设置的基本信息已经输入电脑了，实验可以运行了。以下信息可 以在实验进行之前设置，也可以在实验结束之后再设置。 不同基因设置：由于做基因表达分析实验通常要做目的基因和看家基因，所以接下来要告诉 软件目的基因和看家基因的名字，软件才能加以区分。点 Assign assay name 打开如下对话 框
基因表达分析板设置方法
Stratagene 荧光定量 PCR 仪的应用软件 MxPro 提供了比较强大的基因表达差异分析功 能，要很好的运用这些功能的前提是要告诉仪器一些必要板设置信息。下面举例子来说明如 何来进行板设置。
在这里举一个例子，用 SYBRGreenI 染料法，用 GAPDH 作内参，检测不同样品中 LI1 的基因表达差异，在这里要设置各自的标准品样品和阴性对照等信息。 首先打开分析软件，选择基因表达分析一项
例如要分析 IL1 基因的表达情况，用看家基因 GAPDH 作为内参，采用的是 SYBR GreenI 染料法。 1、板设置 1.1、专门的基因表达分析实验模式。打开 Mxpro 程序操作窗口，首先弹出的对话框是要用 户 选 择 要 进 行 的 实 验 类 型 ， 做 基 因 表 达 分 析 可 以 选 择 第 二 项 Comparative Quantitation (Calibrator)。
A=C/B×6.02E+14
2、相对定量。主要是针对基因表达分析实验而来的，因为要知道都是相对的数值（对照样 品和实验样品中基因表达的比值），这样就不需要知道精确的拷贝数，所以标准品也就无须 知道精确的拷贝数，只需知道稀释的倍数就可以了。 实验中的标准品可以是来源比较丰富的细胞或组织的 RNA 转录得到的 cDNA。将这种 cDNA 进行梯度的稀释，可以是稀释 10 倍，100，1000，10000 等倍（具体实验要根据具体的情况 来调整稀释倍数。最好能作一个预实验来看看什么样的稀释倍数比较适合这种基因的扩增）。 而对于各个稀释倍数要对它的拷贝数进行赋值，这个值当然不是标准品中真实含有的基因数 量，当然在基因表达分析中也不需要，而是要求根据稀释倍数给每一个稀释度人为赋予的拷 贝数，这只是为了方便实验最终结果的计算而已。比如可以把前面稀释十倍的样品赋值为 10000 个拷贝，100 倍的赋值为 1000 个拷贝依次类推把 10000 倍的赋为 10 等。要注意，赋 值的数目的倍数差异和稀释的倍数应该是一样的，比如前面是 10 稀释，后面赋值也是 10 倍变化。 如何做标准曲线 在定量实验中标准品是要和未知样品一起进行定量实验的，这样在实验结束，无论是标准品 还是未知样品都将跑出曲线，获得了 Ct 值。那么先可以把未知样品放到一边，对于标准品 来说，既获得了 Ct 值，还知道他们的拷贝数（虽然对于相对定量来说这个拷贝数是我们自 己赋予的）。这样可以通过标准品的 Ct 值和拷贝数做一条标准曲线（以拷贝数为横坐标，而 Ct 值为纵坐标）。一旦作出了标准曲线，而未知样品的 Ct 值知道（通过实验求得的），这时 候就在标准曲线上进行定位，就可以得到未知样品的拷贝数了。 事实上，操作起来没有那么复杂，只需要告诉软件哪个孔是标准品，哪个是未知样品，以及 标准品的拷贝数等必要信息，软件会自动帮把标准曲线和未知样品的拷贝数计算出来了。
数据文本显示，实验得到的数据可以以文本的形式显示出来，用户可以很直观的看到用于计 算的具体数据，自己也可以利用这些数据进行统计计算。
2.2、数据导出 实验产生的结果都可以方便地导出，图片可以导成图片格式、Excel 图片或 Powerpoint 等， 数据也可以导入 Excel 或文本文件中。
多种数据的导出形式。
熔解曲线，其中红色表示目的基因，绿色表示看家基因，峰位置代表产物的 Tm 值的温度， 图中可以看到看家基因和待测基因的产物基本具有相似的 Tm 值。
基因表达差异柱壮图显示，程序可以自动计算出基因表达的差异，并用柱壮图显示出来，每 一个柱表示一个样本，基因表达的趋势清晰可见，对照样本被算为 1。
柱壮图还可以表示成 Log 的形式，这样可以清楚分开上调和下调的样本。
基本信息设置：软件首先出现的界面就是板信息设置界面。先选中要放置反应管的位置 A-D 四行，接下来就是在程序界面的右边的设置命令面板上给选中的孔上填入信息。信息的输入 顺序一般是从上到下的。
设置命令 面板
首先要选择孔的类型（Well type）。在孔类型中可以选择 Unknow(未知样品)，Standard（标 准品），NTC（阴性对照）等。为了方便起见，我先将所有的孔都设置成 Unknow。
样品组织分类：看家基因和目的基因未知样品应该对应起来，即同一个 cDNA 样品应该既 作了目的基因也作了看家基因。再接下来把来自同一个 cDNA 的样品的目的基因和看家基 因扩增标出来。可以在 Identify associations 中的 Assoc.symbol 下拉菜单中选择一个字母来标 记用同一个 cDNA 模板分别扩增目的基因和看家基因的孔。
写看家基因和目的基因名 由于用 SYBR 染料做两种基因，所以应该在 SYBR 后面的 Assay 栏中写入看家基因和目的
基因名称。假设前两排是 GAPDH，后两排是 IL1，则可以在 assign assays within selected wells 中选择 SYBR 并输入 GAPDH 和 IL1 的名称，同时你可以选择一个颜色代表不同的基因。这 样系统就可以分辨哪个孔是什么基因了。
6、设好了之后可以运行程序了，最后的标准曲线和扩增曲线系统会自动给出，也会算出未 知样品的拷贝数。
Stratagene 荧光定量 PCR 仪基因表达分析解决方案
Stratagene 荧光定量 PCR 仪和配套的 Mxpro 软件在处理基因表达分析方面的功能比较 强大，下面简要说明如何使用该软件来进行基因表达分析。
这样板设置就完成了。
熔解曲线设置方法
熔解曲线的原理 定量 PCR 的荧光标记方法通常有两种，一种是探针法，一种是染料法。染料法通常指
的是用 SYBR GreenI 染料作为荧光标记。 SYBR GreenI 这种染料之所以可以用来定量，是因为它的特殊性质决定的。第一，它可
以非特异性地结合到双链 DNA 的小沟处，和单链 DNA 以及蛋白都不结合。第二，SYBR GreenI 这种染料游离存在的情况下它没有荧光，一旦它和双链 DNA 结合了，再用一定波长 的光激发它时就可以发出很强的荧光（大概是游离状态的 1000 倍）。我们再想 PCR 的过程， PCR 的最终产物正是双链 DNA，随着每次的循环双链 DNA 产物的数量成指数增长。如果 把 SYBR GreenI 这种染料加入到反应体系中，就可以随着每次循环结合到双链 DNA 产物上。 产物的量越多，结合的染料就越多，染料发出的荧光就和产物的量成正比，因此通过检测 SYBR GreenI 的荧光就可以时实监控 PCR 反应的产物变化。 SYBR GreenI 染色法的优越性是使用方便，不用专门设计探针。想检测不同的基因只用在 PCR 体系中加入同一种荧光物质就可以。而且价格非常便宜，因此在科研领域里还是非常 常用的。但它主要的缺点是灵敏度不够。因为 SYBR GreenI 可以和 DNA 双链非特异性的结 合，那么如果 PCR 反应有非特异性的扩增产物或引物二聚体的话也会结合这种染料，因此 实验的结果往往就会受到一些因素的干扰。 当采用 SYBR GreenI 染料法做定量 PCR 实验时为了确定实验产物中有没有引物二聚体或非 特异性的引发，一般要在反应结束之后做一个熔解曲线。熔解曲线的原理是根据 SYBR GreenI 染料只和双链 DNA 结合的特性，设计一个从 55℃到 95℃逐渐升温的过程，随着温 度的升高，双链 DNA 在不断的解链，SYBR GreenI 染料的结合数量也在减少，发出的荧光 也越来越少，当到达产物 Tm 值的时候，荧光信号突然下降，然后趋于平缓，这时双链完全 解开，不发荧光。
Stratagene 定量 PCR 仪标准曲线制作方法
定量 PCR 定量的基本原理就是用已知拷贝数梯度稀释的样品作出标准曲线，未知样品 和标准曲线相比较从而得到未知样品的量。无论是在基因表达分析实验还是在病原微生物检 测应用中都有可能要做标准曲线，分别用于绝对定量和相对定量。 标准样品的准备 1、绝对定量。绝对定量就是要确定未知样品的拷贝数。对于这类实验标准品是通过某种方 法制备得到的已知拷贝数的含有目标片段的核苷酸序列。最常见的是插入有目标序列的质 粒，因为质粒是环状 DNA 有较强的稳定性，而且分子量比较大定量的时候比较准确。也有 用线状的 PCR 产物作为标准品的，通常要比扩增的目标片段要大一些，这也是为了获得分 子量比较大的片段，提高拷贝数的准确性。标准品的拷贝数是通过紫外定量的方法来确定， 先得到标准品的浓度 C(ng/uL)，因为无论是质粒还是 PCR 产物它们的序列都是已知的，这 样通过核苷酸的相对分子量和标准品序列信息估算出标准品的分子量 B，则标准品的拷贝数 A(copy/uL) 为：
1.2、方便的类型选择和孔设定。在板设置中选择样品的类型，可以将样品的名称写成 GAPDH 和 IL1，并将 GAPDH 设为看家基因（NORM），这样设置非常清晰，有利于分析结果。如 果实验中使用了复孔，则在复孔上标上相同的数字，代表这些样品是重复，下图中每个样品 重复三次。
基因表达分析实验同一个 cDNA 既要做目的基因，也要做看家基因。看家基因和目的基因 来自同一样本的用相同的字母来标记，如果是对照样品则标上 Calibrator。
填入标准品的量 自动增加稀释倍数 为了方便设置系统有一个自动增加稀释倍数的设置，点开后就可以选择你的稀释倍数，然后 用鼠标去选择孔的时候会自动增加
选择稀释倍数 每次选择不同的孔，在里面赋的值会自动按照倍数增加
5、设置温度 在这里提供一个对于 SYBR 染料常用的温度的控制模板，可以参考。注意最后的溶解曲线 制作过程在升温的过程中选择标有 all 的放大镜，代表从 55℃到 95℃逐渐升温的过程中不停 的检测荧光信号。
用红色代表 IL1
这时候软件只知道在这个实验中检测了两个基因，而哪个基因是看家基因并不知道，下一步 是要告诉系统哪一个是看家基因，在 Normalizing assay 中选择 GAPDH 就可以了
这时候原来图上的 GAPDH 就变成了 NORM 重复设置：接下来设置重复，每一个样品设置了三个重复。如果一个样品重复三次，这些相 同重复的样品可以标上同样的一个数字，这时系统就知道标有同样数字的孔是重复样品，将 来在分析数据的时候可以对这些样品进行取平均等操作。
标准品设置：先将标准品和未知样品分开，在本实验中 A 行为看家基因的标准品，C 行为 目的基因的标准品。分别选择 A 行和 C 行，在 Well type 下拉菜单中选择 Standard 将其设置 成标准品类型。 在设置命令面板 Standard quantity 中写入标准品的量。可以利用 Auto-Increment 来自动设置 稀释的倍数。