可溶性糖、淀粉、蛋白质

植物组织中可溶性糖、淀粉、氨基酸及蛋白质的系列测定
一、目的
从一份植物样品中系统分离和测定可溶性糖、淀粉、氨基酸及蛋白质等多种成分，不仅对研究植物体内碳、氮代谢，了解植物的生长发育状况有重要意义，亦可以作为鉴定其品质的重要指标，而且也有助于训练基本操作技能。

二、原理
（一）分离提取原理
在80~85%的乙醇中，植物组织中的还原糖、蔗糖以及游离氨基酸和叶绿素等溶解，而淀粉及蛋白质沉淀，再用9.2mol/L高氯酸溶解淀粉（蛋白质沉淀），最后用0.1mol/L氢氧化钠溶解蛋白质，然后选用适当的方法测定各个提取液中相应物质的含量。

（二）测定原理
1．蒽酮比色法——可溶性糖含量测定
碳水化合物及其衍生物经浓硫酸处理，生成糠醛，再与蒽酮脱水缩合而生成蓝绿色化合物，在一定范围内其颜色深浅与碳水化合物含量成线性关系。

蒽酮反应的颜色深浅，随温度条件和加热时间而变化，葡萄糖显色高峰在100℃时，加热10min后出现，而核糖在相同温度下，加热3min后出现。

此法灵敏度高，糖含量达30μg即可测定。

2．茚三酮比色法——氨基酸含量测定
氨基酸的游离氨基与水合茚三酮作用后，产生二酮茚胺的取代盐等蓝紫色化合物，在570nm下有最大光吸收。

在一定范围内，其颜色深浅与氨基酸的含量呈正比。

3．考马斯亮蓝G-250结合法——蛋白质含量测定
考马斯亮蓝在游离状态时呈红色，当与蛋白质结合后变为蓝色，后者最大光吸收在595nm，在一定范围内（0~1000μg/mL），其颜色深浅与蛋白质的含量呈正比。

此法快速灵敏，反应在2min内即达到平衡，室温1h内颜色稳定，而且干扰物也少。

三、实验用品
（一）实验材料：植物样品。

（二）器皿：
1.25mL刻度试管×8，15mL试管×20；
2.10mL离心管×2；
3.容量瓶：50mL×1，25mL×1；
4.移液管：5mL×2；2mL×4，1mL×2，0.1mL×2；
5.恒温水浴锅；
6.离心机；
7.电子天平；
8.分光光度计。

（三）试剂：
1.样品分离提取
（1）80%乙醇；
（2）9.2mol/L高氯酸，
4.6mol/L高氯酸；
（3）0.1mol/L氢氧化钠；
2.可溶性糖及淀粉测定
（1）葡萄糖标准液（100μg/mL）：0.1g无水葡萄糖溶于蒸馏水中，定容至1000mL；
（2）硫酸-蒽酮试剂：0.2g蒽酮，1g硫脲（阻氧化剂），缓缓加入100mL浓硫酸，边加边搅拌，溶解后呈黄色透明溶液，贮于棕色瓶中，4℃冰箱保存；
3.氨基酸测定
（1）60%乙醇；
（2）水合茚三酮：1.2g茚三酮，加入30mL正丙醇，搅拌使其溶解，再加入60mL正丁醇和120mL乙二醇，
最后加入18mL pH 5.4的乙酸-乙酸钠缓冲液混匀，贮于棕色瓶，4℃冰箱保存；
（3）乙酸-乙酸钠缓冲液（pH 5.4）：乙酸钠54.4g，加入100mL蒸馏水，在电炉上加热至沸，使体积蒸发至原体积的一半，冷却后加30mL冰乙酸，用蒸馏水稀释至100mL；
（4）标准亮氨酸（5μg/mL）：取80℃下烘干的亮氨酸11.7mg，溶解在10%的异丙醇中，并用10%异丙醇稀释至25mL，取5mL，用蒸馏水稀释至50mL；
（5）0.1%抗坏血酸：50mg抗坏血酸溶于50mL蒸馏水中。

现用现配；
4，蛋白质含量测定
（1）牛血清蛋白标准液（1000μg/mL）：100mg牛血清蛋白溶于100mL蒸馏水中，贮于4℃冰箱；
（2）考马斯亮蓝G-250溶液：100mg考马斯亮蓝G-250溶解于50mL95%乙醇中，加入85%（W/V）磷酸100mL，用蒸馏水定容至1000mL。

四、操作步骤
沉淀弃去
（三）测定
1.可溶性糖及淀粉的测定
加入硫酸-蒽酮试剂时，最好将各管放在冷水中，沿管壁缓缓加入，全部加完后再摇匀。

将以上各管在100℃水浴中加热10min，取出后用自来水冷却，620nm比色测定。

（2）样品测定
分别取可溶性糖提取液、淀粉提取液各1mL+1mL蒸馏水（根据含量而定），显色与标准曲线相同。

（2）计算
样品液总体积(mL)
查标准曲线数（μg）××稀释倍数
显色用样液体积
可溶性糖%= ×100
样品重(mg)×1000
2.淀粉测定
吸取上述淀粉提取液2mL(或1mL+1mL水)于大试管中，用测定可溶性糖的方法测定。

样品液总体积(mL)
查标准曲线数（μg）×0.9××稀释倍数
显色用样液体积
淀粉%= ×100
样品重(mg)×1000
3．游离氨基酸含量测定
（1）按下表制作标准曲线
逐渐被氧化而褪色，直至溶液呈紫色时，用60%的乙醇定容至10mL（可刻度试管），混匀，570nm比色测定。

（2）样品测定：吸取上述样品提取液2mL（或1mL+1mL水），显色与标准曲线相同。

（3）计算
样品液总体积(mL)
查标准曲线数（μg）××稀释倍数
显色用样液体积
氨基态氮量（mg/100g干样品）= ×100
样品重(mg)×1000
4．蛋白质含量测定
（1）按下表制作标准曲线：
2min 后595nm比色测定。

（2）样品测定
准确吸取蛋白质提取液0.1mL，显色与标准曲线相同。

（3）计算
样品液总体积(mL)
查标准曲线数（μg）××稀释倍数
显色用样液体积
蛋白质%= ×100
样品重(mg)×1000。