高效液相色谱的维护与保养
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– 凝胶柱（GPC及糖柱）
• 温度的变化幅度 • 专用色谱柱∶样品及溶剂的要求
记 住 ∶ 拿 到 一 根 从 未 用 过 的 色 谱 柱 时 一 定 要 先 看 其 使 用 说 明 ！
色谱柱的在线保护装置
• 给色谱柱提供物理的保护
– 除去样品及流动相中的颗粒
• 给色谱柱提供化学的保护
– 防止分析柱被化学污染
0
5
10
15
20
分
2 星期
1 星期
1天 1 小时 新鲜配制 25
保存于标准棕色玻璃瓶中的超纯水
测试条件
水样: 40ml trace enrichment @ 2.0 ml/min 色谱柱: C18 反相柱 (Waters) 梯度: 线性 100% 水－ 100% 乙腈 波长: 254 nm
1星期 1天 新鲜配制
• 尽量用流动相溶解样品
– 了解样品与色谱柱的基质/填料是否相互作用
• 抽真空
– 同上，一般在溶剂抽滤的同时，也有脱气的效果
• 超声波
– 简单，但效果不理想。
• 通惰性气体（一般用氦气）
– 可保持连续脱气，多用于低压梯度
• 在线脱气机
– 可保持连续脱气，多用于低压梯度
液相色谱对流动相的要求
• 除色谱柱对流动相的要求外，还有∶
– 与检测器匹配 – 脱气 – 避免卤素离子（不锈钢系统） – 溶剂的粘度 – 防止细菌的生长
0
5
10
15
20
25
分
检测器的保养
• 如长时间不用检测器可以关掉紫外灯
– 在4小时以上不用时，太频繁开关也不好
• 不要让缓冲液长期停滞在检测池内
– 用纯水冲洗
• 示差检测器及荧光检测器
– 注意流动池的耐压，不要在后面加压
关于自动进样器的针清洗
– Purge Injector 与 Needle Wash – 洗针溶剂瓶(绿色塑料管)不要放在717plus的上
高效液相色谱的维护与保养
液相色谱仪器的使用及保养
色谱泵的保养
• 流动相要过滤 • 常用缓冲液时，停泵前要用水冲洗，并用
水冲洗柱塞杆清洗孔 • 拧紧排液阀时，不要太用力，以不渗液为
准 • 更换流动相时，要保证两种溶剂的互溶性,
如不互溶，要用一种中间溶剂过渡. 例如:使用无机盐缓冲液时,用前和用后均 须用水过渡
• 超纯水，梯度实验时水中有机杂质含量要低 • 缓冲液的pH值，在填料的允许范围内 • 缓冲液（盐）的浓度 • 溶剂：色谱纯，并与填料相匹配 • 溶剂中的杂质含量
– 流动相对样品的溶解度
• 有机溶剂或水的比例
正确使用色谱柱（二）
• 样品预处理
– 除去微粒及杂质 – 了解样品在流动相中的溶解度
• 如样品的溶剂不是流动相，一定要用流动相试溶解 度，防止其在流动相中析出
部，应放于717plus同一水平面 – 洗针溶剂根据流动相的不同应有不同：
流 动 相洗 针 溶 剂 缓 冲 溶 液 ， 反 相 5 0 % 水 ∶ 5 0 % 甲 醇
纯 缓 冲 溶 液1 0 0 % 水 非 水 溶 液 ， 反 相 1 0 0 % 甲 醇 异丙醇？
正 相 流 动 相 G P C 流 动 相 离 子 交 换 对 离 子 试 剂 的 水 溶 液
流动相的保存
• 有机溶剂流动相:
– 室温下密封,避光保存
• 缓冲盐流动相:
– 当日现配现用 – 低温下密封保存,一般不超过3天 – 防止长菌
• 有机溶剂与水（缓冲盐）混配的流动相:
– 低温密封保存 – 防止有机相的挥发
• 选用适宜的容器
保存于聚乙烯瓶中的超纯水
测试条件
水样: 40ml trace enrichment @ 2.0 ml/min 色谱柱: C18 反相柱 (Waters) 梯度: 线性 100% 水－ 100% 乙腈 波长: 254 nm
液相色谱系统的清洗与钝化
• 一般采用30％磷酸作为清洗剂，用6M硝酸 作为钝化剂，先清洗再钝化
• 清洗的目的是去除不锈钢管路及系统内的 污垢
• 钝化的目的是使不锈钢管路的内表面形成 光滑均匀的氧化膜
高效液相色谱的维护与保养
色谱柱的使用及保养
测柱效 – 良好的色谱实验习惯
• 拿到一根新色谱柱时，先测柱效 • 保留在新色谱柱上测得的色谱图，并记录
600μl丙酮 – 进样量5μl – 检测波长:254nm
计算色谱柱的柱效 N
理论塔板数计算公式：
W
Wtan 16 Wh W3s 9 W4s 16 W5s 25
N
s
V1
2
s
方法W
切线法
5.54 半峰高
3s
4s
5s
色谱柱的正确使用及操作
• 流动相的转换
– 特别是GPC柱
• 流速(压力)的变化幅度：0.1ml/min
更换新Sentry Guard保护柱：第951次进样
色谱柱的清洗
• 对所做的样品要有充分的了解
• 用对该样品洗脱能力最强的流动相清洗
• 硅胶柱的一般方法
• 先用甲醇洗去极性杂质
记 • 住 用干∶ 燥每 的种 二色 氯甲谱 烷柱 、可 正能 庚烷有 1特 00定 ~20的 0m方 l依法 次活化
• 键合相柱一 (烷定 基要 )先 的看 一其 般使 方用 法说 明 ！
• 装置
– 在线过滤器 – 自装填料保护柱 – 预装保护柱
在线过滤器
• In-Line Filter，部件号 WAT084560
– 防止颗粒在色谱柱头累积 – 优点：基本不影响柱效 – 在需要高柱效的分析时中常用（如：氨基酸分
析）wenku.baidu.com
• 可更换的消耗品
– 更换滤芯，部件号 WAT005139 (5/pkgs) – 更换垫圈，部件号 WAT084567 (10/pkgs)
流动相的脱气
• 流动相脱气的目的
– 使色谱泵的输液准确
• 输液均匀准确，并且脉动减小 • 保留时间及色谱峰面积的重现性提高
– 提高检测的性能
• 防止气泡引起的尖峰 • 基线稳定，信噪比增加 • 溶剂的紫外吸收本底降低
– 保护色谱柱
• 减少死体积 • 防止填料的氧化
流动相脱气的方法
• 加热
– 简单，如同抽真空一起使用，其效果很好。但容易造成流动相 组成的变化
• 20倍柱体积的：甲醇-氯仿-甲醇-水依次冲洗 • 若使用缓冲液，需先用不含盐的水溶液清洗
色谱柱的存放
• 存放前的处理
– 除去杂质、缓冲盐
• 合适的存放溶剂 • 避免色谱柱床的干涸 • 避免机械震动 • 防止细菌生长 • 注意存放的温度
正确使用色谱柱（一）
• 流动相方面
– 除去微粒 – 纯度的要求
保护柱
• 可避免化学污染 • 新型保护柱可提高整个色谱柱的柱效，甚
至可作为色谱柱使用 • 保护柱选择： • 选用与色谱柱相同的填料
– 真正起到保护作用 – 保证色谱分离结果
色谱柱的保护
使用保护柱延长色谱寿命实例：磺胺药物分析
使用配Symmetry C8保护柱的色谱柱：首次进样
相同保护柱与色谱柱：第950次进样
色谱测试条件 • 定期检测柱效 • 定期检测仪器的谱带展宽
测柱效的方法
• 色谱柱种类繁多,性能各异,测定方法亦各不相同 • Waters的色谱柱均附有Use and Care说明书,可按说
明书所述方法测定 • 以下是Waters反相C18柱的测定方法:
– 流动相:乙腈/水=60:40;流速:1ml/min – 样品:50mg Acenaphthene(二氢苊)溶于100ml乙腈,加入
• 温度的变化幅度 • 专用色谱柱∶样品及溶剂的要求
记 住 ∶ 拿 到 一 根 从 未 用 过 的 色 谱 柱 时 一 定 要 先 看 其 使 用 说 明 ！
色谱柱的在线保护装置
• 给色谱柱提供物理的保护
– 除去样品及流动相中的颗粒
• 给色谱柱提供化学的保护
– 防止分析柱被化学污染
0
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分
2 星期
1 星期
1天 1 小时 新鲜配制 25
保存于标准棕色玻璃瓶中的超纯水
测试条件
水样: 40ml trace enrichment @ 2.0 ml/min 色谱柱: C18 反相柱 (Waters) 梯度: 线性 100% 水－ 100% 乙腈 波长: 254 nm
1星期 1天 新鲜配制
• 尽量用流动相溶解样品
– 了解样品与色谱柱的基质/填料是否相互作用
• 抽真空
– 同上，一般在溶剂抽滤的同时，也有脱气的效果
• 超声波
– 简单，但效果不理想。
• 通惰性气体（一般用氦气）
– 可保持连续脱气，多用于低压梯度
• 在线脱气机
– 可保持连续脱气，多用于低压梯度
液相色谱对流动相的要求
• 除色谱柱对流动相的要求外，还有∶
– 与检测器匹配 – 脱气 – 避免卤素离子（不锈钢系统） – 溶剂的粘度 – 防止细菌的生长
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检测器的保养
• 如长时间不用检测器可以关掉紫外灯
– 在4小时以上不用时，太频繁开关也不好
• 不要让缓冲液长期停滞在检测池内
– 用纯水冲洗
• 示差检测器及荧光检测器
– 注意流动池的耐压，不要在后面加压
关于自动进样器的针清洗
– Purge Injector 与 Needle Wash – 洗针溶剂瓶(绿色塑料管)不要放在717plus的上
高效液相色谱的维护与保养
液相色谱仪器的使用及保养
色谱泵的保养
• 流动相要过滤 • 常用缓冲液时，停泵前要用水冲洗，并用
水冲洗柱塞杆清洗孔 • 拧紧排液阀时，不要太用力，以不渗液为
准 • 更换流动相时，要保证两种溶剂的互溶性,
如不互溶，要用一种中间溶剂过渡. 例如:使用无机盐缓冲液时,用前和用后均 须用水过渡
• 超纯水，梯度实验时水中有机杂质含量要低 • 缓冲液的pH值，在填料的允许范围内 • 缓冲液（盐）的浓度 • 溶剂：色谱纯，并与填料相匹配 • 溶剂中的杂质含量
– 流动相对样品的溶解度
• 有机溶剂或水的比例
正确使用色谱柱（二）
• 样品预处理
– 除去微粒及杂质 – 了解样品在流动相中的溶解度
• 如样品的溶剂不是流动相，一定要用流动相试溶解 度，防止其在流动相中析出
部，应放于717plus同一水平面 – 洗针溶剂根据流动相的不同应有不同：
流 动 相洗 针 溶 剂 缓 冲 溶 液 ， 反 相 5 0 % 水 ∶ 5 0 % 甲 醇
纯 缓 冲 溶 液1 0 0 % 水 非 水 溶 液 ， 反 相 1 0 0 % 甲 醇 异丙醇？
正 相 流 动 相 G P C 流 动 相 离 子 交 换 对 离 子 试 剂 的 水 溶 液
流动相的保存
• 有机溶剂流动相:
– 室温下密封,避光保存
• 缓冲盐流动相:
– 当日现配现用 – 低温下密封保存,一般不超过3天 – 防止长菌
• 有机溶剂与水（缓冲盐）混配的流动相:
– 低温密封保存 – 防止有机相的挥发
• 选用适宜的容器
保存于聚乙烯瓶中的超纯水
测试条件
水样: 40ml trace enrichment @ 2.0 ml/min 色谱柱: C18 反相柱 (Waters) 梯度: 线性 100% 水－ 100% 乙腈 波长: 254 nm
液相色谱系统的清洗与钝化
• 一般采用30％磷酸作为清洗剂，用6M硝酸 作为钝化剂，先清洗再钝化
• 清洗的目的是去除不锈钢管路及系统内的 污垢
• 钝化的目的是使不锈钢管路的内表面形成 光滑均匀的氧化膜
高效液相色谱的维护与保养
色谱柱的使用及保养
测柱效 – 良好的色谱实验习惯
• 拿到一根新色谱柱时，先测柱效 • 保留在新色谱柱上测得的色谱图，并记录
600μl丙酮 – 进样量5μl – 检测波长:254nm
计算色谱柱的柱效 N
理论塔板数计算公式：
W
Wtan 16 Wh W3s 9 W4s 16 W5s 25
N
s
V1
2
s
方法W
切线法
5.54 半峰高
3s
4s
5s
色谱柱的正确使用及操作
• 流动相的转换
– 特别是GPC柱
• 流速(压力)的变化幅度：0.1ml/min
更换新Sentry Guard保护柱：第951次进样
色谱柱的清洗
• 对所做的样品要有充分的了解
• 用对该样品洗脱能力最强的流动相清洗
• 硅胶柱的一般方法
• 先用甲醇洗去极性杂质
记 • 住 用干∶ 燥每 的种 二色 氯甲谱 烷柱 、可 正能 庚烷有 1特 00定 ~20的 0m方 l依法 次活化
• 键合相柱一 (烷定 基要 )先 的看 一其 般使 方用 法说 明 ！
• 装置
– 在线过滤器 – 自装填料保护柱 – 预装保护柱
在线过滤器
• In-Line Filter，部件号 WAT084560
– 防止颗粒在色谱柱头累积 – 优点：基本不影响柱效 – 在需要高柱效的分析时中常用（如：氨基酸分
析）wenku.baidu.com
• 可更换的消耗品
– 更换滤芯，部件号 WAT005139 (5/pkgs) – 更换垫圈，部件号 WAT084567 (10/pkgs)
流动相的脱气
• 流动相脱气的目的
– 使色谱泵的输液准确
• 输液均匀准确，并且脉动减小 • 保留时间及色谱峰面积的重现性提高
– 提高检测的性能
• 防止气泡引起的尖峰 • 基线稳定，信噪比增加 • 溶剂的紫外吸收本底降低
– 保护色谱柱
• 减少死体积 • 防止填料的氧化
流动相脱气的方法
• 加热
– 简单，如同抽真空一起使用，其效果很好。但容易造成流动相 组成的变化
• 20倍柱体积的：甲醇-氯仿-甲醇-水依次冲洗 • 若使用缓冲液，需先用不含盐的水溶液清洗
色谱柱的存放
• 存放前的处理
– 除去杂质、缓冲盐
• 合适的存放溶剂 • 避免色谱柱床的干涸 • 避免机械震动 • 防止细菌生长 • 注意存放的温度
正确使用色谱柱（一）
• 流动相方面
– 除去微粒 – 纯度的要求
保护柱
• 可避免化学污染 • 新型保护柱可提高整个色谱柱的柱效，甚
至可作为色谱柱使用 • 保护柱选择： • 选用与色谱柱相同的填料
– 真正起到保护作用 – 保证色谱分离结果
色谱柱的保护
使用保护柱延长色谱寿命实例：磺胺药物分析
使用配Symmetry C8保护柱的色谱柱：首次进样
相同保护柱与色谱柱：第950次进样
色谱测试条件 • 定期检测柱效 • 定期检测仪器的谱带展宽
测柱效的方法
• 色谱柱种类繁多,性能各异,测定方法亦各不相同 • Waters的色谱柱均附有Use and Care说明书,可按说
明书所述方法测定 • 以下是Waters反相C18柱的测定方法:
– 流动相:乙腈/水=60:40;流速:1ml/min – 样品:50mg Acenaphthene(二氢苊)溶于100ml乙腈,加入