蔗糖酶实验一

（14）离心时不准打开机盖，不准扒扶在离心机上。待转子完全停下后才能打开盖。 转头使用后必须及时由转头室中取出、擦干，将管孔仔细擦净，然后再关机，等腔内干 燥后再关闭盖子。 （15）离心管内装载的溶液量必须合适，不锈钢管无盖，只能装 2／3，塑料管可装至“肩” 部。管盖必须盖严绝不允许漏液。空管离心会变形。塑料管使用有机溶剂必须符合规定。 （16）不允许无转头空转，放取转头必须用手柄，以防转头滑落。转头要轻放、卡稳， 旋下手柄时要用手扶住手柄只转转头。转头盖要盖严，无盖不准离心。上转子时切忌用力过 大，上的过紧，否则会造成缓冲环的损耗。
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2. 控制面板
高冷冻离心机 KDC–160HR 的仪器键盘上共由 13 个触摸式键组成。其基本功能及操作
方法如下：
图 10-18 高速冷冻离心机（KDC–160HR）
（1）显示窗口 —— 用以显示仪器的相关数据。 （2）不平衡指示灯 —— 离心过程中发生不平衡现象后，此指示灯亮。 （3）制冷指示灯 —— 该灯亮表示压缩机工作，灭表示压缩机不工作。 （4）离心指示灯 —— 该灯亮表示离心工作开始，灭表示离心工作结束。 （5）定时设定键 —— 用于样品离心所需时间的设定。 （6）温度设定键 —— 用于样品离心过程中所需温度的设定。 （7）转速设定键 —— 用于样品离心过程中所需转速的设定。 （8）转子设定键 —— 用于样品所用转子号的设定 （9）设定确认 —— 用于在每次设定参数后的确认。 （10）rpm/×g 键 —— 按此键，显示当前转速下的离心力。 （11）数字键 —— 用于对设定参数的修改。 （12）启动键 —— 按此键使离心机开始运转。 （13）停机键 —— 按此键使离心机停止运转。
四、蔗糖酶的纯度鉴定及其亚基分子量的测定（SDS–PAGE）；
五、蔗糖酶的酶学动力学性质分析系列实验： （一）反应时间对产物形成的影响； （二）pH 对酶活性的影响和最适 pH 的测定； （三）温度对酶活性影响和反应活化能的测定； （四）底物浓度对催化反应速度的影响及米氏常数 Km 和最大反应速度 Vmax 的测定； （五）尿素（脲）抑制蔗糖酶的实验； （六）棉子糖和果糖抑制蔗糖酶的实验。
实验一 蔗糖酶的提取与部分纯化
一、实验目的
学习酶的纯化方法，并为动力学实验提供一定量的蔗糖酶。
二、试剂
湿啤酒酵母、二氧化硅、蜗牛酶、甲苯（使用前预冷到 0℃以下）、无离子水（使用前 冷至 4℃左右）、冰块、1 mol / L 乙酸、95%乙醇（使用前预冷到 - 20℃以下）。
三、仪器
高速冷冻离心机、恒温水浴、大研钵 1 个、离心管 4 个、滴管 3 个、量筒 50 mL 1 个、 烧杯 100 mL 和 50 mL 各 2 个、广泛 pH 试纸、精密 pH 试纸或 pH 计。
第七章 综合性实验——酵母蔗糖酶的提取及其性 质研究
导言
本实验为学生提供一个较全面的实践机会，学习如何提取纯化、分析鉴定一种酶，并对 这种酶的性质，尤其是动力学性质作初步的研究。
自 1860 年 Bertholet 从酒酵母 Sacchacomyces Cerevisiae 中发现蔗糖酶以来，它已被广泛
3. 操作规程
打开电源开关后，离心机显示的是出厂前的设定值，按实验要求重新设定。
（1）定时设定
例：设定机器离心工作时间为：30 min。 ① 按 “定时设定” 键； ② 将数字 “ 3” 、 “ 0” 分别输入； ③ 按 “设定确认” 键以示确认， 记忆所设内容； ④ 时间设定操作完成，离心机将按照重新设定的时间运转。 ⑤ 连续运转：必须按照所需的离心时间进行离心的时间控制。连续按两次 “定时设定”
入并确认后，若想观察此时的离心力，则可按下 “rpm / ×g” 键， 离心机将按照设定的转 子号 （不同的转子号将代表不同的转子半径等参数）计算并显示出当前转速下的相对离心 力。
4. 使用注意事项
（1）未经过培训和考核者不能使用。使用离心机必须予约，用后必须登记。 （2）选择合适的转头和转速，绝不可超速使用。 （3）选择合适的温度，通常 4℃，除有机溶剂外不要低于零下，以免冰冻，损坏离心管 和转头。 （4）转头使用前必须将管孔擦净，并仔细检查有无裂痕和孔底白斑。若有则转头报废。 （5）离心机一次连续运转最好不要超过 60 min。 （6）仪器断电后，必须等待 3 min 以上，方可再次打开电源！ （7）开机后可以先 2500 rpm 空转，直到达到设定温度为止。 （8）要尽量缩短开盖时间，否则离心机内温度升高较大，会增加腔体内水汽凝结，加重 离心机的损耗。离心过程不得开启离心室盖，不得用手或异物碰撞正在旋转的转头。 （9）离心管必须成对或成△形放置，必须严格平衡，偏差＜0.1 g。小转子样品孔很多， 容易放错。 （10）离心进程如发现异常（如不正常噪音及振动），立即停机检查，未找出原因前不 得继续运转。 （11）平时不用时，应每月低速开机 1 ~ 2 次，每次 0.5 h，保证各部位的正常运转。 （12）若出现不平衡现象（过幅震动），离心机会自动停止离心和制冷，并发出报警声， 等 1 ~ 2 min 后，关断电源，再开门检查。 （13）偶然出现的转速达不到设定要求、不制冷、显示紊乱等，可能是错误操作造成， 请按操作面板上的“停机”键，稍等 3 min 后重新操作。
3.0 ~ 7.5 60℃
6.0 ~ 9.0
实验中，用测定生成还原糖（葡萄糖和果糖）的量来测定蔗糖水解的速度，在给定的 实验条件下，每分钟水解底物的量定为蔗糖酶的活力单位。比活力为每毫克蛋白质的活力单 位数。
本实验共有五个分实验： 一、蔗糖酶的提取与部分纯化； 二、离子交换柱层析纯化蔗糖酶； 三、蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定；
本实验提取啤酒酵母中的蔗糖酶。该酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内侧，在 细胞膜外细胞壁中的称之为外蔗糖酶（External Yeast Invertase）, 其活力占蔗糖酶活力的大 部分，是含有 50% 糖成分的糖蛋白。在细胞膜内侧细胞质中的称之为内蔗糖酶（Internal Yeast Invertase），含有少量的糖。两种酶的蛋白质部分均为双亚基，二聚体；两种形式的酶的氨 基酸组成不同，外酶每个亚基比内酶多两个氨基酸，Ser 和 Met。它们的分子质量也不同， 外酶约为 27 万 （或 22 万，与酵母的来源有关），内酶约为 13.5 万。尽管它们在组成上有 较大的差别，但其底物专一性和动力学性质仍十分相似，因此，本实验未区分内酶与外酶， 而且由于内酶含量很少，极难提取，本实验提取纯化的主要是外酶。
四、操作步骤
1. 提取 （1）准备一个冰浴，将研钵稳妥放入冰浴中。 （2）称取 30 g 湿啤酒酵母，称 10 mg 蜗牛酶及适量（约 5 g）二氧化硅，放入研钵中。 （3）量取预冷的甲苯 30 mL，用滴管缓慢地加入酵母中，边加边研磨成糊状，约需 40 min。 研磨时用显微镜检查研磨的效果，至酵母细胞大部分研碎。 （4） 缓慢加入预冷的 30 mL 去离子水，每次加 2 mL 左右，边加边研磨，至少用 20 min。 以便将蔗糖酶充分转入水相。 （5）将混合物转入两个离心管中，用天平平衡后，用高速冷冻离心机离心，4℃，10000 rpm，离心 10 min。如果中间白色的脂肪层厚，说明研磨效果良好。用滴管吸出上层有机相， 弃去甲苯沉淀。 （6）用滴管小心地取出脂肪层下面的水相，转入另一个清洁的离心管中，4℃，10000 rpm， 离心 10 min，弃去脂沉淀。 （7）将上清液转入量筒，量出体积，留出 1.5 mL （小试管 + 小烧杯，冰箱冻存），用
表 7-1 两种酶的性质对照表
名
称
MW
糖 亚
含 基
量
外 27 万 50% 双
酶 (22 万)
内
＜
13.5 万
双
酶
3%
Km (底物为 蔗糖)
26 mM
25 mM
Km (底物为棉
子糖)
等电点 pI
150 mM
5.0
150 mM
最适 pH
4.9 (3.5 ~ 5.5)
4.5 (3.5 ~ 5.5)
稳定 最适 pH 范围 温度
（3）转速设定
同 “定时设定” 操作。转速设定操作完成后，离心机将按照设定的转速值最终稳定 在 ± 100 r / min 范围内运转。
注：以上三项设定操作也可以在离心过程中随时修改。
（4）转子设定
同定时设定操作程序，将选定的转子先进行转子设定输入。
例如，本次离心使用的是 8 × 50 mL 角转子，则输入数字 “5” ，显示 rc – 5 。转子号输
高速冷冻离心机
1. 主要技术参数
图 10-17 高速冷冻离心机（KDC–160HR）
表 10-3 仪器主要参数
转头型号 rc
最大容量
最高Βιβλιοθήκη Baidu速（r / min）
最大相对离心力（g）
rc - 3
12 × 5 mL + 12 ×7 mL
rc - 6
4 × 100 mL
温度范围：-5℃ ~ + 40℃
14000 8000
键，面板 “定时” 处显示 “
” ，再按 “设定确认” 键即可。
（2）温度设定
同 “定时设定” 操作，设定范围为 -5℃ ~ 40℃ 。 “温度设定” 键按一次为设定正温度，即 0℃ ~ 40℃ ，连续按两次为设定负温度，即 0℃ ~ -5℃ ，输入所需的控制温度，然后按 “设定确认” 键即可。温度设定操作完成后， 当离心机腔体温度高于 12℃ 时，按 “ 9” 键离心机将会向设定值范围内启动压缩机预制 冷到 12℃ ，在预制冷过程中如再次按 “ 9” 键，预制冷工作将被取消。不按 “ 9” 键 离心机在工作时会启动压缩机制冷调温。
于测定酶活力及蛋白含量。剩余部分转入清洁离心管中。 （8）用广泛 pH 试纸检查清液 pH，用 1 mol / L 乙酸将 pH 调至 5.0，称为“粗级分 I”。 2. 热处理 （1）予先将恒温水浴调到 50℃，将盛有粗级分 I 的离心管稳妥地放入水浴中，50℃下
保温 30 min，在保温过程中不断轻摇离心管。 （2）取出离心管，于冰浴中迅速冷却，用 4℃，10000 rpm，离心 10min。沉淀可暂存。 （3）将上清液转入量筒，量出体积，留出 1.5 ml 冻存，用于测定酶活力及蛋白质含量
（称为“热级分 II”）。 3. 乙醇沉淀
（1）将热级分 II 转入小烧杯中，放入冰浴或者冰盐浴（没有水的碎冰撒入少量食盐） 中，逐滴加入等体积预冷至 - 20℃的 95%乙醇，同时轻轻搅拌，共需 30 min，再在冰浴中 放置 10 min，以沉淀完全。
（2）于 4℃，10000r pm，离心 10min，倾去上清，并滴干。废弃上清液之前，要用尿糖 试纸检查其酶活性（与下一个实验一起做）。沉淀保存于离心管中，盖上盖子或薄膜封口， 然后将其放入冰箱中冷冻保存（可以先标记为“乙醇沉淀”）。
地 进 行 了 研 究 。 蔗 糖 转 化 酶 （ Invertase ， 简 称 蔗 糖 酶 ）（ β–D– 呋 喃 果 糖 苷 果 糖 水 解 酶 ）
（Fructofuranoside Fructohydrolase）（EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的α - 呋喃果糖苷 键水解，具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解成密 二糖和果糖。