临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法
基因扩增检验标本的处理保存及核酸提取方法.
• 同上，重复洗涤一次 • 弃上清，沉淀即可用于DNA提取
• 5．体液 • 体液标本，包括胸水、腹水、脑 脊液、尿液等，可直接离心，取 沉淀物提取核酸。 • 血性胸腹水，可使用红细胞裂解 液处理：
• 加等体积红细胞裂解液，震荡混 匀，置5-10分钟
10000rpm，离心5分钟，弃上 清
可根据情况重复2-3次，沉淀物 用于DNA提取
具体方法：
• 用无菌平皿取患者肺深部咳出的痰液1-3ml， • 加入4倍体积4%NaOH，摇匀，室温下放置30 分钟左右液化 • 取1.5ml EP管，加0.5ml 液化痰液，再加0.5ml 4%NaOH室温放10分钟 •
•
• •
12000 rpm，离心15分钟 弃上清，加无菌生理盐水1 ml ，混匀， 12000rpm离心5分钟 弃上清，沉淀物用于 DNA提取
• 组织 • 新鲜组织最好保存于50%乙醇中， 具体方法：先用生理盐水将组织洗 一次，切成小块，加入适量生理盐 水，然后边摇边加入无水乙醇至终 浓度为50%，这样固定的组织标本 室温下可保存数日，4oC可保存6 年。
• 总而言之，标本的保存及适 当的预处理对核酸模板的成 功提取具有决定性作用。要 强调的是，所有用于上述处 理的容器如试管或离心管， 均应在使用前压灭菌。
• 实验中，如接触了“脏的”玻璃 器皿和其他物品以后，手套就可 能污染RNase，因此RNA提取 实验中，应勤换手套。
• RN A提取方法
• 下面以异硫氰酸胍结合氯仿-酚提 取法介绍RNA的提取。 • 异硫氰酸胍是一种强用力的蛋白质 变性剂，能迅速溶解蛋白质，导致 细胞结构破碎，核蛋白由于其二级 结构的破坏消失而迅速与核酸分离。
• 棉拭子 • 用PCR方法检测性病病原体时（衣 原体、支原体、淋球菌、梅毒螺旋 体、人乳头状瘤病毒等），临床标 本一般为棉拭子。标本取材是关键， 衣原体等病原体感染上皮细胞，因 此取材一定要取到细胞。
PCR实验室临床标本的采集、运送、接收程序
PCR实验室临床标本的采集、运送、接收程序1．目的：规范临床待检标本的正确采集、送检和处理。
2．适用范围：分子诊断室的所有临床检测标本。
3．负责人：操作人：4．程序：4．1 标本的采集4．1．1 标本由临床各科室接受过临床基因扩增检测有关标本采集、保存、运输知识培训的医护人员采集并送至实验室。
4．1．2标本采集要求a）血液标本：用2ml真空采集管或1.5ml高压灭菌离心管采集血液标本，血标本采集后在2小时内送达实验室（HCV采用EDTA 抗凝的血浆）。
离心（检验单与标本一道）后用一次性吸管吸取血清或血浆加入经消毒的1.5ml的离心管中，编号。
b）痰标本：用带盖的无菌一次性塑料瓶收集清晨第一口痰标本送检。
（对于无痰或少痰的患者，可用45℃加温的100g/L NaCl 水溶液雾化吸入或改变体位以使痰液易于咳出；对于小儿可以轻压胸骨柄上方以诱导咳痰，用消毒棉拭子刺激喉部引起咳嗽反射，用棉拭子采集标本。
）标本在室温下保存不能超过24小时。
c）生殖道拭子：尿道或阴道分泌物由医生用专用取样拭子（灭菌，一次性）采集样本，及时送检。
采集生殖道拭子标本，要求男性病人在采样前2小时内不能排尿，采样时，将棉拭子伸入男性尿道及女性宫颈口2～3cm，转动一周以获得上皮细胞。
d）尿液：由病人自留尿液于无菌封闭的杯中送检。
e）脑脊液和胸腹水：由临床医生采集后放入消毒的试管中及时送检。
注意：所有上述用于临床标本采集的容器如试管或离心管，均应使用前高压灭菌和密封。
4．2 标本的运送标本采集后，密闭、标（贴）姓名，应尽可能快的送至检测实验室，如运送时间需2小时以上，必须用冰盒送至实验室。
标本中如加入了适当的稳定剂，如用于RNA测定加入4mol/L异硫氰酸胍盐（GITC）的血清（浆）标本和用于DNA测定的EDTA抗凝血等，则可在室温下运送或邮寄。
4．5 接收4．5．1严格对各类样本的查对和双签制度，对病房各样本及时进行验收，查对，不符合要求的样本一律退回，并有书面记录。
PCR实验室临床标本的保存程序
PCR实验室临床标本的保存程序
1. 目的：为保持标本的状态，防止因外界条件改变对标本产生影响，保证检验结果的准确性。
2．范围：PCR实验室接收的标本。
3．职责：工作人员负责标本的贮存，保证标本状态的稳定。
4．程序：
4.1 工作人员应认真核对所接收的标本，按检测项目将送检标本分类。
4.2 血清/血浆样品：将样品离心，吸出血清/血浆，作好标记，按编号排列，置-20℃贮存。
4.3 用于DNA检测的核酸样本如需要保存时应在10mmol/Ltris、1mmol/LEDTA缓冲液（pH7.5-8.0）中，放置在标本处理区冰箱中4℃保存。
用于RNA检测的核酸要本应在缓冲液中-80℃保存。
4.4 样品出现问题的处理：样品在保管期内，一旦出现变质丢失等问题，有关人员应如实向科主任或技术负责人报告，并通知送样科室。
必要时，重新送样品。
4.5 所有样品均留有备用样品，供复检时使用。
4.6 样品移交：当样品在室之间或者虽在同一室内但在不同组间移交时应有移交记录和签字。
4.7 安全处理：自生物体的任何样品都应认定具有传染性，应按《实验室生物污染物处理程序》由专人进行处理。
4.8 样品保留时间：样品应在报告发出后，至少保留一月。
由专人处理，并记录。
4.9 诚实性、保密性：科室有义务为委托方保密，保证检验公正性和保密性。
5 引用的记录本附表003 标本超低温保存及处置记
录表。
临床标本的采集验收保存及核酸的提取PPT课件
6、体液
临床体液标本包括胸水，腹水，脑 脊液，尿液等，可按水样标本的方式离 心取沉淀后，提取核酸。沉淀样本的保 存同上。
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7、组织
组织有新鲜组织块和石蜡切片。新鲜组织块的处理 步骤首先用生理盐水洗两次，然后将其捣碎或切碎，加 入生理盐水后剧烈震荡混匀，离心，弃上清，再用蛋白 酶K消化后提取核酸。新鲜组织最好是保存于50%乙醇中， 具体办法是，先用生理盐水将组织洗一次，切成宽度小 于1cm的小片，加入适量的生理盐水，然后，边摇边加入 无水乙醇至终浓度为50%。这样固定的组织标本室温下可 保存数日，4℃可保存6年。
临床标本经前处理后 加入蛋白酶K缓冲液 56℃温育1小时 加入等体积饱和酚，充分振荡混匀 12000rpm离心5分钟
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取水相，加1/10体积的3mol/NaAc和2倍体 积的无水乙醇 -20℃30分钟或过夜 12000rpm离心10分钟 弃上清，用预冷75℃乙醇洗3次
干燥 取20μlTE或无菌去离子水悬浮
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4、DNA、RNA的保存
4℃是DNA保存的最佳和最简单的条件之一。 -70℃可能是长期保存的良好温度。但解冻时DNA 可产生缺口，因此不宜反复冻融。DNA在TE缓冲 液（10mmol/L tris-HCL，1mmol/LEDTA， PH8.0），4℃储存6个月以上，其中EDTA还可以 抑制微生物生长。
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2、标本的类型和采集量
标本的类型和采集量应根据所检测的 病原体而定并且重视和考虑同一病原体感 染部位不同所采集的标本类型亦不同：
比如：肺部结核应取深部晨痰；神经 系统结核应取脑脊液；泌尿系统结核应取 尿液（清晨一次全部尿量或24小时尿沉 渣）；胸腔腹腔结核可取胸水，腹水；另 外对于病变部位不明的病人亦可取抗凝血。
临床基因扩增检验标本的处理、保存和核酸提取方法及质量控制3讲述
标本采集
其他体液（TB/EBV-DNA等病原）
痰：深部痰液，不是唾液 胸腹水：无菌抽取，加抗凝剂 尿液：尿道口消毒，中段尿 鼻咽部：咽后壁分泌物EBV-DNA
分泌物（CT/UU/HPV-DNA等病原）
的整个提取操作过程中,都应戴一次性手套。 在RNA提取实验中，应勤换手套。
RNA提取的常用方法
表面活性剂加蛋白酶K，氯仿-酚抽提法。 胍盐提取结合氯仿-酚抽提法。 胍盐提取结合玻璃粉、二氧化硅等颗粒悬浮吸附法等。
核酸提取的改良方法
旋转离心柱（SPIN COLUMN）方法 玻璃粉吸附法 二氧化硅（Se）或硅藻吸附法 微量全血核酸提取法 ：NaI 方法 其它方法：疏水性Immobilon-P膜 、全自动核酸纯
去除或减轻抑制的一些方法
加入0.6% (wt/vol)牛血清白蛋白（BSA）可降低血液对Taq DNA聚合 酶的抑制效应，既使在2%（vol/vol）血液存在下亦可成功扩增，而通 常血液含量只能是0.2%。
BSA也可增加rTth或Taq DNA聚合酶的扩增能力，使其对粪便和肉类 标本中抑制物的抵抗能力分别提高10和20倍。
血红蛋白
1%(V/V)血液可完全抑制Taq酶活性，与Mg2+浓度无关。Tth聚合酶在 含4%（V/V）血液的PCR反应混合液中可以进行扩增，加入1U单链 DNA结合蛋白——T4基因32蛋白(gp32)，Tth聚合酶在含8%（V/V） 血液情况下，仍可扩增。因此，使用Tth聚合酶和gp32蛋白，可实现 从临床标本不提取纯化核酸直接扩增靶DNA。
单链DNA结合T4基因32蛋白（gp32）有类似BSA的增强效应。
PCR核酸检测操作步骤
PCR核酸检测操作步骤1、标本采集：咽拭子标本采集，这是核酸检测流程的第一步，采集完的标本要迅速放入样本保存管中，保存管内红色保存液具有灭活病毒的作用，可以保证检测标本在送往检测点过程的有效性。
2、标本转运：标本在严密包装下被护送到实验室，在运输全过程中有严格的保护措施，即防止标本损坏同时也要保证安全无泄漏。
3、标本录入：工作人员逐一拆开包装，将每一份标本的信息录入系统，这个“登记”的过程，也是为了更好地对接大家的后续报告和健康码。
4、提取核酸：专业技术人员将标本里面核酸提取出来，检验人员戴着双层手套，在生物安全柜内一管一管地拧开螺旋盖，手工吸取样本，加入核酸提取板孔中，再拧上螺旋盖将标本放回原处。
“有多少份样本就有多少次的重复操作“，这过程是检测中最危险与繁杂的过程。
每天面临大量的检测标本。
5、配制试剂：多少份标本就需要配制多少份试剂，多少份EP试管，又是几千个枪头的工作量，全手工分装。
6、加样：提取好的核酸只需要加入5ul进入试剂体系进行扩增。
5ul什么概念？一滴水的十分之一（大概20滴水是1ml）。
检验人员要用极小的枪头将每个提取好的核酸，“不能出错，不能有遗漏，不能发生生物安全事故”可以说检验人员全身时刻处于高度紧张的状态。
7、上机检测：经过复杂的前期制备工作，才能在PCR仪上进行扩增检测。
上机后，就是历时约1.5小时扩增检测，而且中间不能有停顿、不能有断电、不能有仪器故障，核酸检测才能完成。
当反应管在机器上开始检验后，也就意味着“开弓没有回头箭”——从采样到核酸制备任何一个缓解出现问题都可能导致返工重测，从而使报告时间加倍。
8、输出报告：走完上述步骤后，检测人员需要对扩增结果进行分析，包括同批随样本检测的阴阳性质控结果是否在控、基线设置、逐孔分析内标及样本结果是否正常等。
当阴阳性质控全部符合检测要求，排除假阴性、假阳性可能，对异常结果样本及时进行复核，确保无误后才能最终报告结果，并上传到健康码管理中心，完整的报告才能发布到用户手机中，而这份报告的背后融入了无数医疗工作者的汗水，真正的来之不易。
5-临床标本采集、保存及核酸的提取-唐翠燕
• 总之，标本的收集及适当的预处理，对用 于PCR测定的核酸模板的成功提取，具有
决定作用。
二、核酸的提取
• 待检样品中的核酸是PCR反应的模板，由 于PCR具有高度的特异性和敏感性，一些 样品甚至简单到不需要任何处理便可用于 PCR。但是在大多数的情况下，还是需要 对样品作适当的处理才能用于PCR。
• 下列试剂是制备RNA的常规试剂:
• 裂解液：4mol/L GuSCN，25mmol/L柠檬 酸钠pH7.0，0.5%Sarkosyl， 100mmol/Lβ-巯基乙醇（用前加入）
• 饱和酚：氯仿：异戊醇（50：49：1）
• 3mol/L NaAc pH5.2 • 无水乙醇 • 75%乙醇 • DEPC处理的无菌去离子水 • RNAasin(RNA酶抑制剂)
钟，待大块状物下沉后，取上清立即离 心，其后的沉淀即可用于DNA提取。如不 立即用于核酸提取，则需保存于-20℃下。
• 2.4 脓液
• 脓液的处理依情况而定，如用于分枝杆菌 （如结核杆菌）核酸测定的标本，粘稠的 脓液同痰标本的处理模式，先进行液化， 再离心取沉淀提取DNA；水样的脓液则直 接离心，沉淀用生理盐水洗2～3次后，即 可用于DNA提取。
• 2.2 痰
• 痰属于分泌物，临床上常用作结核杆菌 DNA测定样本，由于痰中含有大量粘蛋白 和杂质，故在核酸提取时，需对样本进行 初步处理，用4%NaOH液化，需注意的 是，液化时不能加热，液化时间不能过 长。
• 液化标本如不立即用于核酸提取，可保存 于-20℃下。此外，对用于非结核杆菌如肺 炎支原体的PCR检测，痰标本只能室温悬 浮于生理盐水中，充分振荡混匀，促使大 块粘状物下沉，取上清离心，所得到的沉
5
• 2.3 75%乙醇漂洗DNA，是为了去除残余 的盐类，去除过量SDS和酚等杂物，因为 SDS在75%的乙醇中保持溶解状态，不与 DNA共沉淀，从而通过弃上清液去除这种 去污剂,避免对以后PCR反应的影响。
临床PCR检验标本的采集、处理、保存及核酸提取方法
标本采集部位的准备（适度消毒） 标本的类型和采集量 （衣原体 上皮细胞） 采样质量的评价（评价方法：肉眼观察、显微镜下观察和化
学分析）
采样及运输容器（一次性无菌器材,防腐剂,抗凝剂） 标本采集中的防污染（一次性无菌容器，防止混入操作
者头发，表皮等，如玻璃容器要高压灭菌）
临床PCR检验标本的采集、处 理、保存及核酸提取方法
江西省肿瘤医院 陈文学
检验误差的发生率
1997年，一位意大利著名检验专家对急诊检验 误差发生的种类和发生率进行了统计。结果显 示，约有68.2%的检验误差发生在检验前期， 而来自检验中期和检验后期的误差率分别为 13.3%和18.5%。 2007年，这位专家又进行了类似的统计，结果 显示，检验前期的误差发生率仍高达61.9%
试剂准备 ①裂解液：50 mmol/L Tris-HCl， 10 mmol/L EDTA, 2% Triton X-100, 4 mol/L 异硫氰酸胍盐（GITC）, 0.3 mol/L 醋酸钠。 ②玻璃珠：（直径：425-600um）
乳汁标本离心6000rpm，5min，弃上清 脂质和沉淀用750ul裂解液重悬 重悬液移入含100mg玻璃珠离心管搅拌 煮沸5min，离心14000rpm，3min 650ul上清转移到另一离心管中，等体积异 丙醇沉淀
IgG
IgG的抑制作用是由于其与单链DNA
的相互作用，使得靶DNA不能与DNA 聚合酶相互作用
使用煮沸作为标本处理方法或使用
PCR前的热启动,将增强IgG对PCR反 应的抑制
去除或减轻抑制的一些方法
NaOH处理可中和临床标本中的Taq
DNA聚合酶抑制剂，但这种方法 不适用于DNA含量低的标本，因 为NaOH处理可使DNA大量丢失。
临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法共66页文档
16、自己选择的路、跪着也要把它走 完。 17、一般情况下)不想三年以后的事， 只想现 在的事 。现在 有成就 ，以后 才能更 辉煌。
18、敢于向黑暗宣战的人，心里必须 充满光 明。 19、学习的关键--重复。
20、懦弱的人只会裹足不前，莽撞的 人只能 引为烧 身，只 有真正 勇敢的 人才能 所向披 靡。
31、只有永远躺在泥坑里的人，才不会再掉进坑里。——黑格尔 32、希望的灯一旦熄灭，生活刹那间变成了一片黑暗。——普列姆昌德 33、希望是人生的乳母。——科策布 34、形成天才的决定因素应该是勤奋。——郭沫若 35、学到很多东西的诀窍，就是一下子不要学很多。——洛克
临床PCR检验标本的处理、保存及核酸提取方法共59页
60、生活的道路一旦选定，就要勇敢地 走到底 ，决不 回头。 ——左
45、法律的制定是为了保证每一个人 自由发 挥自己 的才能 ，而不 是为了 束缚他 的才能 。—— 罗伯斯 庇尔
Hale Waihona Puke 56、书不仅是生活，而且是现在、过 去和未 来文化 生活的 源泉。 ——库 法耶夫 57、生命不可能有两次，但许多人连一 次也不 善于度 过。— —吕凯 特 58、问渠哪得清如许，为有源头活水来 。—— 朱熹 59、我的努力求学没有得到别的好处， 只不过 是愈来 愈发觉 自己的 无知。 ——笛 卡儿
临床PCR检验标本的处理、 保存及核酸提取方法
41、实际上，我们想要的不是针对犯 罪的法 律，而 是针对 疯狂的 法律。 ——马 克·吐温 42、法律的力量应当跟随着公民，就 像影子 跟随着 身体一 样。— —贝卡 利亚 43、法律和制度必须跟上人类思想进 步。— —杰弗 逊 44、人类受制于法律，法律受制于情 理。— —托·富 勒
pcr实验室核酸提取流程
pcr实验室核酸提取流程PCR实验室核酸提取流程。
PCR实验室核酸提取是分子生物学实验中的重要步骤，它是从生物样本中提取DNA或RNA的过程。
本文将介绍PCR实验室核酸提取的流程及注意事项，希望能为实验人员提供一些帮助。
首先，准备样本。
样本可以是血液、组织、细胞培养物等，根据实验需要选择合适的样本。
样本的质量和纯度对提取的核酸质量有重要影响，因此在实验前要确保样本的质量良好。
其次，裂解细胞膜。
裂解细胞膜是核酸提取的关键步骤，可以选择化学法、物理法或酶法进行裂解。
常用的方法包括加入裂解缓冲液、冻融法和酶消化法等，根据不同的样本选择合适的裂解方法。
接着，使用载体吸附核酸。
在裂解后，核酸会以游离态存在于溶液中，需要使用载体将核酸吸附并固定。
常用的载体包括硅胶膜、硅胶柱或磁珠等，选择合适的载体可以提高核酸的纯度和回收率。
然后，洗脱核酸。
经过载体吸附后，核酸需要进行洗脱步骤，去除杂质和提高核酸的纯度。
洗脱液的选择和洗脱条件的控制对核酸提取的效果有重要影响，需要严格按照实验步骤进行操作。
最后，进行核酸定量和保存。
提取得到的核酸需要进行定量检测，可以使用紫外分光光度计或荧光定量仪进行测量，确保核酸的浓度和纯度符合实验要求。
另外，在保存核酸时，要避免冻融循环和长时间暴露在光线下，以保证核酸的稳定性和完整性。
在进行PCR实验室核酸提取时，需要注意以下几点，首先，严格控制实验条件，避免外源DNA或RNA的污染；其次，避免核酸降解，尽快进行提取和保存；最后，遵循实验步骤，避免操作失误导致实验失败。
总之，PCR实验室核酸提取是一项关键的实验步骤，正确的操作可以保证提取得到高质量的核酸样品，为后续实验提供可靠的基础。
希望本文的介绍能够帮助实验人员更好地进行核酸提取实验，提高实验效率和结果的可靠性。
临床PCR检验标本的采集、处理、保存及核酸提取方法共66页文档
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0
、
倚
南
窗
以
寄
傲
，
审
容
膝
之
易
安
。
谢谢！
51、 天 下 之 事 常成 于困约 ，而败 于奢靡 。——陆 游 52、 生 命 不 等 于是呼 吸，生 命是活 动。——卢 梭
文 家 。汉 族 ，东 晋 浔阳 柴桑 人 （今 江西 九江 ） 。曾 做过 几 年小 官， 后辞 官 回家 ，从 此 隐居 ，田 园生 活 是陶 渊明 诗 的主 要题 材， 相 关作 品有 《饮 酒 》 、 《 归 园 田 居 》 、 《 桃花 源 记 》 、 《 五 柳先 生 传 》 、 《 归 去来 兮 辞 》 等 。
53、 伟 大 的 事 业，需 要决心 ，能力 ，组织 和责任 感。 ——易 卜 生 54、 唯 书 籍 不 朽。——乔 特
55、 为 中 华 之 崛起而 读书。 ——周 恩来
临床PCR检验标本的采集、处理、保 存及核酸提取方法
6
、
露
凝
无
游
氛
，
天
高
风
景
澈
。
7、翩翩新 来燕，双双入我庐 ，先巢故尚在，相 将还旧居。
8
、
，
于
我
若
浮
烟
。
9、 陶渊 明（ 约 365年 —427年 ），字 元亮， （又 一说名 潜，字 渊明 ）号五 柳先生 ，私 谥“靖 节”， 东晋 末期南 朝宋初 期诗 人、文 学家、 辞赋 家、散
临床样本的采集运输和保存及核酸提取课件
3、核酸的浓缩、沉淀与洗涤
沉淀可去除部分杂质与某些盐离子 加入一定的盐类（醋酸钠、氯化钠等）后
使用有机溶剂（如乙醇、异丙醇等） 少数盐类可使用70-75%的乙醇洗涤
4. 核酸的鉴定
浓度鉴定 纯度鉴定 完整性鉴定
浓度鉴定
DNA：
1）紫外分光光度法：测定DNA在A260nm的光吸收值。 如计算DNA浓度
酚 抽 提 法 提 取 步 骤：
DNA酚抽提法示意图
主要试剂的作用：
EDTA：1. 二价金属螯合剂，抑制核酸酶； 2. 降低细胞膜的稳定性
SDS的作用： 1. 溶解膜蛋白和脂肪，从而使细胞膜破裂 2. 溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸
释放出来 3. 对RNA、DNA酶有抑制作用 4. 与蛋白质形成R-O-SO3 ….R蛋白质复合物，
2）荧光光度法 荧光染料溴化乙锭，可嵌入到碱基平面，而发 出荧光，且荧光强度与核酸含量呈正比。 适用于低浓度核酸溶液的定量分析（1-5ng）
EB与DNA的结合
纯度鉴定
紫外分光光度法：
在260nm和280nm处测定DAN溶液的光吸收，纯的DNA A260与A280之比 应在1.80 (1.60~1.80)，低于此值表明制备物中留有蛋白质成份。高 于此值表明有RNA的残留量
研究背景
样本的采集、处理 样本的保存 样本的运输 DNA的提取 RNA的提取
研究背景
一、样本的采集、处 理、保存及运输
临床标本的正确采集、运送、保存 的重要性
临床检验的质量保证关键性环节 解决涉及实验室检验的医患纠纷的方法之一
（一）、样本的采集
地贫检测样品采集： 外周血: ≥5mL 脐带血: 0.5~1mL 羊 水：20～30mL 绒 毛：≥15mg 唾 液 组 织
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棉拭子
在使用PCR方法检测性病病原体时,临 床标本一般为棉拭子,可将棉拭子置于 适量生理盐水中,充分震荡洗涤后,室温 静置5～10分钟,待大块状物下沉后,取 上清立即离心,其后的沉淀即可用于 DNA提取。
如不立即用于核酸提取,则需保存于70℃下.
脓液
脓液的处理依情况而定,如用于分枝杆菌(如结核 杆菌)核酸测定的标本,粘稠的脓液可采用痰标本 的处理模式，先进行液化，再离心取沉淀提取 DNA；水样的脓液则直接离心,沉淀用生理盐水 洗2～3次后,即可用于DNA提取。
DNA提取的经典方法
即所谓的” 酚-氯仿提 取法”
RNA提取的独特性
临床标本及实验室环境中,存在大量对 RNA 具 有 强 烈 降 解 作 用 的 RNase ， 而 RNase较耐高温,不易失活。
如何避免RNase对标本的污染及防止 RNase 对 提 取 的 RNA 的 降 解 , 是 保 证 RNA成功提取的关键之所在。
血清（浆）
DNA测定，可按照一般的血清标本处理程 序，对测定影响不大。
RNA测定，标本的获取和保存方式对测定 结果，可能有决定性影响。最好是使用 EDTA抗凝(严禁使用肝素，因其对PCR扩增有抑制， 且很难在核酸提取过程中完全去除)全血标本，抗凝 后6小时内分离血浆，如使用血清标本，则 需尽快(2小时内)分离血清，标本的短期 （1～2周）保存可在-20℃下，较长期保存 应在-70℃下。
外周血单个核细胞如暂不提取核酸,可保存 于-70℃下.
痰
痰属于分泌物,临床上常用作为结核杆菌DNA测定 标本。
痰标本中含有大量粘蛋白和杂质,故在核酸提取时, 需对样本进行初步处理，即用1 mol/L NaOH或变 性剂液化。
如用于非结核杆菌如肺炎支原体的PCR检测，痰标 本只能室温悬浮于生理盐水中，充分振荡混匀， 促使大块粘状物下沉，取上清离心，所得到的沉 淀物即可用于核酸提取。
样本中如加入了适当的稳定剂,如用于RNA 测定加入GITC的血清(浆)样本和用于DNA 测定的EDTA抗凝血等,则可在室温下运送或 邮寄。
实验室应根据待测靶核酸的特性，对各种 临床样本的运送条件作出相应的规定。
临床标本的处理和保存
血清（浆） 全血 外周血单个核细胞 痰 棉拭子 脓液 体液 乳汁 组织
（2）0.05%Tween 80。 （3）10%Chelex-100( 含0.03% Triton X-100和0.3%
Tween 20)
一定体积的痰 1.5倍体积的USP溶液,震荡30-40s 10-15ml蒸馏水，室温放置5-10min 5000g室温离心10-15min，弃上清 500ul无菌0.05%Tween80溶解或重悬 20000g室温离心10-15min，弃上清 加入5倍10%chelex-100，混匀，90℃温育40min
肝素的作用机理
肝素对MLV逆转录酶和TAQ DNA聚合酶均很强的 抑制作用，如果临床标本为肝素抗凝，则在核酸 纯化过程中，标本中的肝素可结合于DNA和RNA 上，尽管肝素和核酸本身都带正电荷。
对标本进行煮沸、凝胶过滤、酸碱处理后凝胶过 滤、反复乙醇沉淀等均不能去除肝素的这种干扰 作用。
肝素的作用机理
标本采集部位的准备（适度消毒） 标本的类型和采集量 （衣原体 上皮细胞） 采样质量的评价（评价方法：肉眼观察、显微镜下观察和化
学分析）
采样及运输容器（一次性无菌器材,防腐剂,抗凝剂） 标本采集中的防污染（一次性无菌容器，防止混入操作
者头发，表皮等，如玻璃容器要高压灭菌）
标本运送
样本一经采集，则应尽可能快的送至检测 实验室。
全血
以全血作为待测标本时,必须注意抗凝剂的 选择,一般使用EDTA-Na2或枸椽酸钠,不可使 用肝素。
全血样本如用于DNA提取检测,可4℃下短期 保存,如用于RNA检测，则应在取血后，尽 快提取RNA 。
外周血单个核细胞
外周血单个核细胞可从抗凝全血制备，主 要有两条途径，一是使用淋巴细胞分离液 分离制备；二是使用红细胞裂解液,裂解全 血中的红细胞,经生理盐水数次洗涤,即可得 到单个核细胞。
BSA也可增加Taq DNA聚合酶的扩增能力， 使其对粪便和肉类标本中抑制物的抵抗能 力分别提高10和20倍。
单链DNA结合T4基因32蛋白（gp32）有类 似BSA的增强效应。
核酸纯化
核酸分离纯化技术起源于二十世纪五十年 代，在七十年代和八十年代中传统的核酸 沉淀溶解分离纯化方法得到了普遍的应用 和推广。
正确采集、运送、保存临床标本 的重要性
质量保证关键性环节
解决涉及实验室检验的医患纠纷的方 法之一
核酸提取的重要性
核酸提取是临床PCR检验最为关键的部分
核酸提取的成败关系到临床PCR检验的正确 与否
临床PCR检验操作中最易出问题的环节
标本采集
标本采集时间对扩增检测结果的影响（过早或
过晚都可能会出现假阴性结果）
对于用于非分枝杆菌测定的脓液标本,如过于粘 稠,则加入适量生理盐水,充分振荡后,静置,取上 清立即离心,沉淀用于DNA提取;如为水样,则按 上述直接离心取沉淀即可。
沉淀标本的保存条件同样为-70℃。
体液
临床体液标本包括胸水,腹水,脑脊 液,尿液等,可按水样标本的方式离 心取沉淀后,提取核酸。沉样本 的保存同上。
组织
组织有新鲜组织块和石蜡切片。新鲜组织块的处理步聚首 先用生理盐水洗两次,然后将其捣碎或切碎，加入生理盐水 后剧烈震荡混匀,离心，弃上清，再用蛋白酶K消化后提取 核酸。
新鲜组织最好是保存于50%乙醇中,具体作法是，先用生理 盐水将组织洗一次,切成宽度小于1cm的小片,加入适量的生 理盐水,然后,边摇边加入无水乙醇至终浓度为50%.这样固 定的组织标本室温下可保存数日,4℃可保存6年。
一般均使用去垢剂(如Triton-100)裂解细胞， 用一种蛋白裂解酶(如蛋白酶K)消化结合于核 酸的蛋白质，从而将靶核酸从细胞内释放出 来。
核酸的分离纯化
核酸的分离纯化就是要将蛋白、脂类 等干扰核酸扩增的物质去除。
经典方法 硅吸附法 对于商品核酸提取试剂盒，临床实验
室在使用前，必须对其核酸提取纯度 和效率进行评价。
乳汁标本离心6000rpm，5min，弃上清 脂质和沉淀用750ul裂解液重悬 重悬液移入含100mg玻璃珠离心管搅拌 煮沸5min，离心14000rpm，3min 650ul上清转移到另一离心管中，等体积异 丙醇沉淀
70%乙醇洗涤沉淀，干燥 50ul Tris-EDTA溶解沉淀即可用于PCR扩增
乳汁
乳汁有时也可作为标本，如乳汁中HBV DNA、HCV RNA、结核分枝杆菌和布鲁氏 菌等的PCR检测。
乳汁中分枝杆菌DNA的提取
试剂准备 ①裂解液：50 mmol/L Tris-HCl， 10 mmol/L EDTA, 2% Triton X-100, 4 mol/L 异硫氰酸胍盐（GITC）, 0.3 mol/L 醋酸钠。 ②玻璃珠：（直径：425-600um）
每μg核酸标本中加入0.1U的肝素,即可100%的抑制 酶活性。
在标本中加入肝素酶I 或Ⅱ1~3 U/μg核酸(于5 mM Tris pH7.5, 1 mM CaCl2, 40 U RNase 25 ℃2小时) 可去除肝素的抑制作用。
血红蛋白、乳铁蛋白
血红蛋白和乳铁蛋白分别是红细胞和白细胞内的 主要PCR抑制物,它们均含有铁。抑制机制可能是：
DEPC是RNase的强烈抑制剂。灌满DEPC的器皿于37℃下 放置2小时，然后用灭菌水淋洗数次，并于100℃干烤15分 钟，最后高压蒸汽下15分钟。上述处理可除去器皿上痕量 的DEPC,以防DEPC通过羧甲基化作用对RNA的嘌呤碱基 进行修饰。
临床PCR检验标本的采集、处 理、保存及核酸提取方法
江西省肿瘤医院 陈文学
检验误差的发生率
1997年，一位意大利著名检验专家对急诊检验 误差发生的种类和发生率进行了统计。结果显 示，约有68.2%的检验误差发生在检验前期， 而来自检验中期和检验后期的误差率分别为 13.3%和18.5%。
2007年，这位专家又进行了类似的统计，结果 显示，检验前期的误差发生率仍高达61.9%
使用煮沸作为标本处理方法或使用 PCR前的热启动,将增强IgG对PCR反 应的抑制
去除或减轻抑制的一些方法
NaOH处理可中和临床标本中的Taq DNA聚合酶抑制剂，但这种方法 不适用于DNA含量低的标本，因 为NaOH处理可使DNA大量丢失。
去除或减轻抑制的一些方法
加入0.6% (wt/vol)牛血清白蛋白（BSA）可 降低血液对Taq DNA聚合酶的抑制效应， 既使在2%（vol/vol）血液存在下亦可成功 扩增，而通常血液含量只能是0.2%。
（1）与这些蛋白释放铁离子至PCR混合物中有关。 研究铁的抑制效应时，发现其干扰DNA合成，而 且胆红素、胆盐和氯化高铁血红素（Hemin）等 血红蛋白衍生物，也是PCR抑制物。
（2）1%(V/V)血液可完全抑制Taq酶活性
IgG
IgG的抑制作用是由于其与单链DNA 的相互作用，使得靶DNA不能与DNA 聚合酶相互作用
RNA提取所用器皿的处理
经高压灭菌的一次性使用的塑料制品如试管,离心管等基 本上无RNase,可以不经预处理直接用于制备和贮存RNA.
实验室用的普通玻璃器皿经常有RNase污染,使用前必须于 180℃干烤8小时以上,或用0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)的水 溶液浸泡用于制备RNA的烧杯,试管和其它用品。
液化标本如不立即用于核酸提取,可保存于-70℃ 下。
痰标本处理的基本模式
通用模式 简单模式
痰标本处理通用模式
（1）通用标本处理（Universal sample processing, USP） 溶液： 4-6 mol/L盐酸胍（GuHCl） 50 mmol/L Tris-HCl, pH7.5 25 mmol/L EDTA 0.5%十二烷基肌酸钠（Sarkosyl ） 0.1~0.2 mol/L β-巯基乙醇。