测序原理及流程图
高通量测序原理课件
高通量测序技术
采用并行测序的方法，能够大幅提高测序效率 和准确性。
高通量DNA。2DNA片段连接
将DNA片段连接到测序引物和适配器。
3
DNA扩增
通过PCR或桥式PCR扩增DNA片段。
4
测序反应
利用测序技术获取DNA片段的序列信息。
高通量测序原理课件
欢迎来到高通量测序原理课件！ 在本课程中，我们将深入介绍高通量测序的 原理和应用，帮助您理解这项革命性的技术。
高通量测序原理简介
高通量测序是一种先进的基因测序技术，它能够以前所未有的速度和准确度获取DNA序列信息。它已经在许多 领域产生了深远的影响。
测序方法概述
Sanger测序
Ion Torrent
无需芯片，具有快速和灵敏的 测序技术。
结论和展望
高通量测序技术的快速发展为生命科学研究带来了巨大的机遇。未来，我们 可以期待更加高效和经济的测序方法的出现，推动理和分析，得出DNA序列。
应用领域与发展趋势
高通量测序已经广泛应用于基因组学、医学研究、农业科学等领域。随着技术的不断革新，我们可以期待更多 令人兴奋的应用和创新。
主要技术平台对比
Illumina
市场主导者，提供高度准确和 高通量的测序服务。
PacBio
长读段测序，适用于复杂基因 组和结构变异的研究。
测序原理及流程图
测序原理及流程图
测序原理
目前关于测序方法主要采用双脱氧链终止法，双脱氧链终止法又称为Sanger法，其原理是DNA模板在DNA聚合酶、引物、四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)存在下进行复制时，在四管反应体系中分别按一定的比例引入四种双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。
由于ddNTP缺乏延伸所需要的3’-OH基团，当ddNTP掺入链的末端时，该链就会停止延伸。
如此每管反应体系中就产生了一系列长度不等的以ddNTP为3’端的DNA片段。
反应终止后，分4个泳道进行凝胶电泳以分离长短不一的DNA片段，相邻的片段长度相差一个碱基。
经放射自显影后，根据片段3’端的双脱氧核苷，便可获得合成片段的碱基排列顺序。
我们使用的是ABI3730测序仪以及配套的BigDye Terminator Kit，original v3.1我公司目前采用Applied Biosystems 3730XL测序仪是高质量的长片段读取和序列分析的测序平台，应用灵活而广泛。
3730XL可同时分析96个样品，该仪器采用4色荧光同时检测，可不间断24小时运行，自动灌胶，上样，电泳分离，检测及数据分析。
测序流程图。
基因组测序的原理与方法ppt课件
大规模基因组测序的 原理与方法
1
ppt课件.
“基因组”----生命科学的“元素周期表 ”
元素周期表
元素周期表的发现奠定了二 十世纪物理、化学研究和发展的 基础
人体解剖图奠定了现 代医学发展的基础
“基因组序列图”将奠定二十一世纪生 命科学研究和生物产业发展的基础！
2
ppt课件.
基因组学的基础理论研究
12
PCR（聚合酶链式反应）原ppt课理件.
反应所需物质：DNA模板、引物、DNA聚合 酶、dNTP、缓冲液 每个循环包括：变性（90℃）、退火（54 ℃）、延伸（72 ℃）
13
ppt课件.
Sanger 双脱氧末端终止法测序原理
14
DNA自动测序仪的发展 ppt课件.
自动荧光垂直板凝胶电泳测序仪 代表：ABI公司377型垂直板自动测序仪 96个泳道 读长高达700-800 bp 日分析能力达300个样品
STS图谱是最基本和最为有用的染色体物理图谱之一，STS （Sequence Tagged Site)本身是随机地从人类基因组上选 择出来的长度在200～300bp左右的特异性短序列（每个STS 在基因组中是唯一的，STS图谱就是以STS为路标（平均每 100Kb一个），将DNA克隆片段有序地定位到基因组上。
The genom e D N A
3 ,0 0 0 ,0 0 0 K b p
= 7 .3 7 2 8
29
48 superpools
ppt课件.
每 组 个
共 个
48
8
每8个96孔板组成1个superpool，384个96孔板组成48个superpools
30
ppt课件.
3.测序反应原理与介绍
测序反应三要素
1、引物 标准工作浓度是3.2p。客户自带引物通常是 其他不同浓度的，因此需稀释成标准工作浓 度 2、模板DNA 模板DNA分为菌提质粒和PCR产物 3、BigDye
引物稀释
1、稀释引物公式：加水量=（引物原体积X 原浓度∕3.2）-引物原体积。 2、用枪计量引物体积，并转入新离心管。 3、按上式计算出加水量，稀释引物。 4、若引物为合成1OD干粉时，则直接加 1000uL水稀释为5p。 5、引物5pM的不用稀释，直接吸到新离心管 中用，若引物较少也可以稀释到3.2p。
2、菌液
（1）自带引物：≥15个反应，抽取4~8个， 合格后方可继续测序 （2）通用引物： a.≥30个且≤96个反应，抽取4~8个反应试测 b.同一客户≥96个反应，分在2个以上96孔板 上，每板随机抽取4~8个反应试测，一整板 的可以抽取8个试测 （3）若样品系列较多(每个系列大于10个反 应)，则每个系列都应抽取到
测序反应原理与介绍
主讲人：李锐 2012.4.12
目录
第一部分：测序反应原理 第二部分：测序反应要素 第三部分：测序反应流程
PCR的定义： PCR（polymerase chain reaction) ： 聚合酶链式反应，又称体外 DNA扩增技术。
PCR反应原理
该技术是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖 核苷酸存在下，依赖于DNA聚合酶的酶促合 成反应。DNA聚合酶以单链DNA为模板，借 助一小段双链DNA来启动合成，通过一个或 两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模 板中的一段互补序列结合，形成部分双链。 在适宜的温度和环境下，DNA聚合酶将脱氧 单核苷酸加到引物3´-OH末端，并以此为起 始点，沿模板5´→3´方向延伸，合成一条新的 DNA互补链。
Sanger测序的基本原理、过程及注意事项
拖尾峰- 可能需要更换毛细管
四种颜色都出现拖尾峰通常是毛细管损坏最初的信号，表明需要更换毛细 管。 也可能是pH变化、氧化、温度变化或者是暴露在光下造成的。
拖尾峰- 只有碱基C拖尾
只有C或G峰拖尾通常是由于pH变化、氧化、温度变化或者暴露于光下造成。 如果用水或储存于4 ℃的甲酰胺，拖尾现象更严重。若这发生这种情况，推荐 换成新鲜的HiDi甲酰胺。
Reaction DNA
引物 (3.2 pmol/μL) BigDye (2.5x) Seq Buffer (5x) 去离子水 总体积
1/8x 1uL 1uL 0.5uL 1.75uL 5.75uL 10uL
1/16x 1uL 1uL 0.25uL 1.875uL 5.875uL 10uL
BigDye的终浓度：(2.5x ×0.25 μL + 5x ×1.875 μL ) / 10 μL = 1x
测序反应完成后存在什么？
荧光标记的测序产物 残留的荧光标记的ddNTP
为什么要进行测序产物纯化？
1、测序反应只消耗一小部分荧光标记的ddNTP(BigDye® Terminator） 2、残留的BigDye会随测序产物一起进入毛细管迁移，导致错误的碱基判
读
测序PCR产物的纯化
酒精/EDTA/NaAc法
Sanger测序的基本原理、过程及
热烈欢迎注莅意事临项参观指导
内容提要
一、Sanger测序的基本原理 二、Sanger测序的基本操作流程 三、Sanger测序的注意事项及常见问题
5’ 磷酸
3',5'-磷酸二酯键
脱氧核糖核苷酸通过形成3’，5’-磷酸二酯键延长DNA的链
化学原理：双脱氧末端终止法 无3’ OH的ddNTP阻止下一个dNTP的掺入
DNA及测序ppt课件
如果在DNA的合成反应中，除了加入4种正常的脱氧核 苷三磷酸（dNTP）外，再加入一种少量的2ˊ,3ˊ ddNTP，那 么多核苷酸链的延伸将与偶然发生但却十分特异的链终止展 开竞争，所以反应产物是一系列的长短不一的核苷酸链。
在 4组 独 立 的 DNA合 成 反 应 中 ， 分 别 加 入 4种 不 同 的 ddNTP，结果将生成4组核苷酸链，它们将分别（随机）终 止于每一个A，每一个G，每一个C，每一个T的位置上。对 这4组核苷酸链进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，就可读出序列。
5´
G A C T G A A G C T G T T
5´
C
T
G
A
C
T
T
C 读出待测 G
序列
A C
A
A
3´
（二）化学裂解法测序原理
用化学试剂处理末端放射性标记的 DNA片断，造成碱基的特异性切割。由此 产生的一组具有不同长度的DNA链的反应 混合物，经凝胶电泳按大小分离和放射自 显影之后，便可根据x光底片上所显示的 相应谱带，直接读出待测DNA片断的核苷 酸序列。
一、传统测序方法
（一）双脱氧链终止法(Sanger法) （二）化学裂解法（Maxam-Gilbert）
（一）双脱氧链终止法测序原理
Sanger双脱氧链终止法引入了双脱氧核苷三磷酸 （2ˊ,3ˊ-ddNTP）作为链终止剂。2ˊ,3ˊ-ddNTP脱氧核糖 的3ˊ位缺少羟基，它可以与多核苷酸链的3ˊ羟基形成磷 酸二酯键，但却不能与下一个核苷酸缩合，导致多核苷 酸链的延伸终止。
如果在DNA的合成反应中，加入一种少量的ddNTP， 则多核苷酸链的延伸将在随机的位点终止，生成一系列 长短不一的核苷酸链。在4组独立的DNA合成反应中， 分别加入4种不同的ddNTP，结果生成的4组核苷酸链将 分别终止于各个A，G，C，T的位置上。对这4组核苷酸 链进行高分辨变性聚CGGTAGCAACT 5´ 引物 5´ GG 3´
测序技术.ppt
（一）随机测序法
随机测序法（random approach）包括鸟枪法与人 工转座子法。其共同特点是无特定方向性，随机 对靶DNA进行测序，最后通过计算机拼装而得到完 整的序列信息。
（二）非凝胶基质毛细管电泳
为了避免CGE存在的问题，非凝胶基质毛细管电 泳用于DNA分析的研究越来越多，常见的有线性 聚丙烯酰胺和纤维素衍生物等非凝胶基质，这些 非凝胶基质在DNA测序中可以更换，使毛细管的 寿命延迟，在优化条件下可获得高效及高速的分 离效果。
（三）阵列毛细管电泳
阵 列 毛 细 管 电 泳 （ Capillary array electrophoresis, CAE）是将毛细管电泳与板凝 胶电泳的优势相结合，采用毛细管凝胶电泳的装 置，将多支毛细管进行并列进行分离与检测，以 板凝胶电泳的优势弥补了毛细管凝胶电泳的不足， 可一次检测多个样品。
人类基因组计划是当代生命科学一项伟大的 科学工程，它奠定了21世纪生命科学发展和现代 医药生物技术产业化的基础，具有科学上的巨大 意义和商业上的巨大价值。
经典方法 新技术方法
Sanger双脱氧链终止法(Sanger和 Coulson1977) Maxam-Gilbert DNA化学降解法 (Maxam 和Gilbert,1977)
通用引物的长度一般为15～30个核苷酸。
（三）DNA聚合酶
1．大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（Klenow片段） Klenow片段酶是Sanger法最早使用的DNA聚合
酶，具有5′→3′聚合酶和3′ → 5′外切酶 活性，但它催化链延伸反应的能力较差，用它 进行测序常产生较高的本底测序技术
测序_精品文档
测序测序技术介绍及应用摘要：测序是现代生物学研究中一种重要的技术手段，可以用于研究基因组、转录组和表观组。
本文旨在介绍测序的原理、常用的测序技术、测序数据分析的基本流程以及测序技术在生物学研究和医学应用中的重要作用。
一、引言随着DNA测序技术的不断发展，研究者可以更加深入地了解生命的本质。
通过测序，我们可以获取基因组、基因序列以及整个生物体内的遗传信息。
测序技术的重要性不言而喻，它在基因组学、转录组学、表观组学等领域起着至关重要的作用。
二、测序原理测序技术的原理是根据DNA的碱基序列信息，通过不同的方法将碱基按序进行识别和标记。
常见的测序原理有Sanger测序和下一代测序技术。
1. Sanger测序Sanger测序是一种经典的测序技术，它利用DNA聚合酶在模板链上添加dNTP（脱氧核苷酸三磷酸），以及引物链终止反应和分子量分析的方法，逐个测序DNA片段中的碱基。
2. 下一代测序技术下一代测序技术包括Illumina测序、Ion Torrent测序、PacBio测序和Oxford Nanopore测序等。
这些技术在测序过程中，通过将DNA片段连接到适当的载体上，通过PCR扩增或形成“微块”等方法，使得每个片段在同一时间被反复测序，大大提高了测序的速度和效率。
三、常用的测序技术目前，常用的测序技术主要包括Sanger测序和下一代测序技术。
1. Sanger测序Sanger测序是一种传统的测序技术，具有准确性高和稳定性好的特点，适用于小规模测序和验证性实验。
2. Illumina测序Illumina测序是下一代测序技术中最常用的技术之一，具有高通量、高精确度和较低成本的特点。
它利用DNA片段的桥式PCR和碱基逐个加入的方式，实现了对大规模DNA测序的高效率和高覆盖度。
3. Ion Torrent测序Ion Torrent测序是一种基于半导体技术的测序方法，它利用DNA聚合酶在模板链上加入dNTP的过程中释放出的质子信号来检测碱基的序列。
测序的基本原理和应用
测序的基本原理和应用测序是通过获取DNA或RNA序列信息来揭示生物体细胞遗传物质的基本单位，从而用于分析和研究生物体的基因组、转录组和表达谱等。
测序技术的发展为生命科学领域带来了巨大的进展，并在许多领域中得到了广泛的应用。
本文将从测序的基本原理和主要应用方面进行讨论。
1. DNA测序的原理：DNA测序是通过DNA串联的核苷酸在其中一种模板DNA上被连接和扩增的过程来获得DNA序列信息的。
主要的DNA测序技术包括dideoxy链终止法（Sanger测序法）和高通量测序技术（如Illumina测序技术）。
- Sanger测序法：Sanger测序法是一种经典的DNA测序技术，利用dideoxynucleotide triphosphates（ddNTPs）在DNA链延伸过程中终止扩增反应，从而根据终止位置确定DNA序列。
- 高通量测序技术：高通量测序技术利用一种叫做并行测序的方法，通过在DNA合成过程中引入已标记的核苷酸，标记的序列随后通过荧光信号来识别，从而实现快速高通量的测序分析。
常见的高通量测序技术包括Illumina测序技术、Ion Torrent测序技术、PacBio测序技术等。
2. RNA测序的原理：RNA测序是通过将mRNA或全转录本测序后转录为匹配DNA，从而获得RNA的序列信息的。
主要的RNA测序技术包括转录组测序（RNA-Seq）和single-cell RNA测序。
- 转录组测序（RNA-Seq）：RNA-Seq是一种直接从RNA样本中获得相关转录物信息的高通量测序技术，通过将RNA转录成与之相匹配的cDNA文库，并进行测序得到RNA序列。
RNA-Seq技术可以用于检测基因表达水平、寻找新的基因以及研究基因表达的多样性和调控机制。
- Single-cell RNA测序：Single-cell RNA测序技术是一种用于研究单个细胞的转录组的高通量测序技术。
它可以对单个细胞的转录本进行测序，从而获得单个细胞的基因表达模式，揭示潜在的细胞异质性和转录组的个体差异等。
dna测序基本原理及流程
dna测序基本原理及流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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一、样品制备。
1. DNA提取，从细胞或组织中提取DNA。
二代测序原理及流程
二代测序原理及流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor. I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!二代测序（Next-generation sequencing，NGS）是一种高通量的 DNA 测序技术，它能够同时对大量的 DNA 片段进行测序，从而快速、准确地获取生物体的基因组信息。
图解DNA测序技术的原理与操作
图解DNA测序技术的原理与操作DNA测序技术是一种快速准确地测定DNA序列的方法，它可以应用于基础研究、医学诊断、辅助决策等领域。
DNA测序技术的原理是通过测量DNA碱基之间的化学键来确定其序列。
DNA测序的发展历程DNA测序技术在20世纪中期开始发展。
当时，科学家们利用毒蕈碱和亚硝酸钠等化学试剂将DNA分解成单个核苷酸分子，然后通过电泳将分子按照大小分开。
通过观察电泳结果，科学家们得以确定碱基序列。
20世纪70年代末，Sanger发明了dideoxy法，使得测序技术得到了重大的进展。
dideoxy法以单链DNA为模板，在该模板上合成一系列新的DNA片段。
这些新的DNA片段不同于模板，因为它们以特定的方式截止于dideoxynucleotide。
这些dideoxynucleotide是无法延伸的，因此一旦它们被合成到了新的DNA片段中，该片段合成就截止了。
这种方法可以验证DNA序列，并且可以在大规模基因组测序任务中运用。
现代DNA测序技术现代DNA测序技术有多种，包括Illumina、Ion Torrent、PacBio和Nanopore等。
其中，Illumina是目前最广泛应用的测序技术之一。
Illumina 测序技术Illumina使用悬浮在小珠子上的（End-Bound）DNAs浓缩在测试管中。
在静止的状况下，铺设在黄色胶片上的DNA接头被拉伸，并用荧光标记的ddNTP来扩展从已接头的DNA的3'端到最近发出的碱基。
这种延长作用结合了测序信号和序列测量。
处理过的簇可以被移动到一个新的位置上，这样就可以在具有更高的通量和更高的密度下进行处理。
Illumina紧凑的读片机设计可容纳数以千亿的簇，因此即便少量的DNA也可以实现高通量测序。
DNA测序技术的操作步骤DNA测序的一般操作步骤包括：样品制备、文库构建、测序准备、碱基测序、数据解读和结果分析等。
具体步骤如下：样品制备：将待检测样品提取DNA，并在PCR扩增过程中对DNA进行分离和纯化，以使其达到测序指标。
Illumina平台测序原理及常见测序文库构建ppt课件
.
真核生物
总RNA
原核生物
利用Oligo (dT)富 集mRNA
去除 rRNA
将mRNA 随机打断成 ~200 nt
随机引物六聚体反转 录合成cDNA
末端修复，加A，加 接头后PCR扩增
Illumina 测序
55
链特异性转录组建库
每个泳道(Langos,P7 和P5接头)
.
9
仪器简介
单条DNA 模板
35个循环的桥式PCR
约1000条 DNA模板的 拷贝
cBot
HiSeq Sequencer
.
10单链 模板链杂交： 将单链DNA模板杂交到Flow Cell 上
.
13
桥式PCR扩增
单链DNA与FlowCell表面对应接头杂 交，形成“桥” 以接头为引物进行扩增
.
14
桥式PCR扩增
.
15
变性
变性双链的“桥” 得到与FlowCell相连的两条互补 的单链DNA分子
.
16
第二轮桥式PCR扩增
.
17
完成桥式PCR扩增
完成28循环的桥式PCR
.
18线性化• Exon主要用于人全外显子测序和目标区域测捕获方式
• 液相杂交
• 液相杂交是通过在溶液中， 利用链碱基配对的原理， 将DNA片段与探针杂交， 然后洗脱，富集目的片段。
.
49
Exon测序特点
• 优点：
• 不足：
• 1、 与全基因组测序相比，外 • 1、与全基因组测序相比，不能
• 合成 • 照相，收集信号 • 去阻断，切除荧
测序的基本原理：
一、测序的基本原理：测序的基本原理是Sanger末端终止法，在酶的作用下将原本是一条长达数百碱基的片断扩增成数百条片断，彼此间相差一个碱基。
用电泳分离这些片断后，再通过测序仪将这些信号转变成峰图，从而最终形成客户所看到的测序序列和测序的峰图。
目前通用的扩增方式是通过PCR的方式进行的起源；其原理简述如下：PCR类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
采用PCR的方式扩增目标片断具有以下优点：1. 微量的样品也可进行测序反应2. 操作简便3. 缩短了测序样品的准备时间。
因此目前所有提供测序服务的公司都是采用PCR扩增目标片断来进行测序的。
当然由于测序反应要求较普通PCR远为严格，因此在所用的酶和反应体系方面均进行了特殊处理。
二、测序的样品要求：测序由于是要进行特殊的PCR反应的，因此对样品的要求与其他试验的要求有所不同分别简述之：1. 样品的纯度：PCR具有短时间内高效的扩增能力，因此样品的纯度对反应有至关重要的影响。
当样品不纯的时候，那些杂质会对实验结果产生干扰。
这在PCR产物测序中表现的尤为明显，在测序结果上表现为峰图杂乱，过多的不可识别的碱基。
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测序原理及流程图
测序原理
目前关于测序方法主要采用双脱氧链终止法，双脱氧链终止法又称为Sanger法，其原理是DNA模板在DNA聚合酶、引物、四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)存在下进行复制时，在四管反应体系中分别按一定的比例引入四种双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。
由于ddNTP缺乏延伸所需要的3’-OH基团，当ddNTP掺入链的末端时，该链就会停止延伸。
如此每管反应体系中就产生了一系列长度不等的以ddNTP为3’端的DNA片段。
反应终止后，分4个泳道进行凝胶电泳以分离长短不一的DNA片段，相邻的片段长度相差一个碱基。
经放射自显影后，根据片段3’端的双脱氧核苷，便可获得合成片段的碱基排列顺序。
我们使用的是ABI3730测序仪以及配套的BigDye Terminator Kit，original v3.1我公司目前采用Applied Biosystems 3730XL测序仪是高质量的长片段读取和序列分析的测序平台，应用灵活而广泛。
3730XL可同时分析96个样品，该仪器采用4色荧光同时检测，可不间断24小时运行，自动灌胶，上样，电泳分离，检测及数据分析。
测序流程图。