HPLC结合紫外光谱法快速定性定量分析四种竹叶黄酮碳苷

第３４卷，第９期 光谱学与光谱分析Vol 畅３４，No 畅９，pp ２５６８‐２５７２２０１４年９月 Spectroscopy and Spectral Analysis September ，２０１４　HPLC 结合紫外光谱法快速定性定量分析四种竹叶黄酮碳苷张春娟１，孟志芬２，郭雪峰１倡，岳永德１，汤　锋１，喻　谨１，陈　超１，３１畅国际竹藤中心，北京　１００１０２ ２畅河南科技学院化学化工学院，河南新乡　４５３００３３畅安徽农业大学资源与环境学院，安徽合肥　２３００３６摘　要　采用HPLC 结合紫外光谱法，同时测定四种竹叶黄酮碳苷（荭草苷、异荭草苷、牡荆苷和异牡荆苷）。

采用Waters XTerra MS C １８色谱柱（２５０mm ×４畅６mm ，５μm ），流动相为乙腈和０畅５％甲酸水溶液，等梯度洗脱，流速１mL ·min －１，柱温３０℃，检测波长３６０nm 。

建立各个组分在０畅１～１０畅０mg ·L －１范围内系列浓度的混合标准工作曲线，其相关系数R ２均优于０畅９９９，且在２２min 内得到较好分离。

方法检出限介于０畅０３～０畅０７mg ·L －１，定量限介于０畅０４～０畅０８mg ·L －１。

分别将标准品与样品中四种黄酮碳苷的紫外光谱（２４０～４００nm ）进行比对，荭草苷、异荭草苷、牡荆苷和异牡荆苷相应的光谱曲线形状以及特征吸收波长都表现出高吻合度。

取竹叶样品经热回流提取，石油醚萃取及AB ‐８大孔树脂纯化后，再采用HPLC 结合紫外光谱法检测得荭草苷、异荭草苷、牡荆苷和异牡荆苷四种黄酮碳苷相对于竹叶黄酮粉的百分含量分别为１３畅７３，４９畅６８，７畅８５和３０畅７０mg ·g －１，平均回收率为３４畅９０％～８７畅６４％，相对标准偏差为０畅４１％～１０畅８３％。

本方法实现了在较短时间内快速分析竹叶中四种黄酮碳苷，样品稳定，重现性好，为市售竹叶黄酮碳苷的质量控制提供参考。

关键词　黄酮碳苷；HPLC ；紫外光谱；荭草苷；异荭草苷；牡荆苷；异牡荆苷中图分类号：O ６５７畅３ 文献标识码：A DOI ：１０畅３９６４／j 畅issn 畅１０００‐０５９３（２０１４）０９‐２５６８‐０５　收稿日期：２０１３‐１０‐１７，修订日期：２０１４‐０１‐２０　基金项目：国家“十二五”科技支撑项目（２０１２BAD ２３B ０３０２）资助　作者简介：张春娟，女，１９８９年生，国际竹藤中心硕士研究生 e ‐mail ：zhangchunjuan ＿g ood ＠１２６畅com孟志芬，女，１９７０年生，河南科技学院化学化工学院副教授 e ‐mail ：mengzf ＠y eah 畅net 张春娟，孟志芬：并列第一作者 倡通讯联系人 e ‐mail ：g xf ７１６２２＠icbr 畅ac 畅cn引　言 竹子是禾本科，竹亚科多年生植物，竹叶在我国具有悠久的食用和药用历史。

研究表明，竹叶中含有黄酮类，多糖，氨基酸等多种对人体有益的活性成分［１］，尤其是黄酮类物质是一类重要的抗氧化剂，具有抗衰老、抗自由基、防腐抑菌、调节血脂和血糖等生物功效［２，３］。

毛竹（Ph y llostachys edulis ）是刚竹属（Ph y llostachys ）代表性竹种，竹叶黄酮主要有荭草苷、异荭草苷、牡荆苷和异牡荆苷四种黄酮碳苷，其结构稳定，易溶于水，具有广阔的开发应用前景。

现有文献多采用分光光度法和高效液相色谱对样品中黄酮类物质进行分析测定，分光光度法测定结果易受花青素，酚酸等组分干扰，常用于总黄酮含量的测定；而HPLC 通过与标准品的保留时间和光谱曲线比对，具有分析时间短，结果准确可靠，针对性强等特点。

现今已有不少文献报道竹叶四种黄酮碳苷测定的HPLC 法［４］，尽管如此，高效液相色谱法在分析过程中还存在色谱条件优化的问题，尤其对结构和极性均相似的化合物。

研究采用HPLC 结合紫外光谱法，建立了同时测定四种竹叶黄酮碳苷的分析方法，实现了两对互为异构体的黄酮碳苷在较短保留时间内的有效分离。

此方法便捷，分析时间短，适用于大批量竹叶黄酮碳苷含量的测定，为竹叶黄酮产品的质量控制提供了一种简便可靠的模式。

１　实验部分1畅1　仪器与试剂２６９５型高效液相色谱仪（美国Waters 公司），配Waters ２９９６紫外检测器；旋转蒸发仪R ‐２２０（瑞士BUCHI 公司）；冷冻干燥机（美国LABCONCO 公司）；超纯水制备仪（美国Pall 公司）；BP ２２１s 电子天平（德国Sartorius 公司）。

异荭草苷、异牡荆苷、荭草苷和牡荆苷标准品（纯度≥９８％，上海融禾医药科技发展有限公司）；甲醇和乙腈（色谱纯，美国Fisher公司）；甲酸、石油醚和９５％乙醇（分析纯，北京化工厂）；AB‐８大孔树脂（安徽三星树脂科技有限公司）。

毛竹（P畅edulis）竹叶于２０１２年１１月采自江西南昌，由江西林业科学研究院肖复明研究员鉴定。

1畅2　标准溶液配制分别准确称取荭草苷、异荭草苷、牡荆苷和异牡荆苷标准品０畅０１０g，用５０％甲醇溶液（φ）溶解并定容至５０mL，配制成２００mg·L－１的单标储备液。

将单标储备液稀释成系列浓度的混合标准工作液（０畅１，０畅４，１，２，４，８，１０mg·L－１），绘制标准曲线。

1畅3　样品制备将采摘的毛竹叶置于室内风干，取１００g干样剪成小段，加入９５％乙醇，料液比１∶２０，８０℃热回流提取３次，每次２h，合并提取液并浓缩至无醇味。

用等体积石油醚重复萃取３次，合并水相，浓缩得浸膏。

将浸膏水溶后过AB‐８大孔树脂柱，依次用水、２０％乙醇、４０％乙醇洗脱，每次洗脱至流出液无色为止。

收集４０％乙醇洗脱液，旋转蒸发浓缩并冷冻干燥。

称取上述竹叶黄酮粉适量，超纯水溶解并稀释定容至４０mg·L－１，０畅４５μm微孔滤膜过滤，供HPLC测定使用。

1畅4　色谱条件Waters XTerra MS C１８色谱柱（２５０mm×４畅６mm，５μm）；采用A和B双泵系统，流动相A为乙腈，流动相B为０畅５％甲酸／水溶液（φ），１４％A等梯度洗脱２５min；流速１mL·min－１，柱温３０℃；进样量１０μL，检测波长３６０nm。

以保留时间和紫外吸收光谱定性，峰面积定量。

２　结果与讨论2畅1　色谱条件优化２畅１畅１　色谱柱选择竹叶黄酮大多为中等极性，常用反相色谱柱进行分离。

李洪玉等［５］用C１８diamonsil色谱柱（１５０mm×４畅６mm，５μm）测定不同来源竹叶中荭草苷、异荭草苷和异牡荆苷的含量。

龚金炎等［６］选用Luna C１８ODS色谱柱（２５０mm×４畅６mm，５μm）同步测定竹叶提取物中特征性的４个黄酮碳苷和４个酚酸。

此外也有用YMC‐Pack ODS‐AQ不锈钢色谱柱（４畅６mm×２５０mm，５μm）测定四种黄酮碳苷含量［７］。

本研究采用Waters XTerra MS C１８色谱柱（２５０mm×４畅６mm，５μm），色谱峰形窄且对称，灵敏度高，分析时间短，适用于四种黄酮碳苷的快速分析。

２畅１畅２流动相选择溶质分子的分离效果不仅与固定相有关，还取决于与流动相之间的作用。

文献中常用的有机溶剂有甲醇［８，９］和乙腈［１０，１１］。

由于黄酮类化合物的酚羟基在水溶液中易发生电离，导致色谱峰拖尾严重，常加入酸性调节剂，主要有冰醋酸［１２］、磷酸［１３］等。

本研究采用乙腈‐０畅５％甲酸／水溶液（１４∶８６）等梯度洗脱，既可以实现四种黄酮碳苷的有效分离，又可减少溶质分子在固定相上的保留，改善峰形。

２畅１畅３　流速选择流速也是色谱条件中的重要因素，本研究主要考察三个流速对四种黄酮碳苷分离效果的影响。

当流速０畅５mL·min－１时，４２min达到分离，分析测试时间较长，可考虑提高流速，相应减少保留时间；当流速１畅５mL·min－１时，四种碳苷在１５min内分离，但柱压偏高，对柱子有损害；当流速选择１mL·min－１时，四种碳苷既可有效分离，又能相应减少分析时间。

因此，最终流速选定为１mL·min－１。

2畅2　方法性能评价２畅２畅１　标准曲线和灵敏度按照所建立的方法，分别测定荭草苷、异荭草苷、牡荆苷和异牡荆苷系列标准工作液，平行测定３次，用平均峰面积（y）对质量浓度（x）进行线性回归，得各组分回归方程，其线性范围、相关系数、检出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantification，LOQ）见表１。

LOD和LOQ计算公式分别为：LOD＝B＋３SD，LOQ＝B＋１０SD，B为空白样品信号的平均值，SD为标准偏差。

Table1　Linear ranges，regression equations，correlation coefficients，LOD and LOQ of four flavone C‐g lycosides黄酮碳苷回归方程线性范围／（mg·L－１）相关系数检出限／（mg·L－１）定量限／（mg·L－１）荭草苷y＝３３０５７x－３８１０畅１～１０畅００畅９９９６０畅０５０畅０６异荭草苷y＝３１７３７x－８４４０畅１～１０畅０１畅０００００畅０６０畅０８牡荆苷y＝３０３３２x－５８５０畅１～１０畅００畅９９９７０畅０７０畅０８异牡荆苷y＝３００１５x＋４３２０畅１～１０畅００畅９９９６０畅０３０畅０４ 由表１可见，当四种黄酮碳苷的浓度在０畅１～１０畅０mg·L－１时，其峰面积与质量浓度相关性良好，相关系数均在０畅９９９以上，且异荭草苷的相关系数达到１，线性范围相对较宽，检出限介于０畅０３～０畅０７mg·L－１，定量限介于０畅０４～０畅０８mg·L－１。

２畅２畅２　精密度精密吸取１０mg·L－１混合标准工作液１０μL，连续进样５次，测定峰面积，荭草苷、异荭草苷、牡荆苷和异牡荆苷的平均峰面积分别为３３２４７０，３２２０８２，３１２１５１，３１６５３２，其峰面积RSD值在０畅３１％～２畅５０％之间。

２畅２畅３　重现性对同一批毛竹叶样品测定５次，荭草苷、异荭草苷、牡荆苷和异牡荆苷的平均含量分别为１３畅８０，４９畅９４，７畅７７和３０畅７５mg·g－１，四种碳苷含量的RSD值分别为２畅２４％，３畅４２％，１畅０５％和０畅８６％。

毛竹竹叶中异荭草苷含量最多，异牡荆苷含量次之，牡荆苷含量最少。

９６５２第９期 光谱学与光谱分析２畅２畅４　稳定性取４０mg ·L －１样品溶液，分别于０，２，４，８，１２h 进样１０μL ，重复测定５次，计算日内稳定性；同法，每日测定１次，连续测定５天，重复５次，计算日间稳定性。