氨基酸的离子交换柱色谱分离实验教案
汉密尔顿 季铵盐阴离子交换色谱柱
汉密尔顿季铵盐阴离子交换色谱柱1. 概述汉密尔顿季铵盐阴离子交换色谱柱是一种用于分离带有阴离子功能团的化合物的色谱柱。
它采用了季铵盐作为固定相，用于与分子中的阴离子交换，从而实现化合物的分离。
该色谱柱具有高效、快速、准确的特点，广泛应用于化学、生物、医药等领域。
2. 技术优势汉密尔顿季铵盐阴离子交换色谱柱具有以下几项技术优势：- 高效分离：色谱柱具有优异的分离效果，能够分离出不同阴离子功能团的化合物。
- 宽泛适用性：适用于多种化合物的分离，包括但不限于有机酸、无机阴离子、生物分子等。
- 良好的稳定性：色谱柱具有稳定的性能，能够长时间保持分离效果和分辨率。
- 高灵敏度：能够对微量样品进行分离，具有高灵敏度和准确性。
3. 应用领域汉密尔顿季铵盐阴离子交换色谱柱在多个领域得到了广泛的应用：- 生物医药领域：用于分离和分析生物样品中的阴离子化合物，如有机酸、氨基酸、糖类等，对于药物分析、生物标志物的研究具有重要意义。
- 环境监测领域：可用于水质、土壤等环境样品中有机阴离子的分析和监测，有助于环境保护和资源管理。
- 食品安全领域：可用于分析食品中的阴离子残留物，保障食品安全。
4. 使用注意事项在使用汉密尔顿季铵盐阴离子交换色谱柱时，需注意以下几点：- 样品制备：样品制备需要仔细、准确，避免混杂物对分离效果的干扰。
- 流动相选择：选择合适的流动相，通常采用含有盐类的缓冲溶液，以促进阴离子的交换。
- 柱温控制：控制色谱柱的温度，通常在室温下进行分离，可提高分离效率。
- 梯度洗脱：根据样品的特性和目标化合物的极性选择合适的梯度洗脱方法，以实现更好的分离效果。
5. 结语汉密尔顿季铵盐阴离子交换色谱柱作为一种高效、灵敏的色谱分离工具，在化学、生物、医药等领域具有重要的应用价值。
通过合理选择使用条件和良好的样品制备，能够进一步提高色谱分离的效果，为相关研究和应用提供有力支持。
汉密尔顿季铵盐阴离子交换色谱柱是色谱分析领域中一项重要的技术手段，其在分离化合物、分析样品中阴离子成分等方面有着广泛的应用。
氨基酸手性色谱分离
218Univ. Chem. 2023, 38 (10), 218–224收稿：2023-01-26；录用：2023-02-13；网络发表：2023-02-28*通讯作者，Email:*******************.cn基金资助：国家重点研发计划(2018YFC1602400)•知识介绍• doi: 10.3866/PKU.DXHX202301022 氨基酸手性色谱分离杜瑾，石宜灵，唐安娜*，孔德明南开大学化学学院，分析科学研究中心，天津市生物传感与分子识别重点实验室，化学国家级实验教学示范中心，天津 300071摘要：光学活性和立体构象不同的氨基酸，具有不同的生理活性和作用，因此，实现氨基酸的有效手性分离具有重要意义。
色谱法是常用的氨基酸手性分离方法，具有分离效率高、速度快、灵敏、成本低和绿色环保等特点，在氨基酸手性分离和检测领域应用广泛。
本文综述了色谱法在氨基酸手性分离方面的最新进展，并对其发展趋势进行了展望。
关键词：氨基酸；手性分离；色谱法中图分类号：G64；O6Chiral Separation of Amino Acids by ChromatographyJin Du, Yiling Shi, Anna Tang *, Deming KongResearch Center for Analytical Sciences, Tianjin Key Laboratory of Biosensing and Molecular Recognition,National Demonstration Center for Experimental Chemistry Education, College of Chemistry, Nankai University,Tianjin 300071, China.Abstract: Amino acids with different optical activities and stereo-configurations have different physiological activities and effects. Therefore, it is important to achieve the chiral separation of amino acids effectively. Chromatography is a commonly used method for the chiral separation and detection of amino acids, and is characterized by high separation efficiency, high speed, sensitivity, low cost, and environmental friendliness. In this paper, we review the recent progress of chromatographic methods in the chiral separation and analysis of amino acids and provide an outlook on their development trends.Key Words: Amino acids; Chiral separation; Chromatographic methods手性(Chirality)起源于希腊语，表达了某种化合物和其镜像化合物不能重叠的关系，正如人的左手和右手不能完全重叠(图1)。
《污染控制化学》实验-实验三 离子交换树脂分离水中钴和镍
实验三离子交换树脂分离水中钴和镍一、目的要求1、练习使用离子交换树脂的基本操作；2、学习使用离子交换色谱分离的一种重要方法——制备淋洗曲线。
二、原理在处理成铵型的阳离子交换树脂上加入Co2+、Ni2+混合液，Co2+、Ni2+吸附于柱顶。
用柠檬酸铵溶液淋洗，镍、钴的柠檬酸络合物不断移下，终于先后被淋出柱外。
用分光光度法测得淋洗液中镍和钴的浓度，以浓度对淋洗液体积作图制得淋洗曲线。
三、试液和试剂1、标准钴溶液：含Co 20mg/ml2、标准镍溶液：含Ni 20mg/ml3、Co2+、Ni2+混合液：含Co、Ni各10mg/ml4、2.5%柠檬酸铵溶液5、饱和NH4Cl溶液6、732#强酸型阳离子交换树脂，Na型（苯乙烯型）7、HCl 2 mol·L-18、甲基橙指示剂溶液：0.1%9、NaOH 6 mol·L-1四、仪器1、离子交换柱2、722型分光光度计，1cm比色皿五、分析步骤1、离子交换树脂处理取用水浸泡一夜的阳离子交换树脂装入交换柱中（约30~40cm高），用2 mol·L-1HCl淋洗至流出液中无Na+为止，然后用蒸馏水淋洗至近中性，再用饱和NH4Cl淋洗至流出液对甲基橙呈碱性反应（呈橙色），再用50ml蒸馏水淋洗。
2、离子交换色谱分离用移液管吸取10mlCo2+、Ni2+混合液，倾于处理好的树脂上，以每分钟25~30滴的速度下流，然后用50ml蒸馏水淋洗，调好流速为2.0ml/min，用柠檬酸铵溶液淋洗。
在镍淋出前每10分钟收集一次（用10ml量筒收集），镍淋出时每5ml收集一次，钴淋出后每10ml收集一次，至淋出液无色。
将收集的溶液分别在670nm和520nm处测定其吸收值A。
钴络合物流出前后所收集的溶液可能含有镍和钴，应该两种都测定。
由工作曲线查出各部分溶液的浓度，以浓度相对应的体积，作图绘制淋洗曲线。
并计算镍和钴的回收率（两峰重叠部分不计算在内）。
3、工作曲线绘制标准Co工作曲线：移取20mg/ml Co标准液0.5、1.0、2.5、3.5、5.0ml于50ml容量瓶中，用柠檬酸缓冲液定容至刻度，摇匀，于722型分光光度计（1cm比色皿，520nm）以试剂空白为参比测A，绘制工作曲线。
强阳离子交换色谱
强阳离子交换色谱
强阳离子交换色谱（Strong Anion Exchange Chromatography，SAX）是一种液相色谱技术，常用于分离和分析带有负电荷的分子，例如有机酸、核苷酸、糖类、氨基酸和蛋白质等。
在SAX色谱中，样品在高压下通过离子交换树脂柱，树脂中含有大量的阴离子官能团，如磺酸基团（SO3H）和羧基团（COOH）。
样品中带有负电荷的分子与树脂中的阳离子发生相互作用，从而在树脂表面发生交换反应，被分离出来。
SAX色谱通常使用有机溶剂作为移动相，如甲醇、乙腈和二甲基甲酰胺等，以增加样品与树脂之间的相容性。
同时，SAX色谱还可以通过调节移动相的pH值、离子强度和流速等参数来控制分离效果。
SAX色谱具有分离效率高、分离范围广、重复性好等优点，在生物化学、生物医学、环境科学等领域得到了广泛应用。
实验四 氨基酸纸层析
7. 将滤纸条两端，用大头针钉在小木框上，吹 干后用喷雾器均匀地喷一层0.2%茚三酮乙醇溶 液，然后再将滤纸条吹干，即可看到纸上显出 三色点，每个色点代表一种氨基酸。 8. 分别测量并计算三种氨基酸的Rf，再根据教 师供给的值确定此三个色点各为何种氨基酸。 9. 留在试管内的酚溶剂切勿弃去，塞紧塞子。
实验四 氨基酸纸层析、 折光率的测定
一、实验目的
１、本实验采用纸色谱对几种氨基酸进行 分离和鉴定,以了解纸色谱的原理，练习其 操作方法。 2 、了解测定折光率的简单原理，掌握阿 贝折射仪的使用方法。
二、实验原理
1、色谱分析法（简称色谱法或层析法） 色谱分析法简称色谱法或层析法。1906年， 俄国植物学家Tsweet将CaCO3放在竖立的 玻璃柱中，从顶端倒入植物色素的石油醚浸 取液，并用石油醚冲洗。在柱的不同部位形 成色带，因而命名为色谱。管内填充物称为 固定相，冲洗剂称为流动相。 色谱法就是利用混合物中各组分在固定相和 移动相中进行反复的吸附或分配作用，达到 各组分分开的目的。
分类:
(1)按照被分离物质在固定相中的作用原理 不同，色谱法可分为吸附色谱、分配色谱、 离子交换色谱等。 (2)按照操作方式不同，又可分为柱色谱、 薄层色谱、纸色谱、气相色谱、和高效液 相色谱等。
纸色谱为分配色谱，色谱过程在固定相构 成的平面状层下进行。滤纸为载体，固定 相为滤纸上的水，流动相（展开剂）为用 水饱和过的有机溶剂。纸色谱属于分配色 谱。 衡量物质向上移动的物理量是比移值（Rf）
三、实验步骤
（一）纸层析
1．在滤纸条上端边缘约1厘米的中央剪一小 孔。 2．将滤纸条平放于洁净的纸上，在距离滤纸 下端1cm处用铅笔轻画一横线，并在横线的 中央画一直径为2mm的小圆圈。 3．用毛细管吸取氨基酸混合液，在滤纸条下 端的小圆圈内点样。
实验六 纸层析法分离氨基酸
实验材料与试剂
实验试剂 1、氨基酸标准液(1mg/mL) 四种氨基酸是丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸,脯氨酸分别配制成一定浓度 的溶液。
2、80%甲醇(稀释前需测比重)。
3、0.1%茚三酮丙酮溶液。 4、0.5%茚三酮丙酮溶液。
5、氨基酸混合液(每种氨基酸500mg/mL)。
6、正丁醇(需重蒸，沸程：116～120℃)。
B、点样：点样要合适，样品点的太浓，斑点易扩散或拉长，以致分离不 清，氨基酸的点样量以每种氨基酸含 5～20μg为宜，将准备好的滤纸悬 挂在点样架上，滤纸垂直桌面，用点样管(也可用血色素管代替)吸取氨 基酸样品10μg(1μg/μL)，与滤纸垂直方向轻轻碰触点样处的中心，这时 样品就自动流出。点样的扩散直径控制在0.5cm之内，点样过程中必须 在第一滴样品干后再点第二滴，为使样品加速干燥，可用一加热装置(如 吹风机或灯泡)，但要注意温度不可过高，以免氨基酸破坏，特别是谷氨 酰胺破坏，影响定量结果。 将点好样品的滤纸两侧比齐，用线缝好，揉成筒状。注意缝线处纸 的两边不要接触。避免由于毛细管现象使溶剂沿两边移动特别快而造成
质的组分在两相中的分布不同，因此当流动相移动时，不同组分移动的速度也
不相同。易溶于流动相中的组分移动快，在固定相中溶解度大的组分移动就慢， 于是得到分离。
分配层析法中不同溶质的分离取决于其在两相 (固定相和流动相)间
分配系数的不同。分配系数(α)的定义是：
α=溶质在固定相的浓度(CS)/溶质在流动相的浓度(CL)
计算出 4种氨基酸在酸系统中的Rf值。
注意
使用茚三酮显色法，必须在整个层析操作中避免手直
接接触层析纸，因为手上常常有少量含氮物质。显色时它也
呈现紫色斑点。污染了层析结果，因此操作时应戴橡皮手套 或指套。同时也要防止空气中的氨。
OPA-FMOC联用柱前衍生化法氨基酸类成分测定原理及其在药物分析中的应用
流动相梯度：
时间(min) 0.0 12.0 15.0 30.0 35.0 38.0 49.0 52.0
流动相B（%） 0 22 22 70 70
100 100
0
流速（ml·min-1） 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.5 1.5 1.0
每次实验前 要根据实际 情况，对梯 度进行微调
样品配制
单位： mg/mL
试验注意事项
流动相PH值必须精确调节至7.20±0.05
PH值 ，这样才能保证试验的可重复性
试验开始前，各泵一定要用纯水过度，
泵
特别是B泵（有机相），避免流动相中盐
的析出而损坏泵
衍生 试剂
衍生试剂稳定性较差，长时间放置后会 氧化变质，色谱峰增多，干扰检测。一 般在4℃下可以保存1周左右
OPA-FMOC联用柱前衍生化法
1986年惠普/安捷伦将OPA和FMOC衍生反应依次 结合，实现了氨基酸的全自动衍生、色谱分离和 检测。
让样品先与OPA试剂充分反应，将一级氨基酸全部 反应完全，接着样品中剩余的二级氨基酸再与 FMOC反应。
由于FMOC、FMOC衍生物和反应副产物比任何 OPA衍生物的疏水性都强，所以它们不会干扰任何 一级氨基酸的检测。
纯水 纯水 硼酸盐 OPA FMOC 样品
柱前自动衍生过程
从1号瓶中吸取0uL水
纯水 纯水 硼酸盐 OPA FMOC 样品
柱前自动衍生过程
从4号瓶吸取1uLOPA试剂
纯水 纯水 硼酸盐 OPA FMOC 样品
柱前自动衍生过程
从1号瓶中吸取0uL水
纯水 纯水 硼酸盐 OPA FMOC 样品
柱前自动衍生过程
纯水 纯水 硼酸盐 OPA FMOC 样品
实验二 氨基酸的离子交换柱色谱分离
实验二氨基酸的离子交换柱色谱分离【原理】本实验采用磺酸型阳子交换树脂（732型）分离酸性氨基酸（天冬氨酸Asp pI=2.97）和硷性氨基酸(赖氨酸Lys pI=9.74)的混合液。
在pH5.3条件下，因为低于Lys的pI值，Lys可解离成阳离子挂在树脂上；高于Asp的pI值，则Asp可解离为阴离子，不能被树脂吸附而直接流出色谱柱，在pH 12条件下，因高于Lys的pI值，Lys又解离为阴离子从树脂上被交换下来，这样通过改变洗脱液的pH值可使它们被分别洗脱而达到分离的目的。
【操作】1、树脂的处理关于市售新树脂的处理见注1，关于树脂浮洗的方法参照讲义所述，本实验采用处理好的树脂。
2、装柱：将色谱柱垂直装好，关闭柱底出口，在柱内注入约2cm高pH5.3的柠檬酸缓冲液。
将浮选后已转成钠型的树脂置于烧杯中，加进1～2倍体积的柠檬酸缓冲液，经抽气处理后，搅成悬浮状沿柱内壁细心地把柱灌满，倒时不要太快，以免产生泡沫。
待树脂在柱底部逐渐沉积2～3cm高时，用吸管吸去柱内上层所出现的清液，慢慢打开柱底出口，继续加注树脂悬液，直至柱体装到8cm高度为止。
在装柱时要避免使柱内液体流干而使装柱失败，另外树脂悬液的温度要相对恒定（特别是对于采用高温法）。
装好的柱体应该没有纹路，没有裂痕，没有气泡和柱顶表面平整而均匀，这样方可投入使用，否则要重装。
3、平衡：柱装好后接上预先调好的恒流泵，用柠檬酸缓冲液以24ml/hr的流速平衡，直到流出液的pH与洗脱液的pH相同为止（pH试纸检查），这大约需要2～3倍床体积。
4、加样与洗脱：移去柱上的液器塞，打开柱底出口，小心使柱内液体流至柱表面时即行关闭。
用加样吸管吸取0.5ml氨基酸混合样品溶液。
沿柱壁小心地加入柱中，加样时不要过快，以免冲坏树脂表面，加样后慢慢打开柱底阀，使液面再与树脂面相齐时关闭，然后再用吸管吸取适量洗脱液如此清洗柱内壁四周1～2次。
洗涤后，用缓冲液在柱内加到约2cm 高的液层，然后接上恒流泵，调流速0.5ml/分即开始洗脱。
实验八离子交换色谱分离混合氨基酸（初稿）.doc
实验八离子交换层析离混合氨基酸一、目的要求1. 了解离子交换树脂层析的工作原理及操作技术。
2. 学会用离子交换树脂层析法分离混合氨基酸。
二、实验原理有些高分子物质含有一些可以解离的基团，因此可以和溶液中的离子产生交换反应。
这类高分子物质统称离子交换剂，其中使用的最普遍的是离子交换树脂。
由于一定离子交换剂对于不同离子的静电引力不同，因此在洗脱过程中，不同的离子在离子交换柱上的迁移速度也不同，最后完全分离。
本实验采用磺酸型阳离子交换树脂分离酸性氨基酸天冬氨酸（Asp，pI=2.97，分子量为133.1）和碱性氨基酸赖氨酸（Lys，pI=9.74，分子量为146.2）的混合液。
在pH=5.8条件下，因为pH值低于Lys的pI值，Lys可解离成阳离子结合在树脂上；Asp可解离成阴离子，不被树脂吸附而流出层析柱。
在碱性条件下，因pH值高于Lys的pI值，Lys可解离成阴离子从树脂上被交换下来。
这样，通过改变洗脱液的pH值可使它们被分别洗脱而达到分离的目的。
三、试剂与器材1、材料磺酸型阳离子交换树脂（732型）2、试剂树脂处理液：2mol/L NaOH、2mol/L HCL、1mol/L HCL、1mol/L NaOH、0.10mol/L 柠檬酸缓冲液（pH=5.8）、0.01mol/L NaOH溶液、天冬氨酸、赖氨酸、茚三酮、无水乙醇。
0.2％中性茚三酮溶液：0.2g茚三酮加100ml丙酮（或者---显色剂：2克水合茚三酮溶于95%乙醇中，加水至100毫升）。
标准氨基酸溶液：将天门冬氨酸和赖氨酸分别配成2mg/mL的0.1mol/L盐酸溶液。
混合氨基酸溶液：将上述天门冬氨酸和赖氨酸溶液按1：4比例混合。
3、器具离子交换层析柱（1.6X20cm）、量筒、吸管、收集器、试管及试管架、恒流泵。
四、操作方法1、新树脂的处理和转型干树脂用蒸馏水充分浸泡膨胀后，倾去细小颗粒，然后用4倍体积的2mol/L HCL和2mol/L NaOH依次浸洗搅拌30min，并分别用蒸馏水洗至中性（最后应处理至溶液无黄色）。
高效液相色谱法测定氨基酸的研究进展
高效液相色谱法测定氨基酸的研究进展赫欣睿;武中庸;叶永丽;高旭东;陈士恩;马忠仁【摘要】氨基酸是构成生物体的基础物质,氨基酸分析是生命科学研究中最重要的领域之一.高效液相色谱法因分析速度快、操作简便、检测灵敏、适用范围广等优点而广泛应用于食品工业、制药工业、生命科学研究等领域.该文综述了高效液相色谱分析氨基酸的方法,包括柱后衍生法、柱前衍生法、高效阴离子交换色谱-积分脉冲安培检测法和高效液相色谱-蒸发光散射检测法.并对上述方法进行了比较,为日常的氨基酸分析提供了参考.【期刊名称】《分析测试学报》【年(卷),期】2016(035)007【总页数】7页(P922-928)【关键词】氨基酸;高效液相色谱法(HPLC);柱前衍生;柱后衍生;综述;研究进展【作者】赫欣睿;武中庸;叶永丽;高旭东;陈士恩;马忠仁【作者单位】西北民族大学生命科学与工程学院,甘肃兰州730124;西北民族大学生命科学与工程学院,甘肃兰州730124;西北民族大学生命科学与工程学院,甘肃兰州730124;西北民族大学生命科学与工程学院,甘肃兰州730124;西北民族大学生命科学与工程学院,甘肃兰州730124;西北民族大学生命科学与工程学院,甘肃兰州730124【正文语种】中文【中图分类】O657.72;O629.7氨基酸是构成蛋白质大分子的基础物质，与生命活动息息相关。
目前，自然界中发现的氨基酸约有300种，而组成生物体蛋白质的氨基酸约有20种。
氨基酸分析在生物化学、食品科学、临床医学、饲料科学、化工等领域具有重要作用，因此改进和发展氨基酸的分析方法对于人类具有重要意义。
高效液相色谱法(High performance liquid chromatography，HPLC)是在经典液相色谱和气相色谱的基础上发展的新型分离分析技术，具有分离效能高、速度快、操作简便、检测灵敏度好、对样品适用范围广等特点，已广泛应用于各领域。
高旭东等[1]建立了黄芩苷、盐酸小檗碱和大黄素的高效液相色谱检测方法。
氨基酸液相检测方法
氨基酸液相检测方法引言：氨基酸是构成蛋白质的基本组成单元，对于研究蛋白质结构和功能具有重要意义。
液相检测方法是一种常用的氨基酸分析方法，它具有灵敏度高、分辨率好、操作简便等优点。
本文将介绍氨基酸液相检测方法的原理、步骤和应用。
一、原理氨基酸液相检测方法是利用液相色谱技术实现的。
液相色谱是一种将混合物分离成各个组分的方法，其原理是根据各个组分在色谱柱中的保留时间来进行分离。
在氨基酸液相检测中，常采用离子交换色谱柱或手性色谱柱进行分离。
离子交换色谱柱是利用固定在柱子上的离子交换剂与氨基酸分子间的静电作用进行分离，根据氨基酸的电荷性质进行选择性吸附和洗脱。
而手性色谱柱则是利用固定在柱子上的手性选择性吸附剂与氨基酸分子的手性结构进行分离，根据氨基酸的手性性质进行选择性吸附和洗脱。
二、步骤氨基酸液相检测方法的步骤主要包括样品制备、色谱条件设定、色谱分离和检测等。
1. 样品制备：将待测样品进行适当处理，如酸水解或碱水解，以使氨基酸分子释放出来。
然后将样品进行过滤和稀释，以便进行后续的色谱分离和检测。
2. 色谱条件设定：选择合适的色谱柱和流动相，根据样品特性和分离要求进行条件设定。
对于离子交换色谱柱，可以选择不同的离子交换剂和缓冲剂，调节pH值和离子浓度等；对于手性色谱柱，可以选择不同的手性选择性吸附剂，调节流动相的组成和流速等。
3. 色谱分离：将样品注入色谱柱，利用色谱柱内固定相的选择性吸附作用，将各个组分分离开来。
根据各个氨基酸的特性，调节流动相的条件，使目标氨基酸在适当的保留时间内分离出来。
4. 检测：利用检测器对分离出的氨基酸进行检测。
常用的检测器有紫外检测器和荧光检测器。
紫外检测器可以根据氨基酸的吸收特性来进行检测，荧光检测器则可以根据氨基酸的荧光特性来进行检测。
三、应用氨基酸液相检测方法在生物医药、食品安全等领域有着广泛的应用。
在生物医药领域，氨基酸液相检测方法可以用于蛋白质结构和功能研究，如氨基酸序列分析、蛋白质修饰研究等。
211216232_氨基酸分析仪检出限以及分离度不确定的评定
2023年第2期品牌与标准化氨基酸分析仪是一款广泛应用于食品科学、农业环境、生物化学、医疗卫生及化工领域的分析仪器[1-2]。
氨基酸分析仪的基本原理为：试样经过前处理去蛋白之后，样液经离子交换柱层析分离，被分离出的氨基酸通过柱后衍生与茚三酮溶液反应显色，用紫外检测器检测，外标法定量[3-4]。
检出限是评价分析方法的重要指标，一般分为仪器检出限、分析方法检出限。
仪器检出限是指分析仪器能区分噪声的最低检出浓度的能力，而方法检出限不但与仪器噪声有关，还与方法全部流程的各个环节相关。
目前，研究方法检出限的较多，但较少有针对仪器检出限不确定度进行评定的方法。
为正确评估仪器检出限，本文将针对氨基酸分析仪进行仪器检出限不确定度的评定，为检出限不确定度评定提供解决方案。
分离度是氨基酸分析仪判断待测物质在色谱柱中分离情况的另一个重要指标。
氨基酸分析仪的分离度是指峰高分离度。
本文通过结合分离度和仪器检出限的不确定度分析，对氨基酸分析仪的性能水平作出准确评价。
1材料与方法1.1材料与仪器17种氨基酸混合标准溶液：浓度约为1mmol/L ，扩展不确定度为0.02~0.04mmol/L （k =2），中国计量科学研究院生产；电子天平：Ⅰ级，感量为0.1mg ，METTLER TOLEDO 公司；L-8900型氨基酸分析仪：日立公司；游标卡尺：测量范围为0~150mm ，最小分度0.02mm ，检定的不确定度为0.04mm ，k =2，桂林广陆数字测控股份有限公司；容量瓶：100mL/250mL/1000mL ，A 级。
Evaluation of Uncertainty ofDetection Lmit and Resolution of Amino Acid AnalyzerTONG Junting（Liaoning Institute of Measurement ，Shenyang 110004，China ）Abstract ：In this paper ，the mixed standard substance of amino acid is used to evaluate the uncertainty of detection limit and resolution of amino acid analyzer.The results show that the expanded relative uncertainty of the detection limit is 9.6%.Through uncertainty analysis ，the fluctuation of baseline noise has the greatest impact on the detection limit of the instrument.Reducing baseline noise can effectively improve the detection limit of the instrument.The expanded relative uncertainty of degree of separation is 6.1%.Through uncertainty analysis ，the uncertainty of reference materials and concentration of the analytes has the greatest impact on the degree of separation.Appropriately increasing the concentration of the analytes within the linear range of the instrument can effectively improve the degree of separation of the instrument.Key words ：amino acid analyzer ；evaluation of uncertainty ；detection limit ；degree of separation氨基酸分析仪检出限以及分离度不确定的评定佟俊婷（辽宁省计量科学研究院，辽宁沈阳110004）【摘要】本文使用氨基酸混合标准物质，对氨基酸分析仪检出限以及分离度进行不确定度评定。
氨基酸分析方法
HPLC: Auto-Tag/OPA ❀ 开发出第一个完整的用在HPLC上的氨基
酸分析试剂包
✎ Waters Pico-Tag方法(1984)
❀ 目前性能最好的氨基酸分析方法
✎ Waters AccQ-Tag方法(1993)
N
O
衍生后的氨基酸
+
HO
O
N
O
N-羟基琥珀酰亚胺
AccQ·Tag氨基酸分析
❀简便的样品衍生程序
✎过滤1.0 ml 水解液 ✎取10 微升放入6x50mm 衍生管中(干燥) ✎加入 AccQ-Tag 缓冲液,涡旋混和并加入AQC衍生剂 ✎于 55 ℃烘箱中加热10 分钟. (tyrosine) ✎即可进样
AccQ-Tag)
柱后衍生方法的特点
❀ 优点
✎ 样品制备的工作量较少 ✎ 离子交换分离对本底的耐受性最好 ✎ 丰富的文献背景
❀ 缺点
✎ 硬件配置复杂，用途专一，灵活性差 ✎ 购买及维护成本高 ✎ 一般来说，分析时间很长 ✎ 破坏氨基酸的固有结构
柱后衍生技术的比较
技术
检测
检测限 （典型）
反应条件
限制
柱前衍生技术的比较
技术 检测模式 典型检测限 反应条件
限制
Dansyl Chloride
PTH NBD Chloride
OPA
UV 254 荧光 UV 269 荧光
荧光
FMOC
荧光
PITC
UV 254
AQC
UV 248 荧光
OPA/FMOC 荧光
低至中 pmole 困难
分离衍生困难
离子交换色谱分离混合氨基酸操作流程
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氨基酸组成分析
影响氨基酸分析结果的三大因素是：水解、衍生、色谱。 水解是第一步，水解的完全与否对结果影响很大。在实验中 通常采用一些标准蛋白质，如细胞色素c(Cyt c)、核糖核酸 酶(RNase)或胰岛素(insulin)为标样进行水解、衍生和色 谱分析来计算回收，从而考验蛋白质分析的可靠程度和评价 方法的适用性。 但由于各种蛋门质含有的氨基酸多少不同，并且每一种氨 基酸的量也不一样，有的氨基酸含量可多到十几个，有的 氨基酸含量只有1～2个，这影响到氨基酸的回收。生物应 用公司（ABI）曾设计过一种“测试肽”，即人工合成18种 不 同氨基酸的肽(除Gln、Asn外)，这样每种氨基酸出现的频 率都是1，用此肽来校正回收，看来机会均等，是一种可以 采纳的方法，但在实际样品中，不太可能出现这种理想情 况。
(4)PTC-AA分析法 属柱前衍生法，源于Edman降解法测定蛋白质的一级结 构。异硫氰酸苯酯(PITC)能在碱性条件下和氨基酸反应， 生成PTC-AA，此法分析灵敏度和荧光胺、OPA的荧光法 相同，优点是能同时检出初级和次级氨基酸，在254nm检 出，缺点是操作繁琐，水和盐的副反应敏感，要求较高的操 作技术。
(1)还原烷化法 产生能抗水解的半胱氨酸衍生物。烷化试剂包括4—乙烯 吡啶和碘代乙酸。但这些方法有缺点，为了确保试剂接近巯 基，还原和氧化通常在变性剂存在下进行，多余试剂和变性 剂要用HPLC、沉淀法或透析去除，每一步都可能造成样品的 损失，特别是对于小肽和微量样品，而且烷化反应如果不仔 细控制条件，可能导致半胱氨酸以外其他残基的衍生。 (2)氧化法 氧化反应被用来转化半胱氨酸和胱氨酸成为半胱磺酸，过 甲酸氧化反应的缺点是它会影响其他氨基酸特别是甲硫氨酸 会转变成甲硫氨酸砜，酪氨酸会降解。为克服这一 缺点，必 须准备能分析两次的样品量，一次提供半胱氨酸数据，另一 次则提供其他氨基酸的组成数据。
钠离子氨基酸色谱柱
钠离子氨基酸色谱柱技术一、引言在现代生物化学分析领域，对于氨基酸的检测与定量具有重要的意义。
钠离子氨基酸色谱柱是一种高效液相色谱(HPLC)技术中的关键组件，专门用于分离和分析氨基酸类化合物。
本文档旨在详细介绍钠离子氨基酸色谱柱的原理、使用方法、维护保养以及在不同领域的应用，为相关技术人员提供全面的参考资料。
二、钠离子氨基酸色谱柱概述钠离子氨基酸色谱柱是专为氨基酸分析设计的色谱柱，其填料表面修饰有钠离子，能够与氨基酸分子中的羧基形成离子交换作用，从而实现对不同氨基酸的有效分离。
这种色谱柱通常由耐用的材料制成，如硅胶或聚合物，以保证在多次使用过程中的稳定性和重现性。
三、原理与机制3.1 离子交换机制钠离子氨基酸色谱柱的分离原理基于离子交换机制。
当样品流经色谱柱时，氨基酸分子与固定相上的钠离子发生可逆的离子交换反应。
由于不同氨基酸的电荷性质和结构差异，它们与色谱柱的亲和力也不同，从而实现分离。
3.2 洗脱过程在洗脱过程中，通过改变流动相的离子强度或pH值，可以调节氨基酸分子与色谱柱的相互作用力，使得不同的氨基酸按特定的顺序从色谱柱中洗脱出来。
四、设备与材料- HPLC系统：包括泵、自动进样器、柱温箱、检测器等。
- 钠离子氨基酸色谱柱：专用于氨基酸分析的色谱柱。
- 流动相：通常为含有钠盐的缓冲溶液，pH值和离子强度根据需要调整。
- 氨基酸标准品：用于校准和质量控制。
- 样品处理试剂：用于样品的预处理，如蛋白沉淀剂、滤膜等。
五、操作流程5.1 样品准备- 样品采集后，进行适当的前处理，如蛋白质去除、过滤等。
- 根据需要调整样品pH值和离子强度，以适应色谱条件。
5.2 色谱条件设置- 根据待测氨基酸的性质选择合适的流动相。
- 设置合适的流速、柱温和检测波长。
5.3 样品注入与洗脱- 将处理好的样品注入HPLC系统。
- 开始洗脱程序，收集并记录色谱图。
5.4 数据分析- 使用相应的软件对色谱图进行分析，确定氨基酸的种类和含量。
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氨基酸的离子交换柱色谱分离
【实验目的】
1.掌握离子交换树脂分离氨基酸的基本原理；
2.掌握离子交换柱层析法的基本操作；
3.掌握氨基酸和茚三酮显色反应机理及洗脱曲线的绘制。
【实验原理】
1.离子交换层析原理
离子交换层析是一种用离子交换树脂做支持剂的层析法.离子交换树脂是具有酸性或碱性基团的人工合成聚苯乙烯和苯二乙烯等不溶性高分子化合物.树脂一般都制成球形的颗粒.阳离子交换树脂含有的酸性基团如磺酸基(一S03H),磷酸基(一P03H),亚磷酸基(一PO2H),羧基(一COOH),酚羟基(一OH)等,可解离出H离子,当溶液中含有其他阳离子时,例如在酸性环境中的氨基酸阳离子,它们可以和H 离子发生交换而"结合"在树脂上
本实验采用磺酸型阳子交换树脂（732型）分离酸性氨基酸（天冬氨酸Asp pI=2.97）和碱性氨基酸(赖氨酸Lys pI=9.74)的混合液。
在pH5.3条件下，由于pH低于Lys的pI值，Lys可解离成阳离子，吸附在树脂上；又由于pH高于Asp的pI值，则Asp可解离为阴离子，不能被树脂吸附而直接流出色谱柱。
在pH12条件下，因pH高于Lys的pI值，Lys又解离为阴离子从树脂上被交换下来，这样通过改变洗脱液的pH值可使它们被分别洗脱而达到分离的目的。
2.茚三酮反应机理
在弱酸条件下（pH5-7），蛋白质或氨基酸与茚三酮共热，可生成蓝紫色缩合物。
此反应为一切蛋白质和α—氨基酸所共有(亚氨基酸如脯氨酸和羟脯氨酸产生黄色化合物)。
含有氨基的其他化合物亦可发生此反应。
该反应颜色产物在570nm处有最大吸收峰。
【仪器与试剂】
1.仪器：
层析柱（20cmX1cm）；铁架台；恒流泵；部分收集器；分光光度计；移液枪；恒温水浴锅；试管玻璃棒烧杯等常用器材。
2.试剂：
A．732型阳离子交换树脂
B．2mol/L氢氧化钠溶液1mol/L氢氧化钠溶液
0.01mol/L氢氧化钠溶液
C．2mol/L盐酸溶液
D．混合氢基酸溶液：天冬氨酸、赖氨酸均配制成2 mg／mL的柠檬酸缓冲液溶液。
将上述天冬氨酸、赖氨酸溶液按1：1.5的比例混合
E．柠檬酸缓冲液（pH5.3，钠离子浓度为0.45mol/L）
F．茚三酮显色剂
【实验步骤】
1.树脂的处理（小老师完成）
将干的强酸型树脂用蒸馏水浸泡过夜，使之充分溶胀。
用4倍体积的2mol/L 的盐酸浸泡1小时，倾去清液，洗至中性。
再用2mol/L的氢氧化钠处理，做法同上。
（检验中性用试纸即可）
2.树脂的转型与保存（小老师完成）
以1mol/L氢氧化钠溶液浸泡处理后的树脂1h，使树脂转化为Na型，用蒸馏水洗至中性，多余树脂放入1mol/L氢氧化钠溶液保存，需使用的用欲使用缓冲溶液浸泡。
3.装柱
取（20cm X 1cm）层析柱，检验气密性。
验得气密性良好后，将柱垂直夹于铁架上。
用夹子夹紧柱底出口处橡皮管，在柱顶放一漏斗并向柱内加入2-3cm 高的缓冲溶液。
用小烧杯取少量树脂及浸泡液，将其搅拌成悬浮状，通过漏斗缓慢倒入柱内。
待树脂在底部沉降时，慢慢打开出口夹子，放出少许液体，持续加入树脂，直至树脂高度达到10cm。
注意：装好的柱要求连续、均匀，无纹格、无气泡，表面平整，否则倒回烧杯，重新装柱。
整个过程液面不可低于树脂床面。
4.平衡
层析柱装好后，缓慢加入适量缓冲液至液面高于树脂面2-3cm。
取一烧杯盛有25ml缓冲液，装好柱子，柱上端胶皮管通过恒流泵浸入烧杯液面以下，柱下端置另一烧杯收集洗出液。
后开启泵，调节流速，以0.5ml/min（10滴/min）流速进行平衡，待25ml缓冲液基本用尽时即可加样。
平衡过程大约40-50分钟。
5.加样
关闭恒流泵，打开层析柱上端，缓慢打开柱底出口夹子，放出层析柱内液体至层析柱内液体凹液面与树脂上表面约距1mm，立即关闭出口。
由上端缓慢加入氨基酸混合液0.5ml（用吸量管沿柱壁四周均匀加入）。
加样后打开止水夹，使液缓慢流出至凹液面与树脂上表面约距1mm ，立即关闭止水夹。
再加入0.5ml 缓冲液（用吸量管沿柱壁四周均匀加入），打开止水夹，使液体缓慢流出至凹液
面与树脂上表面再次约距1mm ，重复此加入缓冲液操作2-3次，最后加缓冲液至液面高于柱顶2cm左右。
6.洗脱
将层析柱装好并使下端对准部分收集器上的一号小试管口，用PH5.3柠檬酸钠缓冲溶液以0.5ml/min（10滴每分钟）流速开始洗脱，小试管收集洗脱液，每管收集1ml，收集10管后，关闭恒流泵，同时夹住下端，改用0.01mol/L氢氧化钠溶液洗脱，同法继续收集11-35管。
收集完毕后，关闭止水夹和恒流泵。
(实验时柱内液体不可流干，柱子气密性不好时易出现流干情况)
7.氨基酸色谱的测定
向各管收集液中加入2.5ml柠檬酸钠缓冲溶液，混匀后加入1ml茚三酮显色剂，在沸水中加热15min，取出冷却10min。
以收集液第1管为空白，测定570nm波长处各管的光吸收值。
以光吸收值为纵坐标，以洗脱管号（洗脱体积）为横坐标绘制氨基酸色谱图。
（比色时请戴手套，避免将液体粘在手上或衣服上，实验完毕后请将树脂倒入指定回收处，并清洗所有实验用具）
8.树脂的回收与再生（小老师完成）
树脂回收后，用1mol/L氢氧化钠洗涤浸泡，再用蒸馏水洗至中性后，可再次使用。
【数据处理】
以光吸收值为纵坐标，洗脱管号（洗脱体积）为横坐标绘制氨基酸色谱图。
【思考题】
1.若实验结果的图谱中出现拖尾现象，试分析其原因。
2.树脂的预处理中为何要将树脂转变为钠型？
3.试简述平衡的作用及流速快慢对实验结果的影响。