蛋白质分子量测定方法的比较

蛋白质分子量测定方法的比较

梁永达

（复旦大学药学院，上海）

摘要：分子量是蛋白质主要的特征参数之一，近年来其测试方法发展十分迅速。该文概述了目前蛋白质分子量测定中最常用的几种方法，包括粘度法、凝胶过滤层析法、凝胶渗透色谱法、SDS-凝胶电泳法、渗透压法、电喷雾离子化质谱技术、基质辅助激光解吸电离质谱技术、光散射法、超速离心沉降法，并比较了这几种方法的优缺点。

关键词：蛋白质分子量粘度法凝胶过滤层析法凝胶渗透色谱法SDS-凝胶电泳法渗透压法电喷雾离子化质谱技术基质辅助激光解吸电离质谱技术光散射法超速离心沉降法

Comparison of the methods of molecular weight

determination of proteins

LiangYongda

(School of Pharmacy in Fudan University, Shanghai)

Abstract: Molecular weight is one of the most important characteristic parameters of proteins，which leads the methods to determine protein molecular weight to develope rapidly in recent years. In this paper，the mechanism and application are briefly overviewed for the most widely used technologies including viscosity method, gel filtration chromatography, gel permeation chromatography, SDS-gel electrophoresis, osmotic pressure method, electrospray ionization mass spectrometry, matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry, light scattering, ultracentrifugation sedimentation. Plus, we compare these methods’advantages and disadvantages.

Key words:molecular weight determination of proteins, viscosity method, gel filtration chromatography, gel permeation chromatography, SDS-gel electrophoresis, osmotic pressure method, electrospray ionization mass spectrometry, matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry, light scattering, ultracentrifugation sedimentation

分子量是蛋白质的主要特征参数之一，当发现一种新的蛋白质时，首先应准确测定其分子量。蛋白质分子量的测定方法有多种，以下将对实验室最常用的几种方法进行介绍：

1.粘度法

一定温度条件下，高聚物稀溶液的粘度与其分子量之间呈正相关性，随着分子量的增大，聚合物溶液的粘度增大。通过测定高聚物稀溶液粘度随浓度的变化，即可计算出其平均分子量(粘均分子量)。

如果高聚物分子的分子量愈大，则它与溶剂间的接触表面也愈大，摩擦就大，表现出的特性粘度也大。特性粘度和分子量之间的经验关系式为：

式中，M 为粘均分子量；K为比例常数；α是与分子形状有关的经验参数。K和α值与温度、

聚合物、溶剂性质有关，也和分子量大小有关。K 值受温度的影响较明显，而α值主要取决于高分子线团在某温度下，某溶剂中舒展的程度，其数值解在0.5～1 之间。K 与α的数值可通过其他绝对方法确定，例如渗透压法、光散射法等，从粘度法只能测定[η]。 在无限稀释条件下

获得[η]的方法有二种：一种是以ηsp/C 对C 作图，外推到C →0的截距值；另一种是以lnηr/C 对C 作图，也外推到C →0 的截距，两根线会合于一点。方程为：

①

优缺点：该方法操作简单、设备价格较低，通常不需要标准样品，但无法测定聚合物的分子量分布。

2. 凝胶过滤层析法

对同一类型的化合物，洗脱特性与组分的分子量有关，流过凝胶柱时，按分子量大小顺序流出，分子量大的走在前面。Ve 与分子量的关系可用下式表示：

V e=K1—K2logMr

K1与K2为常数，Mr 为分子量，Ve 也可用Ve —V o （分离体积），Ve/V o （相对保留体积），Ve/Vt （简化的洗脱体积，它受柱的填充情况的影响较小）或Kav 代替，与分子量的关系同上式，只是常数不同。凝胶层析主要决定于溶质分子的大小，每一类型的化合物如球蛋白类，右旋糖酐类等都有它自己的特殊的选择曲线，可用以测定未知物的分子量，测定时以使用曲线的直线部分为宜。②

优缺点：凝胶层析技术操作方便，设备简单，样品用量少，周期短，重复性能好，条件温和，一般不引起生物活性物质的变化，而且有时不需要纯物质，用一粗制品即可，目前已得到相当广泛的应用。凝胶层析法测定分子量也有一定的局限性，在pH6—8的范围内，线性关系比较好，但在极端pH 时，一般蛋白质有可能因变性而偏离。糖蛋白在含糖量超过5%时，测得分子量比真实的要大，铁蛋白则与此相反，测得的分子量比真实的要小。

3. 凝胶渗透色谱法

分子量的多分散性是高聚物的基本特征之一。聚合物的性能与其分子量和分子量分布密切相关。

SEC 法是按分子尺寸大小分离的，即淋出体积与分子线团体积有关，利用Flory 的粘度公式：

[]3

'

R M ηφ= []'3M R ηφ= R 为分子线团等效球体半径。[η]M 是体积量纲，称为流体力学体积。众多的实验中得出[η]M 的对数与Ve 有线性关系。这种关系对绝大多数的高聚物具有普适性。普适校准曲线为

''log[]e M A BV η=-

因为在相同的淋洗体积时，有