不同方法制备鸡胚成纤维细胞的比较试验
细胞病变效应实验报告
一、实验目的1. 了解细胞病变效应（CPE）的概念及意义；2. 掌握细胞病变效应实验的基本操作；3. 通过实验观察病毒感染细胞后产生的细胞病变现象，进一步了解病毒感染的病理机制。
二、实验原理细胞病变效应是指病毒感染宿主细胞后，在细胞内大量增殖并与之相互作用，导致细胞发生形态、功能改变，甚至死亡的现象。
通过观察细胞病变效应，可以判断病毒的存在、分离和鉴定病毒。
三、实验材料1. 实验细胞：鸡胚成纤维细胞（DF-1）2. 实验病毒：新城疫病毒（NDV）3. 实验试剂：胰蛋白酶、胎牛血清、DMEM培养基、PBS缓冲液、病毒悬液、无菌操作台、显微镜、培养皿、吸管等。
四、实验方法1. 细胞培养：将鸡胚成纤维细胞接种于培养皿中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，待细胞贴壁生长至约80%时进行实验。
2. 病毒悬液制备：将病毒接种于细胞培养皿中，培养24小时后，收集病毒上清液，用无菌操作台过滤除菌，制备病毒悬液。
3. 实验分组：将细胞分为实验组和对照组，实验组接种病毒悬液，对照组接种等体积的PBS缓冲液。
4. 观察细胞病变：分别于接种病毒后6小时、12小时、24小时、48小时、72小时观察细胞病变现象。
5. 数据记录：记录各组细胞病变程度，包括细胞变圆、脱落、聚集等现象。
五、实验结果1. 实验组细胞在接种病毒后6小时，部分细胞开始出现变圆现象；12小时后，变圆细胞数量增多，部分细胞出现脱落现象；24小时后，细胞脱落现象加剧，部分细胞聚集；48小时后，细胞脱落、聚集现象更加明显；72小时后，细胞几乎全部脱落，培养皿中出现大量细胞碎片。
2. 对照组细胞在接种病毒后，细胞形态、生长状况与实验组无显著差异。
六、实验分析1. 实验结果表明，新城疫病毒能够感染鸡胚成纤维细胞，并引起细胞病变效应。
2. 细胞病变效应是病毒感染宿主细胞后的一种常见现象，可用于判断病毒的存在、分离和鉴定病毒。
3. 本实验中，新城疫病毒感染鸡胚成纤维细胞后，细胞出现变圆、脱落、聚集等现象，符合病毒感染引起的细胞病变效应。
鸡胚成纤维细胞的制备
实习三鸡胚成纤维细胞（CEE）的制备目的：1.初步掌握CEE的培养方法和待染色的细胞培养物的制备。
2.了解一般细胞培养要求的条件。
材料：10~12天龄鸡胚、BSS（每100ml加3.5%NaHCO3和庆大霉素各1.0ml）、Hanks水解乳蛋白液（每100ml加小牛血清5ml、庆大霉素1ml）、小牛血清、0.06%胰酶、3.5%NaHCO3、庆大霉素（5000单位/ml）、蛋架、剪刀、镊子、铁线钩、烧杯、三角瓶、、链霉素瓶、吸管、注射器（2ml、5ml、10ml）、培养架、酒精灯、酒精棉、漏斗及尼龙滤网、离心管、天平、平衡杯、离心机、羊皮纸、1/2盖玻片等。
内容与方法：1．准备好平皿、烧杯、三角瓶、细胞瓶、吸管、注射器（2ml、5ml、10ml）、漏斗子，及尼龙滤网、离心管、1/2盖玻片等。
预先包扎好，15磅30分高压灭菌。
小铁钩、剪刀和镊子等可在用前煮沸15分钟。
2．用碘酒棉和酒精棉消毒蛋壳，无菌操作打开蛋的气室，钩起鸡胚，在平皿内剪去头、脚及去掉内脏，然后放入烧杯内，并尽量剪碎胚体。
3．用约10ml BSS将组织碎块倒入三角瓶，并冲洗2次，以除去其中的红细胞。
4．加入0.06%胰酶10ml，于37℃水浴消化约10分钟，迅速用BBS将组织碎块轻轻冲洗2次，最后一次冲洗液弃去后即加10ml营养液（营养液里的血清将终止残存胰酶的作用），用吸管反复吹打组织碎块，直至大部分细胞分散而上层液变浑浊。
5．经100目尼龙滤网滤入离心管，并用羊皮纸封口，平衡后1000r/min离心5分钟，弃去上层液，确定细胞压积后，以1：300的稀释倍数加入新的营养液，然后重新悬浮细胞。
6．每一细胞瓶加入细胞悬液；制备待固定、染色的细胞培养物可在瓶内加入半块盖玻片，使其浸入细胞悬液中。
在瓶上方做上标记，置37℃培养，1~2天后CEE可生长形成单层。
鸡胚成纤维细胞制备实验
42生物技术世界BIOTECHWORLD细胞培养是病毒学研究的重要手段,是进行病毒性疾病诊断必不可少的工具。
泛地应用于病毒的分离、鉴定,人工感染的细胞培养物制成的弱毒疫苗和灭活疫苗以及筛选异源和同源的弱毒株都离不开细胞的培养工作。
[1]病毒能在易感的组织和单层细胞内增殖,并可产生细胞病变。
成纤维细胞是结缔组织中最常见的细胞,由胚胎时期的间充质细胞分化而来。
鸡成纤维细胞具有相对容易获得、增值能力强、适应性强、良好的耐受性、性状较稳定等特点,所以被广泛的应于在病毒培养等领域。
鸡胚成纤维细胞培养可分为原代细胞培养、传代细胞培养。
原代细胞培养是体外制备细胞培养物的必经过程,自供体体内取出组织分散单个成单个细胞接种于培养液中为初次培养,从初次培养到第一次传代培养为原代细胞培养。
由组织刚刚分离出来的细胞能够分裂增殖,形成单层细胞。
[2]1 所需材料:鸡胚:9-10日龄SPF 鸡胚消化液:含0.25％胰蛋白酶(预先置于37℃温箱中);培养基:用DMEM培养基,含10%胎牛血清;洗液:pH7.2的PBS洗液;器具与物品:无菌剪刀、镊子、平皿、细胞培养瓶;带两层纱布的无菌烧杯,CO2培养箱、超净工作台、显微镜、高压灭菌锅、水浴箱、培养瓶、吸管、移液管、酒精灯、酒精棉等。
2 操作[3]2.1 操作前的准备(1)预热培养用液:把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。
(2)用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。
(3)正确摆放使用的器械:保证足够的操作空间,不仅便于操作而且可减少污染。
(4)点燃酒精灯:注意火焰不能太小。
(5)准备好将要使用的消毒后的培养瓶。
2.2 成纤维细胞制备(1)取9-11日龄的鸡胚。
先用75%的酒精喷淋整个鸡胚,消毒后置于超净工作台内先后用碘酒和酒精对气室及周边进行擦拭消毒。
用无菌剪刀、镊子打开蛋皮,取出鸡胚,放入灭菌好的平皿中,去除鸡头、鸡翅、鸡爪、内脏。
一种鸡胚成纤维细胞快速制备与保存方法的研究
一种鸡胚成纤维细胞快速制备与保存方法的研究作者：赵海棋高庆芳张泽恺苗立中刘建钗苑文娴唐娜来源：《家禽科学》2023年第11期摘要：为了进一步提高鸡胚成纤维细胞（Chicken embryo fibroblast，CEF）的制备效率和活力，试验以短时多次消化法缩短胰酶消化时间，提高细胞活力。
同时，通过优化血清、胰酶、培养基等保存条件，增加细胞4 ℃保存时间。
经CCK-8细胞活性检测、活细胞计数、传代培养等方法比较验证，结果表明，所建立的制备方法简易、快速、细胞活力高；细胞在4 ℃、不添加血清和胰酶的DMEM培养基中保存96 h内仍保有良好的贴壁生长能力。
该方法的建立为实验室内快速制备CEF细胞提供候选方案，可有效减少鸡胚的使用。
关键词：鸡胚成纤维细胞；细胞制备；细胞保存; 原代细胞；细胞培养作为细胞生物学试验研究中的一个重要环节，细胞培养技术被广泛应用于现代生物工程、生命科学和药物研发等领域，原代细胞也已成为基本的细胞生物学试验研究样品，在生理学、细胞生物化学、药学、毒理学等研究领域广泛应用。
其中，鸡胚成纤维细胞（Chicken embryo fibroblast，CEF）因具有适应性强、繁殖速度快、来源广、成本低等优势，被大量应用于生物工程研究与疫苗生产中，多种常见的病毒如禽马立克病毒（Marek’s disease virus，MDV）[1]、传染性法氏囊病毒（Infectious bursal disease，IBDV）[2]、火鸡疱疹病毒（Herpesvirus of turkey，HVT）[3]等的研究都以CEF为重要材料。
目前，实验室制备CEF需要现用现制，大量使用鸡胚，既增加受污染的风险，也不利于动物福利，还给试验研究带来额外的工作量。
因此，通过多次试验，本研究尝试建立一种快速、小量制备鸡胚成纤维细胞的候选方案，在保障细胞活力、提高制备效率的同时，能够降低受污染风险，且可短期保存细胞，从而减少制备次数和鸡胚使用量。
一种鸡胚胎成纤维细胞体外三维培养和分离的方法
一种鸡胚胎成纤维细胞体外三维培养和分离的方法1. 从鸡胚体内收集成纤维细胞：使用灭菌的工具和培养介质，从鸡胚体内收集成纤维细胞。
2. 细胞培养基的制备：制备适宜的细胞培养基，比如DMEM（Dulbecco's Modified Eagle's Medium），其中包含适当的营养物质和补充物。
3. 细胞培养底物处理：在培养器中涂覆适宜的细胞培养底物，比如胶原蛋白、明胶或聚二甲基丙烯酸甲酯（PDMA）等。
4. 细胞预处理：将收集到的鸡胚胎成纤维细胞在预处理培养基中预处理一段时间，以提高细胞的存活率和增殖速度。
5. 细胞接种：将经过预处理的细胞接种至培养器中的培养底物上，使细胞附着并形成单层或多层细胞。
6. 体外三维培养的创建：将培养器中的细胞培养至一定程度，使细胞形成三维结构，如球状或纺锤状。
7. 细胞增殖和细胞养护：提供适宜的培养条件，包括合适的培养基、温度、湿度和氧气含量，以促进细胞增殖和维持细胞的健康状态。
8. 培养基的更换：定期更换培养基，以排除废弃物和维持细胞的正常功能。
9. 细胞监测和分析：使用显微镜和其他细胞学技术，定期监测和分析培养器中的细胞状态、数量和生长速度。
10. 细胞传代：当细胞达到一定密度时，可以进行细胞传代，将细胞分离、稀释并重新接种，以维持细胞的健康状态和继续培养。
11. 细胞分离：使用适当的消化酶（如胰蛋白酶）或细胞分离缓冲液，将三维细胞结构分离为单个细胞。
12. 细胞计数：使用细胞计数仪或显微镜，对分离的细胞进行计数，以确定细胞的数量。
13. 细胞检测：采用细胞培养板或微孔板等细胞培养容器，将分离的细胞均匀地分配在不同孔或区域上，以进行后续的细胞检测和分析。
14. 细胞培养条件的优化：在细胞分离过程中，根据不同实验目的，优化培养条件，如培养基的配方、温度、湿度和氧气含量等。
15. 细胞培养的存活率和生长速度的分析：通过计算存活细胞的比例和细胞增殖速率，评估细胞培养的效果。
CEF、DEF培养
鸡胚成纤维细胞（CEF）、鸭胚成纤维细胞(DEF)培养一、材料9¬10日龄鸡胚13¬14日龄鸭胚眼科剪、镊、外科镊、巴氏吸管、蛋架、灭菌平皿 25ml小三角瓶Hanks＇液 0.25%胰酶液 Versene液灭菌纱布、玻璃漏斗、0.1% 结晶柠檬酸（0.1M）或0.4%台盼兰,血球计数板、60ML培养瓶或60ML培养皿、灭菌盖玻片、营养液。
二方法（CEF为例）鸡胚理：取9¬10日龄鸡胚直于蛋架，在气室部用于5%碘酊棉消毒，再用洒精棉脱色，用外科镊击破蛋壳用眼科镊取出胚体放于平皿内，去喙瓜眼和内脏，用Hank＇s液洗两次，用弯头眼科剪剪胚剪成1-2mm的碎块，加Hank’s液20ml,略加摇振，静置使组织块下沉，将混有红血球及碎片的上悬液吸去，重复洗2—3次，直至上悬液不混浊为止。
2、消化：将0.25%胰蛋白酶溶液用5、6%NaHCO2滴定至PH7、6—7、8，加热至37度，按组织块量3—5倍加于装有鸡胚碎块的三角瓶中，每个鸡胚约需胰酶5ml，30分钟取出，静置1—2分钟，吸去胰液，再加HanK’s 液20ml，轻轻摇动后吸去，如此反复两三次，目的是洗去残余的胰酶。
第三次加入营养液，每胚3ml左右，用粗口吸管吹吸数次，使细胞脱落分散。
静置1—2分钟，候组织下沉后，细心将细胞悬液吸出，另置一只25ml三角瓶，如此反复数次，使细胞尽量自组织块脱落，将多次取得的悬液合并一处，纱布过滤悬液。
必须注意每次吹吸一般6—7次为宜，太多则细胞受损，消化时间要灵活掌握，不足细胞不易掊落，太久则细胞破碎。
在消化过程中，摇动时组织不易下沉即立即停止，消化后如组织粘连如涕，证明消化过度。
二、细胞计数：取细胞悬液0.1（100ul）置盛有0.9ml10.4%台盼蓝的试管中混合,用血球计数板计数。
计算方法：4大方格细胞数每ml细胞数=——————————————X10（5）45中格细胞数或每ml细胞数=——————————X10（4）三：接种以营养液配成每ml10（6）细胞（最终稀释度）接种链霉素瓶（1ml）、60ml瓶（8—10ml），100mm dish（10ml），60mm dish（4ml），37度孵育48小进后形成单层，接种病毒或作次代培养。
原代培养(13)
二、讨论
自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件。 凡在超净台外操作的步骤，各器皿需用盖子或橡皮塞，以防止细菌落入。 操作前要洗手，进入超净台后手要用75%酒精擦试，试剂等瓶口也要擦试。 点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧灼时 间不能太长，以免退火，并冷却后才能夹取组织，吸取过营养液的用具不能再烧灼，
TCID50
（50%tissue culture infectious dose) 是病毒毒力的
传统表示法， 即能在细胞培养孔或试管内引起50%组织细胞
病变所需的病毒最高稀释度。
实验六 干扰素（IFN）效价滴定
干扰素效价一般定义为：若1ml干扰素标本的最高稀释度仍能
保护半数细胞（50％）免受“攻击病毒”损害，则该稀释度的倒
数即为干扰素的效价，表示为单位/毫升。
实验结果：
一、结果观察：镜下及染色观察，一般病毒对照孔出现3＋或 4＋，干扰素保护孔CPE不再进展时，可终止反应，并染色。
二、效价计算：
实验七 中和试验 —稀释血清固定病毒法
实验结果：用倒置显微镜及活细胞染色观察。首先观察对照：
V对照（3+～4+）；S对照（-/±）；C对照（-）。以病变作为
实验小结
实验一 配液
实验二
原代鸡胚成纤维细胞的 制备、培养及观察
一、实验结果观察
• 肉眼观察：培养液颜色、浑浊度等 • 镜下观察：细胞的形态、折光性、轮廓等 • 成纤维细胞形态学特征：细胞呈梭形、长条形或不规则形。 多数情况下细胞之间排列疏松，有较大细胞间隙，有时也 见相互平行排列，成群细胞呈现放射状、漩涡状等走行形 式。
指标，能抑制病毒CPE的血清最高稀释度为中和抗体的效价 （滴度）。
鸡胚成纤维细胞制备
鸡胚成纤维（CEF）细胞的制备材料准备：干烤好的漏斗，高压好的12层纱布，50ml的烧杯，锥形瓶，剪刀，镊子，平皿，Hank’s液，含10%血清的199培养基，胰酶，19日龄SPF鸡胚（CEK细胞），9日龄SPF 鸡胚（CEF细胞）。
取胚：用新洁尔灭对鸡蛋外壳进行消毒，用碘酒消毒气室部位蛋壳，再用75%酒精脱碘消毒，剪碎气室部位蛋壳，取出鸡胚，剪断鸡胚与卵黄连接的脐带，将鸡胚放置干净的平皿上。
取组织：取小烧杯，倒入适量微温Hank’s液，将鸡胚仰放，制备CEK细胞除去胃、肠、肝脏、肺脏、心脏等器官，用小镊子将嵌入在脊椎两侧的肾脏取出，浸泡在Hank’s液中；制备CEF细胞去掉头、翅膀、腿和内脏，将剩余的胴体放入50ml的烧杯。
漂洗，剪碎：用Hank’s也漂洗3次，将组织脏器剪成1mm3左右的小块，再用Hank’s液漂洗3次。
胰酶消化：将小烧杯中的组织小块移到锥形瓶中，加入适量37℃水浴加热的胰酶溶液，放在水浴锅中消化30-35min。
终止消化：待组织体积增大、边缘出现毛边停止消化，小心倒出胰酶，用Hank’s液洗3遍。
制备细胞：除去Hank’s液，加入适量含10%血清的199培养基，剧烈震荡，将液体倒入含12层纱布的漏斗，重复数次，一般按1个胚加入25mL培养基来计算培养基总量。
活细胞计数：用血球计数板进行台盼兰细胞计数。
用酒精冲洗计数板后擦净，将盖片覆在计数板上，微微移向一侧，以便滴加细胞悬液；取一吸管伸入培养瓶，轻轻吸打，混匀细胞悬液；用微量移液枪从盖片边缘滴加20μL细胞悬液，使其充满计数板和盖片间的空隙中；勿使液体漫过盖片或出现气泡；镜下观察并计算计数板的四角大格内的细胞数，压线者只计算左侧和上方的，右侧和下方的不计算在内；细胞数/毫升原液=(4大格细胞数/4)×10000×稀释倍数。
每4个大方格计数，以80-120个为宜。
未着色的为活细胞，呈蓝色的为死细胞，进行活细胞计数：用台盼兰染色进行活细胞计数后，调整CEK、CEF细胞密度至100×104个/mL左右，25cm2塑料细胞培养瓶中接入8mL细胞分散液，置于37℃细胞培养箱静置培养。
乳汉液不同除菌方法对鸡胚成纤维细胞的影响
成 纤 维 细胞 单层 ， 细 胞 较 少 ， 本 没 有 空 隙 ， 死 基 鸡胚
板过 滤 除菌 。 经 过进 口微孔 滤 膜 过 滤 器过 滤 除 菌 的乳 汉 液 的 备制 。将配制完 的乳汉液经过蠕动泵打人滤缸 中， 经
进 口微孔 滤膜 过滤 除菌 。
用 进 口滤 芯 过 滤 除菌 的乳 汉 液培 养 的鸡 胚 成 纤 维 细胞 ， 图 ３ 如 。经 ２ ４小时 后基 本 没有 死细 胞 ， 胚 鸡 成 纤维 细 胞致 密 ， 能形 成 良好 的细 胞单 层 ， 胚 成 纤 鸡 维 细胞 轮廓基 本无 法分 清 。
汉 液 中所 含 有 的水 解 乳蛋 白会 吸 附在 滤 板 上 ，而 且 用 经 高 压 除 菌 的 乳 汉 液 培 养 的鸡 胚 成 纤 维 细 胞 ， 图 １ 经 ２ 时后基 本 形成 鸡胚 成纤 维 细胞 单 如 。 ４小 层 ， 细胞 较 多 ， 些地 方 有 空 隙 ， 死 有 显微 镜 下 观察 ， 鸡
养 的鸡 胚成 纤 维细胞 ， ［ ２ 经 ２ 女 。 图 ４小 时后 形成 鸡胚
养殖技术顾 问 ２ １ ． ００６
哼 研 究 与 综 述
乳 汉 液 不 同 除 菌 方 法 对 鸡 胚 成 纤 维 细 胞 的 影 响
于洪 涛 韩 兴 郑铁 鑫 卢 爱 国 （ 哈药集团生物疫苗公 司 １０６ ） ５０９
摘 要 ： 了验 证 不 同除茵 方 法制备 的 乳汉 液对 鸡胚 成 纤 维 细胞 生长 的影 响 ， 用 了高压 灭 茵、 Ｋ 为 采 Ｅ Ｓ滤 板过 滤除 菌和进 口滤 芯过 滤除 菌 ３种 方 法 。通过 实验 表 明 ， 经过进 口滤 芯过 滤所 得 的乳 汉 液是 最利 于鸡 成 纤 维细胞 生 长的 。
两种制备鸡胚成纤维细胞的方法比较
消化 １ 即 ４次）在瓶壁上有少量的死细胞 絮状物 ； 次（ ， 而另两 组均无 肉眼可见 的死 细胞 团， 整瓶贴壁均匀光滑 。镜检 可见
细胞消化分散得很均匀 。
三角瓶 的大小放入各 瓶中 ， 准备消化。每瓶按 ８ ｍ Ｕ胚加入
３ ℃浓度为 ００ ５ ７ ． ％的胰 酶消化液， ２ 在磁力搅拌器上 以 １０～ ０
Байду номын сангаас
２ 玻璃珠分散法 两组死细胞团较多， ． ３ 粘附于瓶壁， 较大
而未粘 附的团块在瓶 子旋 转时滑动将所在之处 一圈细胞 已
刮掉 ， 整体上显得生长不均匀 ， 细胞生长势头无前者 旺。 镜检 时细胞不像前者那样 已分散成单个 ， 而是成堆 ， 不均匀。
养液并摇匀， １０ ｍ ， 按 ０ ０ Ｌ 瓶分装到细胞瓶 ， 并放入 ３ ℃的 ７ 温室中进行旋转培养 。定时观察并做好记录。 １ 采 用结合方法制备鸡胚成纤堆细胞 ． ８ 试 验共分 ２组 ， 分别 为 １ 、 ０ ７枚 ／ ， １ 瓶 按 ． ６项方 法制备
１１ 鸡 ．
日龄 。
胚
购 自济南赛斯 的 Ｓ Ｆ种蛋 ，并 自行孵化至 １ Ｐ ０
１ Ｈａｋ Ｓ ． ２ ｎ ’液 按常规配制 ， 并高压灭菌备用 。
１ 乳汉液 ． ３ 购 自美 国 Ｄｆ ｏ 司的水解乳蛋 白干粉 ， ｉｃ 公 ｉ 按常 规配制成 Ｏ ％浓度的乳汉液， ． ５ 高压灭菌备用。
待消化 的鸡胚组织 。以后方法 同胰 酶连 续消化法， 同的是 不
２０ ｒ／ ｉ ５ ｍｎ速度搅拌消化 １ ｉ。稍静置后收集上清液 ， ０ｍｎ 并 在上清液中加入 一定量 的血清 ， 终止胰酶 的消化作用 。将剩 下的组织按同样的方法再 消化 ２次 ， ２ ３次胰酶量分别按 第 、 ４ Ｕ胚 和 ２ Ｕ胚加入 ， ｍ ｍ 消化 ３— ４遍 即可。将所有收集 的上
实验一-鸡胚成纤维细胞的培养
02
实验过程中，细胞形态和生长曲线的变化符合预期，表明实验
操作和Байду номын сангаас件控制得当。
传代培养后细胞稳定增殖，表明所使用的培养基和条件能够支
03
持鸡胚成纤维细胞的正常生长。
对实验的改进和展望
在未来的实验中，可以尝试优化培养基的成分，以提高细胞的生长速度和活性。
可以进一步研究不同条件对鸡胚成纤维细胞生长和功能的影响，如温度、pH、气体 环境等。
了解细胞培养的基本原理和操作流程
掌握细胞生长和增殖 的基本原理，了解细 胞周期和细胞分裂的 过程。
了解细胞培养过程中 的注意事项和安全措 施。
熟悉细胞培养的基本 流程，包括原代细胞 的培养和传代细胞的 继代培养。
学习细胞培养的实验设计和数据分析方法
01 学习如何设计细胞培养的实验方案，确定实验参 数和对照组设置。
实验一-鸡胚成纤维 细胞的培养
目 录
• 实验目的 • 实验原理 • 实验步骤 • 结果分析 • 实验结论
01
CATALOGUE
实验目的
掌握鸡胚成纤维细胞的培养技术
01
掌握细胞培养的基本操作，如细胞分离、传代、计 数等。
02
熟悉细胞培养所需的仪器和试剂，如显微镜、细胞 培养皿、胰蛋白酶等。
03
了解细胞培养的环境条件，如温度、湿度、气体等 。
细胞形态的观察结果分析
总结词
观察鸡胚成纤维细胞的形态变化，分析 细胞形态与细胞功能的关系。
VS
详细描述
在实验过程中，通过显微镜观察鸡胚成纤 维细胞的形态变化，记录细胞的形态特征 。通过对比不同培养时间的细胞形态，可 以分析细胞形态与细胞功能的关系，进一 步了解细胞的生理状态和变化规律。
室温消化法制备鸡胚成纤维细胞的试验研究
室温消化法制备鸡胚成纤维细胞的试验研究鸡胚组织是组织培养最早被利用的对象。
早年组织培养工作者，如Carrel等曾用鸡胚做过大量研究工作。
目前，鸡胚成纤维细胞已被广泛应用于细胞和分子生物学研究的许多方面，这主要是由于成纤维细胞是最易培养的细胞，其良好的耐受性使之易于进行从基因转染到微注射等较多领域的研究。
本试验经长期摸索、比较、找到一种制备鸡胚成纤维细胞的优化方法——室温消化法。
1材料与方法1．1材料1013龄SPF鸡胚由广东省永顺兽医厂提供。
DMEM原粉购自美国GIBCO公司，按说明书添加双蒸水、NaHCO，，调pH值至7．0，正压滤过除菌，4~C保存。
使用前添加10％~b牛血清、1％双抗。
小牛血清购自上海实生细胞生物技术有限公司，一20~C保存，使用前56℃水溶30min，再用孔径0．22m的滤膜滤过除菌。
Hanks液用江苏宜兴市赛尔生物化工厂生产的Hanks液干粉，按说明书添加双蒸水正压滤过除菌，用前调pH值至7．2—7．6，4℃保存。
2．5g／L胰蛋白液由胰蛋白酶(东方科学仪器进出口公司分装，活性1：250)加Hanks液、双抗液配制而成，一20％保存用前调pH值至7．6—7．8。
％10000U／mL青霉素和10000g ／mL链霉素的双抗及7．5％碳酸氢钠液按常规方法制备。
1．2鸡胚成纤维细胞的制备取1013龄鸡胚2个，用无菌方法将胚提出放入无菌平皿中，去喙、爪、翅和内脏，剪成小块以Hanks液洗2～3次，移入无菌内含磁力搅拌棒的50mL锥形瓶中，再用Hanks搅拌洗涤23次，然后以每个鸡胚10mL 的量加入2．5g／L胰蛋白酶液，室温低速磁力搅拌消化10～15min。
消化完毕，以8层灭菌纱布滤过，将滤液离心去除胰蛋白酶消化液，再用DMEM细胞培养液将细胞悬起计数分装于细胞培养瓶中，置37~C含5％CO的培养箱中培养24h。
2结果每个鸡胚可以制备出约1．8X10个细胞。
培养4h即先贴壁生长，20～22h细胞能至70％～80％贴壁长满单层，细胞团块及少、死亡未贴壁的悬浮细胞少且整体贴壁细胞长势旺盛，这种细胞最易于进行转染等应的基因工程操作如图所示，如果应用于病毒分离培养等操作，应延长培养细胞至24h为宜。
不同制备方法对鸡胚成纤维细胞产量的影响
中 国兽 医 科 技 厂 生 产 ；０ ／ ｇ鱼 石 脂 软 膏 ， １０ ｋ ｇ 由芜 湖 市第 三 制 药 厂 生 产 。
第３ ２卷
第 ７期
２０ ０ ２年
３ １
肿 ． 挤 静 脉 血 管 ， 致 颈 静 脉 淤 血 硬 化 。三 是 采 血 针 头 在 血 管 压 导
选 出颈 静 脉 重 度 硬 化 者 ２ ９匹 ．
为试 验 组 ． 次采 血 后 除 颈 静 脉 注 射 ５ ／ 每 ０ Ｌ葡 萄 糖 氯 化 钠 注 射 ｇ
面 的 影 响 目前 尚 不 清 楚 ， 对 抗 血浆 生 产 的 影 响 是 较 大 的 。 但 右旋糖 酐 ４ Ｏ是 一 种 扩 容 剂 即体 液 补 充 剂 ， 有 与 血 浆 相 似 具 的 胶 体 特 性 ， 替 代 血 浆 。根 据 颈 静 脉 硬 化 的致 病 因 素 ． 脉 可 静 注 射 右 旋 糖 酐 后 ． 恢 复 血 容 量 及 一 定 的 胶 体 渗 透 压 ， 效 地 抑 可 有
１ ３ 颈 静 脉 硬 化 判 定 标 准 以颈 静 脉 硬 化 的长 度 分 为 三 级 ． ． 长
内 停 留时 间过 长 ， 正 常 血 流 受 阻 而 形 成 淤 血 。 四 是 因 采 血 量 使 大． 导致 血 容 量 减 少 ， 压 降 低 ． 血 血液 黏 稠 度 增 大 ， 流 缓 慢 而 不 血 规 则 ， 而 破 坏 血 液 “ 流 ” 使 血 小 板 等 有 形 成 分 析 出 ， 起 血 从 轴 ， 引
制 了外 间 压 力 对 血 管 腔 的 压 迫 而 恢 复 血 流 的 畅 通 。 同时 它 还 有
液 １ ０ ０ｍＬ并 外 敷 鱼 石 脂 软 膏 外 ． 体 重 加 注 右 旋 糖 酐 ４ ０ 按 ０氯 化 钠 注 射 液 ３ｍＬ ｋ ／ ｇ进 行 治 疗 ； ２组 １ 第 １匹 ， 为 对 照 组 ． 作 只 静 脉 注 射 ５ ／ ０ｇ Ｌ葡 萄 糖 氯 化 钠 注 射 液 １０ ０ｍＬ并 外 敷 鱼 石 脂 ０
DF-1鸡胚成纤维传代细胞的染色体制备及核型分析、致瘤性试验研究方案
DF-1鸡胚成纤维传代细胞的染色体制备及核型分析、致瘤性试验研究方案DF-1鸡胚成纤维传代细胞的染色体制备及核型分析、致瘤性试验研究方案材料与方法1 细胞DF-1细胞、CEF细胞、Hela细胞。
2 裸鼠2月龄（或体重18～22g）、或乳鼠（3~5日龄）、或小鼠（8~10g）。
3 细胞营养液细胞生长液为无血清培养基。
4 细胞染色体制备和核型分析4.1 染色体标本制备按常规方法分别将DF1细胞进行秋水仙素处理、细胞消化与低渗处理、细胞固定与在固定、滴片与染色。
4.2 染色体特征及数目、细胞核型分析取有丝分裂中期的细胞进行姬母萨染色检查，（总共需要150个视野的图片）。
5 细胞致瘤性试验5.1 细胞样品的制备按常规方法制备好DF-1细胞。
5.2 阳性对照细胞将Hela细胞经胰酶消化分散，离心收集细胞。
制成含活细胞数约106cells/0.2ml的细胞悬液。
5.3 阴性对照细胞按常规方法制备的鸡胚成纤维细胞（CEF），制成含活细胞数约107cells/0.2ml的细胞悬液。
5.4 致瘤性试验5.4.1和5.4.2任选其一。
5.4.1 将细胞样品分别皮下注射裸鼠30只，每只107 cells /0.2ml细胞。
5.4.2 取3~5日龄乳鼠或8~10g小鼠，用抗胸腺血清处理后，将细胞样品分别皮下接种18只，每只107 cells /0.2ml细胞。
5.4.3 阳性对照每只裸鼠皮下或肌肉注射106 cells /0.2ml，共注射5只裸鼠，为阳性对照。
（如以乳鼠或小鼠试验，注射剂量不变，数量为3只）。
5.4.4 阴性对照：每只裸鼠皮下注射107 cells /0.2ml，共注5只裸鼠，为阴性对照。
（如以乳鼠或小鼠试验，注射剂量不变，数量为3只）。
5.5 实验动物检查及处理5.5.1 逐日观察至14日，检查有无结节或肿瘤形成。
如有结节或可疑病灶，应在观察至少7～14日后剖检，进行病理组织学检查。
5.5.2 未发现结节的动物，对其中的一半动物观察21日后剖检，另外一半动物观察12周后剖检，观察各个淋巴结核器官中是否形成结节，如有怀疑，应进行病理组织学检查。
鸡胚成纤维细胞培养doc
一、鸡胚成纤维细胞的体外培养鸡胚成纤维细胞在病毒学研究中十分常用。
孵化8－12d的鸡胚可用作培养的材料来源。
（一）实验材料1. 鸡胚：孵化10d的受精蛋数个。
孵化方法是将受精蛋放到38.5℃孵卵箱或恒温箱中，静置。
每日翻动1—2次，以防止鸡胚粘连到蛋壳上影响发育。
箱内湿度(40～70％)可通过在箱底放一盛水盘来维持。
鸡胚的孵化期为2ld。
孵化前，如遇蛋壳表面污物较多，可用刀片等器具刮除，不要用湿布擦拭，更不能用酒精棉球消毒或者用水洗蛋。
孵育前可将受精蛋保存在10℃左右，保存期一般不超过10d。
也有人将受精蛋保存在4℃冰箱中。
2. 消化液：含0.25％胰蛋白酶、青霉素100 1U／ml、链霉素100 μg/ml混合消化液。
用Hanks 液或HEPES液配制。
3. 培养液：DMEM培养液，添加10％－20％的胎牛血清（FCS）、青霉素100 IU/ml、链霉素100 μg/mL。
4. 其它培养用品：手术器械、平皿、三角瓶或15ml血清瓶、离心管、100目不锈钢筛网、培养瓶或培养板、振荡水浴箱、离心机等。
（二）操作步骤1)取孵化10d的鸡胚，分别用碘酒与酒精棉球擦拭消毒，晾干。
用一已消毒金属器具将受精蛋大头端击破，用镊子小心夹去破碎蛋壳，然后撕去气室外面的膜，暴露出尿囊绒膜及附着的血管。
开口大小以受精蛋内容物不溢出为宜，但不宜太小。
用镊子轻轻夹住鸡胚的颈部，小心取出鸡胚，放于无菌培养皿中，除去头部、四肢、内脏和皮肤。
2)胚体用Hanks液或生理盐水清洗3次，切成1－2 mm3的小块，然后转移到容积适中的三角瓶或15ml血清瓶内。
3)加入适量消化液，一般每10个鸡胚加20 m1消化液，用胶塞密封瓶口。
4)在振荡水浴箱上37℃慢速搅拌5－10 min。
加入少量血清钝化胰蛋白酶。
然后通过100目不锈钢筛网，制备细胞悬液，将细胞悬液转移到离心管中。
5)离心（800 rpm，10 min），弃上清液，将细胞沉淀用培养液洗2次。
实验九：鸡胚成纤维细胞的制备
（3）胚体匀浆
用灭菌剪将胚体剪碎至1mm3小碎块。加 入Hanks液（淹住组织碎块即可），轻摇，静 置1-2min，待组织块下沉，吸去上层悬液。 重复2-3次（以除去其中的红细胞），至上悬
液不混浊为止，移入灭菌的小三角瓶中，吸去
Hanks液。
2、分散细胞 （1）胰酶消化
取出预热好的0.25%胰酶，向三角瓶中加入约8mL。 包紧瓶口，37℃消化30min，每隔5min轻轻摇动1次。 由于胰酶的作用，鸡胚细胞与细胞间的氨基和羧基游 离。待液体变混而稍稠，轻摇可见组织块悬浮在液体
（二）鸡胚成纤维细胞的制备
1、鸡胚的处理 （1）蛋壳消毒 取9-11日龄的鸡胚，用检卵灯选取血管清楚、
活动正常的鸡胚，置蛋架上，令气室端向上，
75%酒精棉消毒蛋壳气室部位。
（2）胚体采集
以镊子击破卵壳气室部位，并除去该部位卵壳。 用无菌的眼科镊子撕开蛋壳气室膜并小心拨开绒毛 尿囊膜和羊膜，钩住鸡胚头部，移入灭菌的平皿内。 用剪刀剪去胚头、四肢及内脏，用Hanks液洗去体 表血液，移入灭菌小烧杯中。
用4层脱脂纱布将吹打后的细胞过滤到平皿中，
收集滤液。
（三）分装与培养
1、细胞计数 用细胞计数器计数，根据计数结果，加入 DMEM生长液，调整细胞浓度至50万-60万个
/ml。（本实验省略此步）
2、分装与培养 在培养瓶中加入2mLDMEM生长液(如果是50mL
的培养瓶，加4mL生长液)，小心吸出过滤后的细胞悬液
（四）细胞形态观察
检查时注意培养液的颜色变化，变黄但不混浊表 示有细胞生长，变红表示细胞未生长或生长不佳。 37℃培养24-48h后，于倒置显微镜下观察，细胞可 以长成单层，细胞透亮，呈纤维状，细胞膜清晰。
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!""# 年第 !$ 卷第 $ 期
!"#$% &’()*+, - ’)./012’.0./334
不同方法制备鸡胚成纤维细胞的比较试验
牛家强!， 支海兵’， 徐业芬!， 陈国先’， 吴华伟’ （ 西藏林芝 !"西藏农牧学院牧医系， 北京海淀 <=####； ’"中国兽医药品监察所，
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!信息之窗!
鹅肥肝产业化项目开发
近几年来， 鹅（ 鸭） 肥肝在国际食品市场上十分畅 销。广西鸿雁食品有限公司计划开发鹅肥肝产业化项 目。北海市合浦县及周边的一些地区环境优美， 鹅业资 源丰富，狮头鹅的产肝性能可与法国的朗德鹅相媲美， 这 里 的 农 民 有 养 鹅 的 传 统 ， 常 年 饲 养 量 达 !$$ 万 只 以 上， 足以满足年产 #$$$ 吨鹅肥肝的需要。 广西鸿雁食品有限公司于 2$$2 年 ; 月投入 ’$$$ 多
’ #$%&! 三种方法制备的 819 单层细 ’)# 在同等条件下，
胞都以成纤维细胞为主，并伴有少量的上皮细 胞， 仅有全胚法含有极少量的肝细胞， 说明鸡胚 的其它组织（ 眼喙， 内脏团， 脚等） 在该条件下几 乎不能被有效消化（ 几乎未被消化） 。 半胚法优于其它两种 ’)2 综合分析结果可以得出， 方法， 而且此法并未增加任何生产工序和污染机会， 因此建议今后使用半胚法生产鸡胚成纤维细胞。
万元， 建设年产 #$$ 吨鹅肝基地（ 广西鹅肥肝产业开发项 目一期工程） 。该项目是二期工程， 计划建设年产鹅肥肝 深加工鹅肝酱 !$$ 吨， 分割肉 #$$$$ 吨（ 其中深 #$$$ 吨， 加工熟制品 !$$$ 吨） ， 其他副产品 #$$$ 吨 ， 加工专用饲 料 ; 万吨， 孵化提供鹅苗 2!$ 万只， 填饲肥鹅 22$ 万只。 其中， 鹅肥肝、 鹅肝酱和分割肉大部分供出口。 该 项 目 总 投 资 为 26#; 万 美 元 ， 预 计 投 资 利 润 率 项目合作方式为合资。 #$(3 ， （ 思 进 摘）
按传统法制备 75&，用血球计数
板对细胞悬液作活细胞计数， /#个胚做一个转瓶， 分装于小方瓶（ 刻氏瓶） 中， /08培养’6 9。
!"’"’
半胚法
取!#日龄$%&鸡胚/#个， 用照蛋器
逐个观察， 选取发育良好的活胚， 分别用碘酒棉 球消毒蛋壳， 无菌取出鸡胚， 弃去眼睛和内脏团， 放入 1##:; 无菌烧杯内，直接用汉克氏液冲洗三 次（ 洗去血液及粘性物质） ， 用灭菌剪刀将鸡胚剪 成 !::/大小的碎块， 倒入 !###:; 的玻璃瓶中， 按
!"!"6
素。
抗生素
医用青霉素； 链霉素； 硫酸卡那霉
! !"#$% !"! 材料 !"!"! 鸡胚 由中国兽医药品监察所提供 !#日龄 $%&鸡胚。 !"!"’ 犊牛血清 由美国 ()*+,-. 公 司 提 供 的 未
经消毒、 经检验无菌、 无支原体、 无病毒的新生犊 牛血清、 冷冻备用。
!"’ 方法 !"’"! 传统法
全胚法
在半胚法的基础上，不对鸡胚作 将转瓶和小刻氏瓶
任何处理， 其他步骤相同。 贴壁细胞的分类鉴定 的细胞分别作 5)1 染色，于显微镜下鉴定贴壁细 胞的细胞种类。
’() 特别感谢中国兽医药品监察所为本试
验的开设提供一切方便。
*+,-./)
#
陈瑞铭主编 ) 动物组织培养技术 及 其 应 用 ［ /］ )北 京<科 学 技 术 出版社， #00*
!"!"/ 或353维持液， #"/2胰蛋白酶溶液，改良的汉克收稿日期： ’##’?#/ Nhomakorabea!<
培养液
0"12 碳 酸 氢 钠 溶 液 ， 3 !44 营 养 液
? !! ?
中国家禽
!""# 年第 !$ 卷第 $ 期
!"#$% &’()*+, - ’)./012’.0./334
每只鸡胚 !"#$%& 的量加入胰蛋白酶和适量的碳 酸氢钠溶液， 轻度摇晃， 置’()!"’*)!+ 水浴锅中消 待组织碎块呈现毛绒状， 吸出胰酶， 再 化 ’$%,-， 用汉克氏液将其冲洗三次 . 以彻底去掉胰酶， 随后 用力摇晃成糊状. 加入适量的 /#00 营养液或 /1/ 维持液 （ 每#$$%&的/#00营养液或 /1/ 维持液中 含有谷氨酰胺溶液， 丙酮酸溶液各 #%&） 。然后再 用力摇晃以分散细胞， 静 置 !%,-， 倒出上清液为 细胞悬液， 如此反复数次， 再用#2层灭菌纱布过滤 细胞悬液，滤液按 #$3 比例加入犊牛血清和适量 的碳酸氢钠溶液 . 调整细胞悬液的 45 为 ()# 左右， 并加入适量青、 链霉素和硫酸卡那霉素， 抽取细 胞悬液， 用血球计数板做活细胞计数， 然后分装 于转瓶和小刻氏瓶中， ’(+培养267。
目前， 全国各科研院所、 生产厂家在制备鸡 胚成纤维细胞时， 常用的方法有传统法、 半胚法 和全胚法。本试验通过对三种方法制备成纤维细 胞的比较， 旨在发现一种简捷高效制备成纤维细 胞的方法。
氏溶液， 溶液均 /2谷氨酰胺溶液， /2丙酮酸溶液。 为自配， 经除菌过滤， 并检验无菌后冷冻或常温 保存备用。
2 ! " 用传统 2)# 在使用相同数量同样鸡胚的情况下， 法， 半胚法， 全胚法三种方法制备 819 细胞悬液的 活细胞数分别为 !2$ 万 : %&， # #;$万 : %&， # 2$$ 万 : 结果见表#。 %&，
’
王 明 俊 等 主 编)兽 医 生 物 制 品 学 ［ 中国农业出版社， /］ )北 京 ：
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2)2 细胞类别及生长状况 比 较 三 种 方 法 制 备 的819单层细胞均以成纤维细胞生长为主，并有
少量的上皮细胞， 但传统法制备的单层细胞致密 程度较低， 即产量低于半胚法和全胚法。而半胚 法制备的单层细胞致密程度与全胚法相差不大， 但全胚法中含有少量的肝细胞（ 平均 2 个 : 视野） ， 而半胚法中却没有， 半胚法可以避免肝细胞可能 带来的不良影响。