鸡胚成纤维细胞的制作及培养

鸡胚成纤维细胞的制作及培养
鸡胚成纤维细胞培养
1、准备:取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。

开始工作前先洗手、
75%酒精擦拭手至肘部。

2、布局:点燃酒精灯，安装吸管帽。

3、选胚:取9-10日龄鸡胚，(注:鸡胚日龄越小，形成细胞活力越好，但产量较低)用新
洁尔灭消毒蛋壳10分钟后放净化台。

用碘酒、酒精消毒蛋壳。

用镊子打开气室。

4、用另一套镊子将壳膜打开将鸡胚夹起去头、爪、眼，放灭菌生理盐水中。

5、把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污;如怀疑组织可能污染，可先
置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。

6、剪切:用眼科剪把组织切成1~2毫米大小的块，以便于消化。

7、处理组织:将已剪碎的组织碎片倒入一个带玻璃珠的灭菌三角瓶中，其中加入0.25%的
胰酶，10个胚约7ml，或加组织消化液，一个胚1ml(组织消化液以及胰酶的配置见微
生物指导)结扎瓶口或塞以胶塞。

8、消化:将其置入37?水浴箱中或用恒温水浴，消化中应不停摇动，如用电磁恒温搅拌器
消化更好。

消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。

消化10,15分钟。

一般约12
分钟。

视鸡胚日龄大小而定。

越小消化时间越短。

见组织松软即可。

一般不可消化时间
太长否则容易导致细胞活力不足。

9、分离:在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织
已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，加入0.5,的含5,犊牛血清双抗的的水
解乳蛋白Hank，s液少许。

(制法见微生物试验实习指导)，用力震摇，或用吸管吹打。

使细胞分散，脱落。

然后用纱布过滤或随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的
组织块。

低速(500~1000转/分)离心消化液5分钟，吸出上清(可以不离心吸掉上清)，
加入适量含有血清的培养液。

10、计数:用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培
养瓶中。

对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，
说明液体变酸，可用NaHCO调整。

分装在细胞培养瓶中。

视细胞多少而定加入培养基。

3
培养基为0.5,的含5,犊牛血清双抗的的水解乳蛋白Hank，s液. 11、将其置入co2细胞培养箱中，37度。

瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。

培养24小时进行观察。

一般在24,48小时可形成单
层细胞。

传代
1. 倾倒培养瓶内旧培养液。

2. 向瓶内加入胰蛋白酶和EDTA混合液少许，以能覆满瓶底为限。

3. 置温箱中2~5分钟，当发现细胞质回缩，细胞间隙增大后，立即终止消化。

4. 吸除消化液，向瓶内注入Hanks液数毫升，轻轻转动培养瓶，把残余消化液冲掉。

注意加Hanks液冲洗细胞时，动作要轻，以免把已松动的细胞冲掉流失，如用胰蛋白酶液单独消化，吸除胰蛋白酶液后，可不用Hanks液冲洗，直接加入培养液。

5. 用吸管吸取营养液轻轻反复吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。

6. 计数板计数后，把细胞悬液分成等份分装入数个培养瓶中，置温箱中培养。