成纤维细胞培养

人皮肤成纤维细胞库的构建
试剂: 胶原酶(Sigma)，优质胎牛血清(Gibco)，胰蛋白酶(Sigma)，中性蛋白酶(Sigma)，DMEM培养基(Sigma)，二甲基亚砜(Merck)。

配液 :成纤维细胞培养基配制:DMEM10g，NaHCO3 3．7g，HEPES 2．4g，优质胎牛血清100ml，青霉素100 000U，链霉素100 000U，超纯水加至1 000ml，用1N NaOH 调pH值至7-2～7．4，0．22pan孑L滤膜过滤除菌，9Om】／瓶分装，一2O℃贮存备用。

D—Hanks 平衡盐液：NaC1 8．0g，KC1 0．4g，Na2HPO4·12H：0 134．4mg，KH~PO4 0．06g，NaHCO3 0．35g，酚红O．O2g，青霉素100000U，链霉素100000U，超纯水加至1 o0Ornl，用1N NaOH调pH值至7．2-7A，0．22tun孔滤膜过滤除菌，90ml／瓶分装，一2O℃贮存备用。

方法:乙醇棉球将标本用力擦拭3遍；标本移至培养皿中，用D—Hanks平衡盐液反复用力彻底冲洗标本5遍，直至标本发白，轻度发胀；在培养皿中修剪皮下筋膜组织及多余的皮下脂肪，将标本剪成0．3cmx2．0em大小的皮条，置于培养皿中，加0．25％胰蛋白酶浸没组织，4℃冰箱中消化14~16h，以用眼科镊能轻轻揭下表皮为度；消化后的标本置于超净工作台上。

吸出胰蛋白酶，用DMEM漂洗2遍，中止胰蛋白酶消化作用；用眼科镊轻轻揭下表皮，置于另一培养皿中(用于培养角质形成细胞)，真皮置于培养皿中，用眼科剪将真皮成分剪成糊状(组织大小约为0．1cmx0．1cmx0．1cm)，加入0．2％胶原酶浸没组织，37℃孵箱中消化1~4h，以将组织基本上消化散开，看不到组织块为度；加D-Hanks平衡盐液1 500#min离心5min，5遍，以洗去胶原酶，沉淀即为成纤维细胞，弃上清，加DMEM制成细胞混悬液，接种至50ml培养瓶中，置37℃、5％CO：、湿度95％的CO 孵箱中培养131。

24h后更换培养基，以后更换培养液1次／3d，大约7~9d左右长满后传代。

成纤维细胞的传代:倒掉培养瓶内旧培养液，向培养瓶内加入0．25％的胰蛋白酶2ml。

轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有细胞表面，然后倒掉消化液后再加入2ml新的消化液，轻轻摇动后再倒掉大部分消化液，仅留少许进行消化。

消化约2—5min后把培养瓶放置显微镜下观察，当胞质回缩、细胞变圆、细胞间隙增大后，加入DMEM 2ml终止消化，用吸管反复吹打瓶壁细胞，吹打过程要顺序进行，细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液。

按1：3传代至新的培养瓶中，置37℃、5％CO 、湿度95％的CO2孵箱中培养，约3~5d左右可再次传代。

成纤维细胞的冻存与复苏:用0．25％的胰蛋白酶2ml消化、分散接近长满单层的成纤维细胞，当胞质回缩、细胞变圆、细胞间隙增大后，加入DMEM 6ml终止消化，轻轻吹打细胞。

以使细胞游离，1 500r／min离心5min，去除胰蛋白酶及旧的培养液，将细胞重悬于配制好的含有10％无菌二甲基亚砜DMEM冻存液中，然后分装入无菌塑料冻存管中，每支冻存管加液1~2ml，封闭冻存管，标明细胞的名称、代数及冻存日期，先将冻存管置于4℃冰箱中保存2h，一20℃冰柜中保存2h，一80℃超低温冰柜中保存2h，即可迅速投入一196~C长期保存。

复苏时，将冻存管从液氮中取出，迅速置于37℃水浴中复温，加入8ml培养液，混合后1 O00r／min离心5min，倾去上清液，再加入10rnl培养混悬，重复低速离心5rain，以除去二甲基亚砜，用新鲜培养液重悬细胞，用培养液适当稀释，使细胞接种密度为1xllY／ml，接种培养瓶，置37℃、5％C0 、湿度95％的CO 培养箱内培养，待细胞贴壁后更换培养液。

最后，将成纤维细胞在倒置显微镜下直接观察其细胞形态，并摄相。

换液注意事项：
贴壁细胞换液的时候是从培养瓶的非细胞附着面加PBS（避免影响细胞贴壁），然后轻轻晃动瓶子，从非细胞附着面倒出PBS （也可以吸出来，以免弄湿瓶口），洗的次数以镜下视野比较干净为准（只要你加pbs不是太少，一般2次左右就洗干净了），一般不需要吹打，尤其是在你刚传了代或者细胞贴壁能力不是很好的情况下
细胞的换液
(1) 从培养箱中取出培养瓶，观察细胞。

内容有：①培养瓶中培养液的PH值。

②培养瓶中液体是否澄清。

③倒置显微镜下细胞的生长状态。

(2) 翻转培养瓶，使贴有细胞的一面瓶壁向上，并使培养瓶口斜向上倾斜约45°，开瓶盖，用酒精灯的外焰烧瓶口消毒。

玻璃瓶瓶口先有雾气生成，等瓶口再次透亮即可。

一次性使用的培养瓶只需将瓶口过火即可。

(3) 长滴管吸取培养液，放入废液缸中。

(4) 新吸管吸5ml培养液加入细胞瓶。

(5) 关瓶盖。

瓶盖拧紧后向回拧半圈，以利于CO2进入。

完成实验记录。