实验九：鸡胚成纤维细胞的制备

0.25mL至培养瓶中（如果是50mL的培养瓶，加0.5mL的细
胞悬液)，吹打均匀盖好瓶塞。在瓶上注明组别、日
期，置37℃温箱中培养(4h后细胞即可贴壁，24-
36h生长成单层细胞，此时可更换培养液，并接种
病毒)。分装后2-4h不可大幅度移动培养瓶，以免 影响细胞的贴壁和生长。本实验培养3天，培养期 间可每天观察1次。3天后取出，洗净培养瓶，放 回实验室。
本实验以鸡胚成纤维细胞作为原代细 胞，通过细胞培养实践操作，认识和体 会原代细胞的制备方法和影响细胞培养
的主要因素，并掌握原代细胞培养的方
法。
四、实验步骤
（一）操作前的准备
1、预热培养液：把已经配制好的生长液、Hanks 液和胰蛋白酶液放入37℃水浴锅内预热； 2、用75%酒精棉擦拭双手和紫外线照射过的超净 工作台； 3、正确摆放要使用的器械：保证足够的操作空 间，不仅便于操作而且可减少污染； 4、点燃酒精灯.
4、一般2d换一次培养液，细胞长成单层后要及 时进行细胞传代
5、细胞培养对玻璃器皿洗涤要求严格，彻底洗
涤后用蒸馏水冲洗，再用双蒸水冲洗，干燥 灭菌后备用。所有的溶液都要用双蒸水配 制，所用药品试剂用分析纯。
实验九 鸡胚成纤维细胞的制备
一、实验目的
学习和掌握鸡胚成纤维细胞的制备和培养方法； 了解原代细胞培养的原理和方法。
二、试验器具、试剂、仪器
超净工作台，检卵灯，灭菌的细胞培养瓶、眼科剪、眼科
镊、平皿、吸管、离心管等；9-11日龄鸡胚；Hanks液，
0.25%胰酶消化液，双抗（10000IU/ml青链霉素）， 7.5%NaHCO3溶液，DMEM营养液，75%酒精棉。
（3）来自百度文库体匀浆
用灭菌剪将胚体剪碎至1mm3小碎块。加 入Hanks液（淹住组织碎块即可），轻摇，静 置1-2min，待组织块下沉，吸去上层悬液。 重复2-3次（以除去其中的红细胞），至上悬
液不混浊为止，移入灭菌的小三角瓶中，吸去
Hanks液。
2、分散细胞 （1）胰酶消化
取出预热好的0.25%胰酶，向三角瓶中加入约8mL。 包紧瓶口，37℃消化30min，每隔5min轻轻摇动1次。 由于胰酶的作用，鸡胚细胞与细胞间的氨基和羧基游 离。待液体变混而稍稠，轻摇可见组织块悬浮在液体
用4层脱脂纱布将吹打后的细胞过滤到平皿中，
收集滤液。
（三）分装与培养
1、细胞计数 用细胞计数器计数，根据计数结果，加入 DMEM生长液，调整细胞浓度至50万-60万个
/ml。（本实验省略此步）
2、分装与培养 在培养瓶中加入2mLDMEM生长液(如果是50mL
的培养瓶，加4mL生长液)，小心吸出过滤后的细胞悬液
（四）细胞形态观察
检查时注意培养液的颜色变化，变黄但不混浊表 示有细胞生长，变红表示细胞未生长或生长不佳。 37℃培养24-48h后，于倒置显微镜下观察，细胞可 以长成单层，细胞透亮，呈纤维状，细胞膜清晰。
五、注意事项
1、整个过程严格无菌操作 2、培养液不要太多，应有足够的空间保证细胞对 氧的需要 3、放入CO2培养箱培养时，不要将盖子拧得太 紧，并将CO2浓度控制在5%
内不易下沉，此时可中止消化。如再继续消化，可破
坏细胞膜而不易贴壁生长，如果消化不够，则细胞不 易分散。
（2）分散细胞 将消化好的细胞悬液从水浴锅中取出，弃去上层 液体，加5mL含血清的DMEM生长液（DMEM营养液 +5%犊牛血清+100IU/ml青链霉素，用7.5%NaHCO3 溶液调pH7.2），以吸管反复吹吸数次，使细胞分散， 此时可见生长液混浊，即为细胞悬液。静置1min后， 使未冲散的组织块下沉。 （3）过滤
三、实验原理
病毒能在易感的组织或单层细胞内增殖，并可 产生细胞病变，因此，细胞培养是病毒学研究的重
要手段，是进行病毒性疫苗生产和病毒性疾病诊断
必不可少的工具。原代细胞培养是体外制备细胞培 养物的必经过程，从供体体内取出组织分散成单个 细胞接种于培养液中为初次培养，从初次培养到第 一次传代培养为原代培养。
（二）鸡胚成纤维细胞的制备
1、鸡胚的处理 （1）蛋壳消毒 取9-11日龄的鸡胚，用检卵灯选取血管清楚、
活动正常的鸡胚，置蛋架上，令气室端向上，
75%酒精棉消毒蛋壳气室部位。
（2）胚体采集
以镊子击破卵壳气室部位，并除去该部位卵壳。 用无菌的眼科镊子撕开蛋壳气室膜并小心拨开绒毛 尿囊膜和羊膜，钩住鸡胚头部，移入灭菌的平皿内。 用剪刀剪去胚头、四肢及内脏，用Hanks液洗去体 表血液，移入灭菌小烧杯中。