实验九：鸡胚成纤维细胞的制备
鸡胚成纤维细胞制作方法
鸡胚成纤维细胞制作方法
试剂：无Ca2+、Mg2+的Hank’s液
0.25%胰酶
生长液----Hank’s液ml +0.5%水解乳蛋白ml +小牛血清10～15ml+庆大霉素1ml 材料：小烧杯×1、小烧瓶×1、注射器×1、镊子×2、剪刀×1、平皿×1、滴管数支、200目铜网×1、小漏斗×1、刻度尖底离心管×1
方法：
1、选取9～11日龄鸡胚1只，大头朝上，分别用碘酒、酒精消毒，用镊子破壳和壳膜，取出胚体，放入平皿中。
2、用无Ca2+、Mg2+的Hank’s液洗胚体2～3次。
3、弃去鸡胚的头、脚、翅及内脏，剪碎胚体并转入小烧瓶中。
4、用无Ca2+、Mg2+的Hank’s液振荡洗涤，静置片刻，待胚块沉淀后吸去上清，重复3次。
5、加无Ca2+、Mg2+的Hank’s液至终体积约4ml，加1ml 0.25%胰酶（终浓度0.625%），置37℃消化至胚块“起毛”（大组织块边缘似纤毛运动），约5分钟。
6、弃上清，加入含小牛血清的Hank’s液，用滴管反复吹打至见不到组织块。
7、用200目铜网过滤至刻度尖底离心管中，2000r/min×10min。
8、弃上清，加入少量生长液吹散细胞沉淀，按细胞压积（1：300）加生长液，分装入细胞培养瓶，置培养箱培养。
鸡胚成纤维细胞(CEF)的制作及细胞培养
鸡胚成纤维细胞（CEF）的制作及细胞培养（一）CEF的制备1. 实验试剂1×DMEM（不含丙酮酸钠）、小牛血清、高压过的PBS、胰酶、双抗。
2. 实验设备和材料酒精灯、酒精喷壶、酒精棉、打火机、计时器、一次性手套废液缸、镊子、细胞瓶、50 mL试管架、50 mL离心管、1000ul 移液枪及枪头、100 uL移液枪及枪头、塑料吸管、一次性培养皿、SPF鸡胚（9-11日龄均可）将3把小镊子、1把剪刀、1个50 mL离心管、1个玻璃培养皿放入一个大号饭盒内；取一中号锥形瓶，瓶口由内到外分别盖上6层纱布、锡箔纸、报纸包好，高压30 min备用。
3. 实验步骤（1）将所用材料放入超净工作台（小牛血清及胰酶除外），紫外照射30 min。
（2）用镊子取出高压过的平皿、镊子，倒入PBS液；（3）酒精消毒气室处蛋壳，去除蛋壳，撕开壳膜、尿囊膜和羊膜，取出鸡胚，置于培养皿中用镊子去除头、四肢和内脏，并将胚体置于另一个培养皿中冲洗干净；（4）将胚体置于高压过的50 mL离心管内，略水平放置，用剪刀充分剪碎，越碎越好；（5）加入胰酶（5 mL/个），37℃水浴锅内消化5-8 min，待胚体呈绒毛状即可，吸除消化液；（6）加入30 mL含10%血清的DMEM，充分吹打，静置片刻，过滤至锥形瓶内；（7）重复第六步；（8）分装至培养瓶或将细胞按1.2×106 cells/well传到6孔板中，每孔 2 mL。
（二）细胞冻存（1）倒去细胞上清液，加入PBS洗去残留的培养基，洗两次。
（2）加入0.25%的胰酶，消化10-20 s后倒去。
（3）1瓶细胞加入1 mL培养基吹打均匀，吸入到离心管中。
（4）将细胞离心，1000 rpm，2-3 min。
（5）根据计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20% FBS+10% DMSO）重悬细胞，一般两瓶细胞冻存三管（FBS越高，细胞复苏时活力越大）。
DMSO一定要配成10%。
鸡胚成纤维细胞的制作及培养
鸡胚成纤维细胞培养1、准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。
开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。
2、布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。
3、选胚：取9-10日龄鸡胚，（注：鸡胚日龄越小，形成细胞活力越好，但产量较低）用新洁尔灭消毒蛋壳10分钟后放净化台。
用碘酒、酒精消毒蛋壳。
用镊子打开气室。
4、用另一套镊子将壳膜打开将鸡胚夹起去头、爪、眼，放灭菌生理盐水中。
5、把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。
6、剪切：用眼科剪把组织切成1~2毫米大小的块，以便于消化。
7、处理组织：将已剪碎的组织碎片倒入一个带玻璃珠的灭菌三角瓶中，其中加入0.25%的胰酶，10个胚约7ml，或加组织消化液，一个胚1ml（组织消化液以及胰酶的配置见微生物指导）结扎瓶口或塞以胶塞。
8、消化：将其置入37℃水浴箱中或用恒温水浴，消化中应不停摇动，如用电磁恒温搅拌器消化更好。
消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。
消化10－15分钟。
一般约12分钟。
视鸡胚日龄大小而定。
越小消化时间越短。
见组织松软即可。
一般不可消化时间太长否则容易导致细胞活力不足。
9、分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，加入0.5％的含5％犊牛血清双抗的的水解乳蛋白Hank，s液少许。
（制法见微生物试验实习指导），用力震摇，或用吸管吹打。
使细胞分散，脱落。
然后用纱布过滤或随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。
低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清（可以不离心吸掉上清），加入适量含有血清的培养液。
10、计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。
对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。
答案--生物制品复习题
一、填空1、目前基因工程抗体有以下几种类型，包括嵌合抗体、重构抗体、单链抗体、 Ig相关分子、噬菌体抗体。
2、按微生物学控制程度由松到严，将实验动物分为普通级动物、清洁级动物，无特定病原体动物、无菌动物、悉生动物。
7、按遗传质量控制可将实验动物分为四类，即近交系动物、杂交群动物、突变系动物、封闭群动物等。
3、一般生物制品制备流程是：培养增殖、分离纯化、浓缩、制剂、检验。
4、诊断用生物制品的最基本要求是特异性强和敏感度高。
包括诊断用抗原、诊断用抗体和标记抗体三类。
5、细胞因子是一组由机体免疫细胞和非免疫细胞合成和分泌的小分子或中等分子量的可溶性蛋白质与糖蛋白。
根据的细胞因子的生理功能将其为以下种类：、干扰素、集落刺激因子、白细胞介素、肿瘤坏死因子、趋化因子、生长因子、促红细胞生长素。
6、基因工程疫苗包括以下几种，即基因工程亚单位疫苗、基因工程载体疫苗、核酸疫苗、基因缺失活疫苗、蛋白质工程疫苗、转基因植物疫苗。
8、对生物组织与细胞破碎的方法有高压匀浆法、高速珠磨法、超声振荡破碎法、压力法、反复冻融法、化学渗透法、酶溶破碎法等。
20 等。
17、○18、○19 、○9、动物生物制品的质量检验主要包括○16 、○10、抗体具有特异性结合相关抗原、激活补体、结合细胞、介导细胞毒、促进吞噬和通过胎盘等功能。
发挥其抗肿瘤、抗感染、免疫调节与监视、解毒等作用。
11、实验动物通过注射方法给药的方式包有：皮内注射、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、静脉注射。
12、生物制品成品的质量检验主要内容包括物理性状检验、无菌检或纯粹检、安全检验、效力检验、其他检验等。
13、对实验动物小白鼠采血的方法有尾静脉、眼眶动脉和静脉（摘眼球法）、眼眶静脉丛、心脏、大血管、断头等。
二、选择题1、下列物质中抗原性最好的是：A、蔗糖B、多肽C、丁酸D、赖氨酸12、下列物质中抗原性最好的是：A、葡萄糖B、蛋氨酸C、乙酸D、多肽2、临产前动物进行计划性疫苗接种，是为了使新生动物获得＿＿。
鸡胚成纤维细胞的制备
鸡胚成纤维细胞的制备一、材料和试剂1、鸡胚：9-10日龄发育良好的SPF胚2、试剂：0.25％胰酶，MEM培养基，新生牛血清，1万IU双抗，3%谷氨酰胺，7.5%碳酸氢钠3、仪器和器材：，带6-8层纱布的100ml烧杯两个，直径9cm的平皿两个，中号镊子四把，倒置显微镜，培养箱，50ml细胞培养瓶，10ml刻度吸管两根、5ml刻度吸管，250ml生理盐水瓶两个，无菌的细胞培养瓶，灭菌好的PBS，酒精棉球，废液缸等二、操作步骤1、操作前的准备：○1预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。
○2用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。
○3正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。
○4点燃酒精灯：注意火焰不能太小。
○5准备好将要使用的消毒后的培养瓶。
○6取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。
2、成纤维细胞制备：①将选好的9-10日龄的发育良好的SPF胚用5%的碘棉消毒蛋壳气室部位，再用酒精棉脱碘。
②无菌取出鸡胚，放入灭菌的玻璃皿内，用PH7.2的PBS冲洗一次，去头，四肢和内脏。
③再用PH7.2的PBS冲洗两次。
④用镊子捏成小块（2-3mm3）, 用PH7.2的PBS冲洗两次。
⑤鸡胚约加4ml0.25%胰酶溶液，38℃消化30min，期间15min轻摇一次。
⑥期间配制细胞培养液：培养基：MEM双抗：2%7.5% 碳酸氢钠：2%牛血清：6%3% 谷氨酰胺：1%⑦消化结束，弃掉胰酶消化液，用PH7.2的PBS冲洗两次，再用细胞生长液冲洗一次。
⑧加入适量的细胞生长液，用刻度吸管反复吹打（使细胞充分分散）。
⑨将细胞分散液倒入带6-8层纱布的100ml烧杯中（过滤之前先用少许细胞培养液润湿纱布），加入适量培养液（40ml/胚），过滤。
⑩重复步骤⑨的操作重虑一遍。
11计数，要求每1ml滤液中约含活细胞100万-150万个。
鸡胚成纤维细胞的制作及培养
鸡胚成纤维细胞的制作及培养鸡胚成纤维细胞培养1、准备:取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。
开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。
2、布局:点燃酒精灯，安装吸管帽。
3、选胚:取9-10日龄鸡胚，(注:鸡胚日龄越小，形成细胞活力越好，但产量较低)用新洁尔灭消毒蛋壳10分钟后放净化台。
用碘酒、酒精消毒蛋壳。
用镊子打开气室。
4、用另一套镊子将壳膜打开将鸡胚夹起去头、爪、眼，放灭菌生理盐水中。
5、把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污;如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。
6、剪切:用眼科剪把组织切成1~2毫米大小的块，以便于消化。
7、处理组织:将已剪碎的组织碎片倒入一个带玻璃珠的灭菌三角瓶中，其中加入0.25%的胰酶，10个胚约7ml，或加组织消化液，一个胚1ml(组织消化液以及胰酶的配置见微生物指导)结扎瓶口或塞以胶塞。
8、消化:将其置入37?水浴箱中或用恒温水浴，消化中应不停摇动，如用电磁恒温搅拌器消化更好。
消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。
消化10,15分钟。
一般约12分钟。
视鸡胚日龄大小而定。
越小消化时间越短。
见组织松软即可。
一般不可消化时间太长否则容易导致细胞活力不足。
9、分离:在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，加入0.5,的含5,犊牛血清双抗的的水解乳蛋白Hank，s液少许。
(制法见微生物试验实习指导)，用力震摇，或用吸管吹打。
使细胞分散，脱落。
然后用纱布过滤或随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。
低速(500~1000转/分)离心消化液5分钟，吸出上清(可以不离心吸掉上清)，加入适量含有血清的培养液。
10、计数:用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。
对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO调整。
胚的培养实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 掌握胚胎培养的基本原理和操作步骤。
2. 学习在体外条件下模拟胚胎发育过程，观察胚胎的形态变化和生长情况。
3. 探讨不同培养条件对胚胎发育的影响。
二、实验原理胚胎培养是指将受精卵或早期胚胎置于体外的人工培养系统中，模拟体内环境，使其继续发育和生长。
通过胚胎培养，可以研究胚胎发育的规律，筛选优良胚胎，以及进行胚胎基因编辑等。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 受精卵或早期胚胎- 培养基：DMEM/F12、KSR、Hams F12- 胎牛血清（FBS）- 促性腺激素（如hCG）- 透明质酸酶- 胚胎培养皿- 显微镜- CO2培养箱- 移液器- 计时器2. 实验仪器：- 超净工作台- 恒温箱- 高压灭菌器- 电子天平四、实验步骤1. 准备培养基：- 将DMEM/F12、KSR、Hams F12培养基按照说明书比例配制，并加入胎牛血清（FBS）。
- 将培养基在无菌条件下过滤除菌，并分装于培养皿中，备用。
2. 胚胎处理：- 将受精卵或早期胚胎置于超净工作台中，用消毒后的移液器吸取一定量的透明质酸酶，轻轻涂抹在胚胎表面。
- 适当放置一段时间，使透明质酸酶作用于胚胎表面，使其分散成单个细胞。
3. 胚胎培养：- 将处理后的胚胎放入装有培养基的培养皿中，放入CO2培养箱中培养。
- 每天观察胚胎的生长情况，记录胚胎的形态变化和细胞分裂情况。
4. 不同培养条件实验：- 将胚胎分别置于不同浓度的胎牛血清（FBS）培养基中培养，观察胚胎的生长情况。
- 将胚胎置于不同温度、pH值、氧气浓度等条件下培养，观察胚胎的生长情况。
5. 结果记录与分析：- 记录不同培养条件下胚胎的形态变化、细胞分裂情况以及生长速度。
- 对实验结果进行统计分析，探讨不同培养条件对胚胎发育的影响。
五、实验结果1. 正常培养条件下：- 胚胎在正常培养条件下能够正常发育，细胞分裂速度较快，形态变化明显。
2. 不同胎牛血清（FBS）浓度条件下：- 随着胎牛血清（FBS）浓度的增加，胚胎的生长速度和细胞分裂速度逐渐加快。
一种鸡胚成纤维细胞快速制备与保存方法的研究
一种鸡胚成纤维细胞快速制备与保存方法的研究作者：赵海棋高庆芳张泽恺苗立中刘建钗苑文娴唐娜来源：《家禽科学》2023年第11期摘要：为了进一步提高鸡胚成纤维细胞（Chicken embryo fibroblast，CEF）的制备效率和活力，试验以短时多次消化法缩短胰酶消化时间，提高细胞活力。
同时，通过优化血清、胰酶、培养基等保存条件，增加细胞4 ℃保存时间。
经CCK-8细胞活性检测、活细胞计数、传代培养等方法比较验证，结果表明，所建立的制备方法简易、快速、细胞活力高；细胞在4 ℃、不添加血清和胰酶的DMEM培养基中保存96 h内仍保有良好的贴壁生长能力。
该方法的建立为实验室内快速制备CEF细胞提供候选方案，可有效减少鸡胚的使用。
关键词：鸡胚成纤维细胞；细胞制备；细胞保存; 原代细胞；细胞培养作为细胞生物学试验研究中的一个重要环节，细胞培养技术被广泛应用于现代生物工程、生命科学和药物研发等领域，原代细胞也已成为基本的细胞生物学试验研究样品，在生理学、细胞生物化学、药学、毒理学等研究领域广泛应用。
其中，鸡胚成纤维细胞（Chicken embryo fibroblast，CEF）因具有适应性强、繁殖速度快、来源广、成本低等优势，被大量应用于生物工程研究与疫苗生产中，多种常见的病毒如禽马立克病毒（Marek’s disease virus，MDV）[1]、传染性法氏囊病毒（Infectious bursal disease，IBDV）[2]、火鸡疱疹病毒（Herpesvirus of turkey，HVT）[3]等的研究都以CEF为重要材料。
目前，实验室制备CEF需要现用现制，大量使用鸡胚，既增加受污染的风险，也不利于动物福利，还给试验研究带来额外的工作量。
因此，通过多次试验，本研究尝试建立一种快速、小量制备鸡胚成纤维细胞的候选方案，在保障细胞活力、提高制备效率的同时，能够降低受污染风险，且可短期保存细胞，从而减少制备次数和鸡胚使用量。
鸡胚成纤维细胞制备PPT课件
用4层脱脂纱布将吹打后的细胞过滤到平皿中，收集滤液。
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实验步骤
（四）细胞形态观察 检查时注意培养液的颜色变化，变黄但不混浊表示有细胞
生长，变红表示细胞未生长或生长不佳。37℃培养24-48h后， 于倒置显微镜下观察，细胞可以长成单层，细胞透亮，呈纤维 状，细胞膜清晰。
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实验步骤
五、注意事项
1、整个过程严格无菌操作
将剪碎的组织块放入锥形瓶中，加入适量的胰酶。包紧瓶 口，37℃水域消化30min，每隔5min轻轻摇动1次。当组织块 变得蓬松透明时，吸弃消化液，用PBS洗两遍，中止消化。如 再继续消化，可破坏细胞膜而不易贴壁生长，如果消化不够， 则细胞不易分散。
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实验步骤
（2）分散细胞 将消化好的细胞悬液从水浴锅中取出，弃去上层液体，加
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实验步骤
（3）胚体匀浆 用灭菌剪将胚体剪碎至1mm3小碎块。加入PBS（淹住
组织碎块即可），轻摇，静置1-2min，待组织块下沉，吸去 上层悬液。重复2-3次（以除去其中的红细胞），至上悬液不 混浊为止，移入灭菌的锥形瓶中，吸去PBS。
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实验步骤
2、分散细胞 （1）酶消化
鸡胚成纤维细胞制备
取孵化9-10日龄的鸡胚，碘酒→酒精消毒→取出鸡胚→放入盛有Hank’s液的灭菌平皿内→用Hank’s液洗三次→将鸡胚去内脏、爪、翅、头部→再用Hank’s液洗2次胚体→用镊子将胚体夹碎→将夹碎的胚体用镊子夹到培养瓶中→加0.25%胰酶消化液（2ml/胚或盖住沉淀为宜）→密封瓶口→37℃水浴消化10～20分钟（长毛刺时方可）。
将消化好的胚体取出→将胰酶液倒掉→再用Hank’s液冲洗3次，加入培养液→用吸管敲打（吹打）碎，→倒入带纱布的烧瓶内（16层纱布）→用培养液冲洗培养瓶→过滤到250ml瓶中→制成细胞悬液。
最后细胞稀释到80～110万个/ml,在细胞培养瓶中生长。
抗原进入机体后，除少数可以直接作用于淋巴细胞外，大多数抗原都要经过吞噬细胞的摄取和处理。
经过处理的抗原，可将其内部隐蔽的抗原决定簇暴露出来。
体液免疫：
吞噬细胞将抗原呈递给T细胞，再由T细胞呈递给B细胞——（感应阶段），再由B细胞产生记忆B细胞和效应B细胞（浆细胞），从而产生抗体——（反应阶段）。
抗体处理抗原——（效应阶段）
有的抗原可以直接刺激B细胞（后面程序一样）。
这种抗原呈递，多数是通过细胞表面的直接相互接触来完成的
细胞免疫：
T细胞产生记忆T细胞和效应T细胞——（感应阶段）。
效应T细胞将病毒的宿主细胞裂解，暴露出抗原——（反应阶段）。
然后由吞噬细胞将其消灭——（效应阶段）。
鸡胚成纤维细胞制备优秀课件
间，不仅便于操作而且可减少污染； 4、点燃酒精灯. 5、准备好将要使用的消毒后的培养瓶。 6、取出预热好的培养用液：取出已经预热好的养用液，用酒精棉球 擦拭好后方能放入超净台内。
实验步骤
（二）鸡胚成纤维细胞的制备 1、鸡胚的处理 （1）蛋壳消毒
实验步骤
（3）胚体匀浆 用灭菌剪将胚体剪碎至1mm3小碎块。加入PBS（淹住
组织碎块即可），轻摇，静置1-2min，待组织块下沉，吸去上 层悬液。重复2-3次（以除去其中的红细胞），至上悬液不混 浊为止，移入灭菌的锥形瓶中，吸去PBS。
实验步骤
2、分散细胞 （1）胰酶消化
将剪碎的组织块放入锥形瓶中，加入适量的胰酶。包 紧瓶口，37℃水域消化30min，每隔5min轻轻摇动1次。当组织 块变得蓬松透明时，吸弃消化液，用PBS洗两遍，中止消化。 如再继续消化，可破坏细胞膜而不易贴壁生长，如果消化不够， 则细胞不易分散。
实验步骤
（四）细胞形态观察 检查时注意培养液的颜色变化，变黄但不混浊表示有
细胞生长，变红表示细胞未生长或生长不佳。37℃培养24-48h 后，于倒置显微镜下观察，细胞可以长成单层，细胞透亮，呈 纤维状，细胞膜清晰。
实验步骤
五、注意事项 1、整个过程严格无菌操作 2、培养液不要太多，应有足够的空间保证细胞对氧的需要 3、放入CO2培养箱培养时，将CO2浓度控制在5%。 4、吸除消化液，向瓶内注入PBS数毫升，轻轻转动培养瓶，把 残余消化液冲掉。注意冲洗细胞时，动作要轻，以免把已松动 的细胞冲掉流失，如用胰蛋白酶液单独消化，吸除胰酶液后， 可不用PBS冲洗，直接加入培养液。 5、细胞培养对玻璃器皿洗涤要求严格，彻底洗涤后用蒸馏水 冲洗，再用双蒸水冲洗，干燥 灭菌后备用。所有的溶液都要 用双蒸水配制，所用药品试剂用分析纯。
鸡胚成纤维细胞制备
鸡胚成纤维（CEF）细胞的制备材料准备：干烤好的漏斗，高压好的12层纱布，50ml的烧杯，锥形瓶，剪刀，镊子，平皿，Hank’s液，含10%血清的199培养基，胰酶，19日龄SPF鸡胚（CEK细胞），9日龄SPF 鸡胚（CEF细胞）。
取胚：用新洁尔灭对鸡蛋外壳进行消毒，用碘酒消毒气室部位蛋壳，再用75%酒精脱碘消毒，剪碎气室部位蛋壳，取出鸡胚，剪断鸡胚与卵黄连接的脐带，将鸡胚放置干净的平皿上。
取组织：取小烧杯，倒入适量微温Hank’s液，将鸡胚仰放，制备CEK细胞除去胃、肠、肝脏、肺脏、心脏等器官，用小镊子将嵌入在脊椎两侧的肾脏取出，浸泡在Hank’s液中；制备CEF细胞去掉头、翅膀、腿和内脏，将剩余的胴体放入50ml的烧杯。
漂洗，剪碎：用Hank’s也漂洗3次，将组织脏器剪成1mm3左右的小块，再用Hank’s液漂洗3次。
胰酶消化：将小烧杯中的组织小块移到锥形瓶中，加入适量37℃水浴加热的胰酶溶液，放在水浴锅中消化30-35min。
终止消化：待组织体积增大、边缘出现毛边停止消化，小心倒出胰酶，用Hank’s液洗3遍。
制备细胞：除去Hank’s液，加入适量含10%血清的199培养基，剧烈震荡，将液体倒入含12层纱布的漏斗，重复数次，一般按1个胚加入25mL培养基来计算培养基总量。
活细胞计数：用血球计数板进行台盼兰细胞计数。
用酒精冲洗计数板后擦净，将盖片覆在计数板上，微微移向一侧，以便滴加细胞悬液；取一吸管伸入培养瓶，轻轻吸打，混匀细胞悬液；用微量移液枪从盖片边缘滴加20μL细胞悬液，使其充满计数板和盖片间的空隙中；勿使液体漫过盖片或出现气泡；镜下观察并计算计数板的四角大格内的细胞数，压线者只计算左侧和上方的，右侧和下方的不计算在内；细胞数/毫升原液=(4大格细胞数/4)×10000×稀释倍数。
每4个大方格计数，以80-120个为宜。
未着色的为活细胞，呈蓝色的为死细胞，进行活细胞计数：用台盼兰染色进行活细胞计数后，调整CEK、CEF细胞密度至100×104个/mL左右，25cm2塑料细胞培养瓶中接入8mL细胞分散液，置于37℃细胞培养箱静置培养。
成纤维细胞的制作
成纤维细胞的制作
成纤维细胞的制作和接毒
一、原代成纤维细胞的制作：将生长到9-10日龄的SPF鸡胚，新洁尔灭表面消毒，敲除气室处蛋壳后小心取出鸡胚，用灭菌的PBS轻轻漂洗一遍。
用镊子和剪刀去除眼、内脏、四肢，将剩余部分转移至小烧杯和平皿中，，用剪刀剪成糊状，转移至灭菌离心管中，以每胚体加入8ml含0.25%的胰酶溶液，置于37℃反应约5min。
用吸管吸入0.5ml犊牛血清，终止胰酶作用，静置3-5min，轻轻吸出上层，再用生长液（5%血清DMEM）悬浮胚块，静置，吸出上层，将吸出液用灭菌纱布（4层）过滤，收集滤液，用肽芬兰染色计数。
以500-800万活细胞/方瓶分装。
细胞培养箱中培养，12小时后观察生长状况，并根据需要换培养基。
二、次代成纤维细胞的培养：待方瓶完全被细胞贴壁时，倒掉生长液，用1ml37℃预热的PBS洗涤细胞表层。
加入1ml0.25%胰酶PBS，37℃消化3-8分钟，中间不断观察，当细胞伪足收缩时，倒掉消化液，用不含胰酶的PBS轻轻洗涤一遍，加8ml生长液，吹匀细胞，将其分装成两个方瓶，或以100μl每孔，分装96孔板，置细胞培养箱中培养。
三、细胞接毒：将待接样品取100μl接种于生长近70-80%的细胞方瓶中。
一周后用胰酶消化分装96孔板，再维持一周。
鸡胚成纤维细胞(CEF)制备
取9~11日龄SPF鸡胚，分别用碘酒和酒精棉由鸡胚中央向四周擦拭消毒，然后放入超净台，将有气室的部位朝上，小心地用无菌镊子磕破蛋壳，沿气室边缘夹掉蛋壳，注意不让蛋壳碎屑落入蛋内，换用新的无菌镊子揭开尿囊绒毛膜，再用弯头镊子深入胚内夹住鸡胚颈部取出，放入平皿中，将取出的鸡胚去脑、四肢、内脏，放入一小烧杯中，然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎，直到成1 mm3左右的小块，再用PBS清洗3遍，至组织块发白为止。
将剪碎的组织块移入另一小烧杯中，加入适量的（1ml左右）0.5%胰酶和9mlPBS，于37℃水浴中消化10min左右。
倒掉PBS和胰酶混合液然后加入生长液25ml终止消化，用枪头充分吹打成单个细胞。
再用8层灭菌纱布过滤，将过滤的得到的细胞悬浮液稀释10倍，使细胞终浓度达到50万个/ml，每个细胞瓶加入8ml。
放入CO2培养箱中，37℃培养24小时，直至细胞长成单层致密，及可以接毒。
鸡胚成纤维细胞培养doc
一、鸡胚成纤维细胞的体外培养鸡胚成纤维细胞在病毒学研究中十分常用。
孵化8－12d的鸡胚可用作培养的材料来源。
（一）实验材料1. 鸡胚：孵化10d的受精蛋数个。
孵化方法是将受精蛋放到38.5℃孵卵箱或恒温箱中，静置。
每日翻动1—2次，以防止鸡胚粘连到蛋壳上影响发育。
箱内湿度(40～70％)可通过在箱底放一盛水盘来维持。
鸡胚的孵化期为2ld。
孵化前，如遇蛋壳表面污物较多，可用刀片等器具刮除，不要用湿布擦拭，更不能用酒精棉球消毒或者用水洗蛋。
孵育前可将受精蛋保存在10℃左右，保存期一般不超过10d。
也有人将受精蛋保存在4℃冰箱中。
2. 消化液：含0.25％胰蛋白酶、青霉素100 1U／ml、链霉素100 μg/ml混合消化液。
用Hanks 液或HEPES液配制。
3. 培养液：DMEM培养液，添加10％－20％的胎牛血清（FCS）、青霉素100 IU/ml、链霉素100 μg/mL。
4. 其它培养用品：手术器械、平皿、三角瓶或15ml血清瓶、离心管、100目不锈钢筛网、培养瓶或培养板、振荡水浴箱、离心机等。
（二）操作步骤1)取孵化10d的鸡胚，分别用碘酒与酒精棉球擦拭消毒，晾干。
用一已消毒金属器具将受精蛋大头端击破，用镊子小心夹去破碎蛋壳，然后撕去气室外面的膜，暴露出尿囊绒膜及附着的血管。
开口大小以受精蛋内容物不溢出为宜，但不宜太小。
用镊子轻轻夹住鸡胚的颈部，小心取出鸡胚，放于无菌培养皿中，除去头部、四肢、内脏和皮肤。
2)胚体用Hanks液或生理盐水清洗3次，切成1－2 mm3的小块，然后转移到容积适中的三角瓶或15ml血清瓶内。
3)加入适量消化液，一般每10个鸡胚加20 m1消化液，用胶塞密封瓶口。
4)在振荡水浴箱上37℃慢速搅拌5－10 min。
加入少量血清钝化胰蛋白酶。
然后通过100目不锈钢筛网，制备细胞悬液，将细胞悬液转移到离心管中。
5)离心（800 rpm，10 min），弃上清液，将细胞沉淀用培养液洗2次。
实验九：鸡胚成纤维细胞的制备课件
取9-11 日龄的鸡胚，用检卵灯选取血管清楚、 活动正常的鸡胚，置蛋架上，令气室端向上， 75% 酒精棉消毒蛋壳气室部位。
(2)胚体采集
以镊子击破卵壳气室部位，并除去该部位卵壳。 用无菌的眼科镊子撕开蛋壳气室膜并小心拨开绒毛 尿囊膜和羊膜，钩住鸡胚头部，移入灭菌的平皿内。 用剪刀剪去胚头、四肢及内脏，用Hanks液洗去体 表血液，移入灭菌小烧杯中。
液体，加5mL含血清的DMEM生长液(DMEM营养液 +5%犊牛血清+100IU/ml青链霉素，用7.5%NaHCO3 溶液调pH7.2)，以吸管反复吹吸数次，使细胞分散， 此时可见生长液混浊，即为细胞悬液。静置1min后， 使未冲散的组织块下沉。
(3)过滤 用4层脱脂纱布将吹打后的细胞过滤到平皿中，收
三、实验原理
病毒能在易感的组织或单层细胞内增殖，并可产 生细胞病变，因此，细胞培养是病毒学研究的重要 手段，是进行病毒性疫苗生产和病毒性疾病诊断必 不可少的工具。原代细胞培养是体外制备细胞培养 物的必经过程，从供体体内取出组织分散成单个细 胞接种于培养液中为初次培养，从初次培养到第一 次传代培养为原代培养。
回实验室。
ห้องสมุดไป่ตู้
五、注意事项
1、整个过程严格无菌操作 2、培养液不要太多，应有足够的空间保证细胞对
氧的需要
3、放入CO2培养箱培养时，不要将盖子拧得太 紧，并将CO2浓度控制在5%
4、一般2d换一次培养液，细胞长成单层后要及 时进行细胞传代
5、细胞培养对玻璃器皿洗涤要求严格，彻底洗 涤后用蒸馏水冲洗，再用双蒸水冲洗，干燥 灭菌后备用。所有的溶液都要用双蒸水配 制，所用药品试剂用分析纯。
四、实验步骤
(一)操作前的准备 1、预热培养液：把已经配制好的生长液、 Hanks
室温消化法制备鸡胚成纤维细胞的试验研究
室温消化法制备鸡胚成纤维细胞的试验研究鸡胚组织是组织培养最早被利用的对象。
早年组织培养工作者，如Carrel等曾用鸡胚做过大量研究工作。
目前，鸡胚成纤维细胞已被广泛应用于细胞和分子生物学研究的许多方面，这主要是由于成纤维细胞是最易培养的细胞，其良好的耐受性使之易于进行从基因转染到微注射等较多领域的研究。
本试验经长期摸索、比较、找到一种制备鸡胚成纤维细胞的优化方法——室温消化法。
1材料与方法1．1材料1013龄SPF鸡胚由广东省永顺兽医厂提供。
DMEM原粉购自美国GIBCO公司，按说明书添加双蒸水、NaHCO，，调pH值至7．0，正压滤过除菌，4~C保存。
使用前添加10％~b牛血清、1％双抗。
小牛血清购自上海实生细胞生物技术有限公司，一20~C保存，使用前56℃水溶30min，再用孔径0．22m的滤膜滤过除菌。
Hanks液用江苏宜兴市赛尔生物化工厂生产的Hanks液干粉，按说明书添加双蒸水正压滤过除菌，用前调pH值至7．2—7．6，4℃保存。
2．5g／L胰蛋白液由胰蛋白酶(东方科学仪器进出口公司分装，活性1：250)加Hanks液、双抗液配制而成，一20％保存用前调pH值至7．6—7．8。
％10000U／mL青霉素和10000g ／mL链霉素的双抗及7．5％碳酸氢钠液按常规方法制备。
1．2鸡胚成纤维细胞的制备取1013龄鸡胚2个，用无菌方法将胚提出放入无菌平皿中，去喙、爪、翅和内脏，剪成小块以Hanks液洗2～3次，移入无菌内含磁力搅拌棒的50mL锥形瓶中，再用Hanks搅拌洗涤23次，然后以每个鸡胚10mL 的量加入2．5g／L胰蛋白酶液，室温低速磁力搅拌消化10～15min。
消化完毕，以8层灭菌纱布滤过，将滤液离心去除胰蛋白酶消化液，再用DMEM细胞培养液将细胞悬起计数分装于细胞培养瓶中，置37~C含5％CO的培养箱中培养24h。
2结果每个鸡胚可以制备出约1．8X10个细胞。
培养4h即先贴壁生长，20～22h细胞能至70％～80％贴壁长满单层，细胞团块及少、死亡未贴壁的悬浮细胞少且整体贴壁细胞长势旺盛，这种细胞最易于进行转染等应的基因工程操作如图所示，如果应用于病毒分离培养等操作，应延长培养细胞至24h为宜。
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（3）胚体匀浆
用灭菌剪将胚体剪碎至1mm3小碎块。加 入Hanks液（淹住组织碎块即可），轻摇，静 置1-2min，待组织块下沉，吸去上层悬液。 重复2-3次（以除去其中的红细胞），至上悬
液不混浊为止，移入灭菌的小三角瓶中，吸去
Hanks液。
2、分散细胞 （1）胰酶消化
取出预热好的0.25%胰酶，向三角瓶中加入约8mL。 包紧瓶口，37℃消化30min，每隔5min轻轻摇动1次。 由于胰酶的作用，鸡胚细胞与细胞间的氨基和羧基游 离。待液体变混而稍稠，轻摇可见组织块悬浮在液体
本实验以鸡胚成纤维细胞作为原代细 胞，通过细胞培养实践操作，认识和体 会原代细胞的制备方法和影响细胞培养
的主要因素，并掌握原代细胞培养的方
法。
四、实验步骤
（一）操作前的准备
1、预热培养液：把已经配制好的生长液、Hanks 液和胰蛋白酶液放入37℃水浴锅内预热； 2、用75%酒精棉擦拭双手和紫外线照射过的超净 工作台； 3、正确摆放要使用的器械：保证足够的操作空 间，不仅便于操作而且可减少污染； 4、点燃酒精灯.
三、实验原理
病毒能在易感的组织或单层细胞内增殖，并可 产生细胞病变，因此，细胞培养是病毒学研究的重
要手段，是进行病毒性疫苗生产和病毒性疾病诊断
必不可少的工具。原代细胞培养是体外制备细胞培 养物的必经次培养，从初次培养到第 一次传代培养为原代培养。
用4层脱脂纱布将吹打后的细胞过滤到平皿中，
收集滤液。
（三）分装与培养
1、细胞计数 用细胞计数器计数，根据计数结果，加入 DMEM生长液，调整细胞浓度至50万-60万个
/ml。（本实验省略此步）
2、分装与培养 在培养瓶中加入2mLDMEM生长液(如果是50mL
的培养瓶，加4mL生长液)，小心吸出过滤后的细胞悬液
0.25mL至培养瓶中（如果是50mL的培养瓶，加0.5mL的细
胞悬液)，吹打均匀盖好瓶塞。在瓶上注明组别、日
期，置37℃温箱中培养(4h后细胞即可贴壁，24-
36h生长成单层细胞，此时可更换培养液，并接种
病毒)。分装后2-4h不可大幅度移动培养瓶，以免 影响细胞的贴壁和生长。本实验培养3天，培养期 间可每天观察1次。3天后取出，洗净培养瓶，放 回实验室。
实验九 鸡胚成纤维细胞的制备
一、实验目的
学习和掌握鸡胚成纤维细胞的制备和培养方法； 了解原代细胞培养的原理和方法。
二、试验器具、试剂、仪器
超净工作台，检卵灯，灭菌的细胞培养瓶、眼科剪、眼科
镊、平皿、吸管、离心管等；9-11日龄鸡胚；Hanks液，
0.25%胰酶消化液，双抗（10000IU/ml青链霉素）， 7.5%NaHCO3溶液，DMEM营养液，75%酒精棉。
（二）鸡胚成纤维细胞的制备
1、鸡胚的处理 （1）蛋壳消毒 取9-11日龄的鸡胚，用检卵灯选取血管清楚、
活动正常的鸡胚，置蛋架上，令气室端向上，
75%酒精棉消毒蛋壳气室部位。
（2）胚体采集
以镊子击破卵壳气室部位，并除去该部位卵壳。 用无菌的眼科镊子撕开蛋壳气室膜并小心拨开绒毛 尿囊膜和羊膜，钩住鸡胚头部，移入灭菌的平皿内。 用剪刀剪去胚头、四肢及内脏，用Hanks液洗去体 表血液，移入灭菌小烧杯中。
4、一般2d换一次培养液，细胞长成单层后要及 时进行细胞传代
5、细胞培养对玻璃器皿洗涤要求严格，彻底洗
涤后用蒸馏水冲洗，再用双蒸水冲洗，干燥 灭菌后备用。所有的溶液都要用双蒸水配 制，所用药品试剂用分析纯。
内不易下沉，此时可中止消化。如再继续消化，可破
坏细胞膜而不易贴壁生长，如果消化不够，则细胞不 易分散。
（2）分散细胞 将消化好的细胞悬液从水浴锅中取出，弃去上层 液体，加5mL含血清的DMEM生长液（DMEM营养液 +5%犊牛血清+100IU/ml青链霉素，用7.5%NaHCO3 溶液调pH7.2），以吸管反复吹吸数次，使细胞分散， 此时可见生长液混浊，即为细胞悬液。静置1min后， 使未冲散的组织块下沉。 （3）过滤
（四）细胞形态观察
检查时注意培养液的颜色变化，变黄但不混浊表 示有细胞生长，变红表示细胞未生长或生长不佳。 37℃培养24-48h后，于倒置显微镜下观察，细胞可 以长成单层，细胞透亮，呈纤维状，细胞膜清晰。
五、注意事项
1、整个过程严格无菌操作 2、培养液不要太多，应有足够的空间保证细胞对 氧的需要 3、放入CO2培养箱培养时，不要将盖子拧得太 紧，并将CO2浓度控制在5%