鸡胚成纤维细胞制备PPT课件
鸡胚成纤维细胞单层培养
鸡胚成纤维细胞单层培养一、原理离体的器官、组织、细胞短时间并不死亡。
对机体的器官、组织、细胞提供适当的环境条件和营养物质，可使其在离体情况下继续生长和繁殖，这种技术方法分别称之为器官培养、组织培养、细胞培养，一般统称为组织培养，而在病毒学研究中通常指的是细胞培养。
原代细胞单层培养就是在无菌条件下，直接从机体取出器官和组织的全部或一部分，用机械方法或适当的组织分散剂（一般用胰蛋白酶）消化处理，使组织快分散成单个细胞悬液。
经洗涤和细胞计数，定量分装到一定的容器内，提供该细胞生长所必须的环境条件和营养物质，促使细胞贴壁并不断分裂生长繁殖，直至成均匀致密的细胞单成。
多种动物、植物、人的组织都可以用来进行细胞培养。
在实际工作中，对细胞来源的选择主要是根据细胞对病毒的易感性，细胞来源难易来决定的。
二、目的和要求了解细胞培养的一般原理，掌握原代细胞单成培养的操作技术。
三、实验材料1、孵育10日龄发育良好的鸡胚。
2、抗菌素溶液（每ml含青霉素10000单位、链霉素10000微克）；碳酸氢钠液。
3、洗涤液：Hank’s液（经碳酸氢钠液调节PH为7.0～7.2）；无钙、镁离子磷酸缓冲液（CMF－PBS）。
4、细胞分散剂：0.25%胰蛋白霉溶液。
5、营养液：0.5％水解乳蛋白－Hank’s液（LH液，也称乳汉液），加入1%抗菌素溶液，5％小牛血清，用碳酸氢钠调节PH为7.0～7.2。
6、实验器械：卵架、碘酒和酒精消毒棉球、酒精灯、镊子、血球计数板、显微镜、水浴锅、温箱、吸球、灭菌眼科镊和剪、培养瓶、橡皮塞、吸管、平皿、三角瓶、烧杯、带有过滤纱布（四层）的漏斗。
四、操作方法1、鸡胚的获得及处理：（1）去10日龄发育良好的鸡胚，照蛋标出气室。
气室向上直立于卵架上，依次用碘酒和酒精棉球由中央及四周涂抹卵壳除菌消毒。
无菌操作下，用镊子去除气室部卵壳；换无菌镊子去处壳膜，穿破绒毛尿囊膜夹住鸡胚胎颈部，取出鸡胚放于灭菌平皿中。
（2）除去鸡胚头、翅、肢体，清除内脏，用Hank’s液冲洗鸡胚三次。
鸡胚成纤维细胞的制作及培养
鸡胚成纤维细胞培养1、准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。
开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。
2、布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。
3、选胚：取9-10日龄鸡胚，（注：鸡胚日龄越小，形成细胞活力越好，但产量较低）用新洁尔灭消毒蛋壳10分钟后放净化台。
用碘酒、酒精消毒蛋壳。
用镊子打开气室。
4、用另一套镊子将壳膜打开将鸡胚夹起去头、爪、眼，放灭菌生理盐水中。
5、把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。
6、剪切：用眼科剪把组织切成1~2毫米大小的块，以便于消化。
7、处理组织：将已剪碎的组织碎片倒入一个带玻璃珠的灭菌三角瓶中，其中加入0.25%的胰酶，10个胚约7ml，或加组织消化液，一个胚1ml（组织消化液以及胰酶的配置见微生物指导）结扎瓶口或塞以胶塞。
8、消化：将其置入37℃水浴箱中或用恒温水浴，消化中应不停摇动，如用电磁恒温搅拌器消化更好。
消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。
消化10－15分钟。
一般约12分钟。
视鸡胚日龄大小而定。
越小消化时间越短。
见组织松软即可。
一般不可消化时间太长否则容易导致细胞活力不足。
9、分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，加入0.5％的含5％犊牛血清双抗的的水解乳蛋白Hank，s液少许。
（制法见微生物试验实习指导），用力震摇，或用吸管吹打。
使细胞分散，脱落。
然后用纱布过滤或随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。
低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清（可以不离心吸掉上清），加入适量含有血清的培养液。
10、计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。
对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。
实验一——鸡胚成纤维细胞的培养PPT课件
拔出瓶塞、塞上瓶塞时瓶口和塞子要灼烧；倾 倒液体前后都要灼烧瓶口，并且瓶口向下，低 于瓶底；倾倒液体时两瓶口之间不能接触。
瓶内是严格无菌的，所以要保证吸管不接触到 瓶口的外壁。若一旦接触，更换新的吸管。
1 5
3
实验材料
预加10%FCS和双抗的1640培养液；消化液 (0.25%胰蛋白酶- 0.02%EDTA溶液)；DHanks平衡盐溶液；
灭菌培养皿、青瓶、细胞培养瓶各1个； 巴氏吸管若干支、纱布若干；眼科镊1把，剪
刀1把； 碘酒，75％酒精棉球；酒精灯1台；废液缸。
4
实验设备
（1） 37℃-CO2培养箱 （2）倒置显微镜 （3）超净台
5.培养 于37℃-CO2温箱内培养。24-48h后可长成 单层细胞。
1 0
实验结果
1、观察原代细胞的形态和生长状况；
2、如出现细胞培养液浑浊情况，请鉴别是否细 菌污染。
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注意事项
1. 切割组织块时务必要切成小块 2. 整个操作过程要严格保持无菌 3.严格控制胰酶消化时间 4. 放入孵箱前应在培养瓶表面标明细胞名称、日期 和组别 1 5. 实验用品放回原处，摆放整齐
2
无菌操作的一般要求
用75％酒精擦拭消毒双手。 超净台台面应整洁，用0.1％新洁尔灭擦净。 打开超净台的紫外灯照射台面30min左右。使用
超净台时，打开风机，点燃酒精灯。
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严格在酒精灯无菌范围之内操作。 使用巴氏吸管以及其他吸管时，取出后要手拿末端
安上橡皮头后，过酒精灯火焰略烧后插在无菌盐水 瓶或试管内。 操作时，严禁说话，尽量不用手直接拿无菌的物品， 如瓶塞等，而要用器械，如镊子等去拿。 不能用手接触瓶口、吸管口以及镊子和剪刀的头部。
鸡胚成纤维细胞制备.pptx
实验所需器材、试剂
超净工作台，检卵灯，灭菌的细胞培养瓶、眼科剪、眼科镊、平皿、 吸管、离心管等；9-11日龄鸡胚；PBS，0.25%胰酶消化液，DMEM营养 液，75%酒精棉。
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实验步骤
（一）操作前的准备 1、预热培养液：把已经配制好的生长液、Hanks
液和胰蛋白酶液放入37℃水浴锅内预热； 2、用75%酒精棉擦拭双手和紫外线照射过的超净
将剪碎的组织块放入锥形瓶中，加入适量的胰酶。包 紧瓶口，37℃水域消化30min，每隔5min轻轻摇动1次。当组织 块变得蓬松透明时，吸弃消化液，用PBS洗两遍，中止消化。 如再继续消化，可破坏细胞膜而不易贴壁生长，如果消化不够 ，则细胞不易分散。
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实验步骤
（2）分散细胞 将消化好的细胞悬液从水浴锅中取出，弃去上层液体
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@your name
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鸡胚成纤维细胞元代培养 CEF的培养是在一定条件下，在体外模拟体内生理环 境，使从体内取出的成纤维组织细胞生存、生长和传 代，并维持原有组织细胞的结构和功能特性。
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实验原理
病毒能在易感的组织或单层细胞内增殖，并可产生细胞病变，因此， 细胞培养是病毒学研究的重要手段，是进行病毒性疫苗生产和病毒性 疾病诊断必不可少的工具。原代细胞培养是体外制备细胞培养物的必 经过程，从供体体内取出组织分散成单个细胞接种于培养液中为初次 培养，从初次培养到第一次传代培养为原代培养。本实验以鸡胚成纤 维细胞作为原代细胞，通过细胞培养实践操作，认识和体会原代细胞 的制备方法和影响细胞培养的主要因素，并掌握原代细胞培养的方法 。
取9-11日龄的鸡胚，用检卵灯选取血管清楚、活动正常的 鸡胚，置蛋架上，令气室端向上，用碘酒棉消毒蛋壳气室部位 。 （2）胚体采集
鸡胚成纤维细胞cDNA表达文库的构建
它整 J6K,;6L 技术是一种新的通用型克隆系统， 合了各种克隆载体的技术平台， 可加快达到最终研 究目标的速度。该技术克服了其它技术常用的两种 方法： 酶切和连接、 S/M 产品克隆等相关的制约因 素。J6K,;6L 技术基于已被详尽研究的 !噬菌体位 点特异性重组系统， 使得在不同的克隆载体之间转 移 FHI 片段、 保持基因定位和阅读框架及有效地取 代使用限制性内切酶和连接酶进行克隆和亚克隆的 方法成为可能， 具有简单快速、 克隆效率高、 方便灵
鸡传染性法氏囊病 （ !"#$%&’()* +),*-. /’*$-*$ ， 是由鸡传染性 法 氏 囊 病 病 毒 （ !"#$%&’()* +),*-. E0F） 引起的一种危害鸡的急性、 高度 /’*$-*$ 0’,)* ，E0FG） 接触性传染病。 E0FG 主要侵染幼鸡未成熟的 0 淋 年龄较大的 巴细胞， # ( & 周龄的幼鸡为易感鸡群， 鸡具有一定抵抗力， 小于 # 周龄的雏鸡感染后会产 生严重的免疫抑制
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一种鸡胚成纤维细胞快速制备与保存方法的研究
一种鸡胚成纤维细胞快速制备与保存方法的研究作者：赵海棋高庆芳张泽恺苗立中刘建钗苑文娴唐娜来源：《家禽科学》2023年第11期摘要：为了进一步提高鸡胚成纤维细胞（Chicken embryo fibroblast，CEF）的制备效率和活力，试验以短时多次消化法缩短胰酶消化时间，提高细胞活力。
同时，通过优化血清、胰酶、培养基等保存条件，增加细胞4 ℃保存时间。
经CCK-8细胞活性检测、活细胞计数、传代培养等方法比较验证，结果表明，所建立的制备方法简易、快速、细胞活力高；细胞在4 ℃、不添加血清和胰酶的DMEM培养基中保存96 h内仍保有良好的贴壁生长能力。
该方法的建立为实验室内快速制备CEF细胞提供候选方案，可有效减少鸡胚的使用。
关键词：鸡胚成纤维细胞；细胞制备；细胞保存; 原代细胞；细胞培养作为细胞生物学试验研究中的一个重要环节，细胞培养技术被广泛应用于现代生物工程、生命科学和药物研发等领域，原代细胞也已成为基本的细胞生物学试验研究样品，在生理学、细胞生物化学、药学、毒理学等研究领域广泛应用。
其中，鸡胚成纤维细胞（Chicken embryo fibroblast，CEF）因具有适应性强、繁殖速度快、来源广、成本低等优势，被大量应用于生物工程研究与疫苗生产中，多种常见的病毒如禽马立克病毒（Marek’s disease virus，MDV）[1]、传染性法氏囊病毒（Infectious bursal disease，IBDV）[2]、火鸡疱疹病毒（Herpesvirus of turkey，HVT）[3]等的研究都以CEF为重要材料。
目前，实验室制备CEF需要现用现制，大量使用鸡胚，既增加受污染的风险，也不利于动物福利，还给试验研究带来额外的工作量。
因此，通过多次试验，本研究尝试建立一种快速、小量制备鸡胚成纤维细胞的候选方案，在保障细胞活力、提高制备效率的同时，能够降低受污染风险，且可短期保存细胞，从而减少制备次数和鸡胚使用量。
CEF、DEF培养
鸡胚成纤维细胞（CEF）、鸭胚成纤维细胞(DEF)培养一、材料9¬10日龄鸡胚13¬14日龄鸭胚眼科剪、镊、外科镊、巴氏吸管、蛋架、灭菌平皿 25ml小三角瓶Hanks＇液 0.25%胰酶液 Versene液灭菌纱布、玻璃漏斗、0.1% 结晶柠檬酸（0.1M）或0.4%台盼兰,血球计数板、60ML培养瓶或60ML培养皿、灭菌盖玻片、营养液。
二方法（CEF为例）鸡胚理：取9¬10日龄鸡胚直于蛋架，在气室部用于5%碘酊棉消毒，再用洒精棉脱色，用外科镊击破蛋壳用眼科镊取出胚体放于平皿内，去喙瓜眼和内脏，用Hank＇s液洗两次，用弯头眼科剪剪胚剪成1-2mm的碎块，加Hank’s液20ml,略加摇振，静置使组织块下沉，将混有红血球及碎片的上悬液吸去，重复洗2—3次，直至上悬液不混浊为止。
2、消化：将0.25%胰蛋白酶溶液用5、6%NaHCO2滴定至PH7、6—7、8，加热至37度，按组织块量3—5倍加于装有鸡胚碎块的三角瓶中，每个鸡胚约需胰酶5ml，30分钟取出，静置1—2分钟，吸去胰液，再加HanK’s 液20ml，轻轻摇动后吸去，如此反复两三次，目的是洗去残余的胰酶。
第三次加入营养液，每胚3ml左右，用粗口吸管吹吸数次，使细胞脱落分散。
静置1—2分钟，候组织下沉后，细心将细胞悬液吸出，另置一只25ml三角瓶，如此反复数次，使细胞尽量自组织块脱落，将多次取得的悬液合并一处，纱布过滤悬液。
必须注意每次吹吸一般6—7次为宜，太多则细胞受损，消化时间要灵活掌握，不足细胞不易掊落，太久则细胞破碎。
在消化过程中，摇动时组织不易下沉即立即停止，消化后如组织粘连如涕，证明消化过度。
二、细胞计数：取细胞悬液0.1（100ul）置盛有0.9ml10.4%台盼蓝的试管中混合,用血球计数板计数。
计算方法：4大方格细胞数每ml细胞数=——————————————X10（5）45中格细胞数或每ml细胞数=——————————X10（4）三：接种以营养液配成每ml10（6）细胞（最终稀释度）接种链霉素瓶（1ml）、60ml瓶（8—10ml），100mm dish（10ml），60mm dish（4ml），37度孵育48小进后形成单层，接种病毒或作次代培养。
鸡胚成纤维细胞制备优秀课件
间，不仅便于操作而且可减少污染； 4、点燃酒精灯. 5、准备好将要使用的消毒后的培养瓶。 6、取出预热好的培养用液：取出已经预热好的养用液，用酒精棉球 擦拭好后方能放入超净台内。
实验步骤
（二）鸡胚成纤维细胞的制备 1、鸡胚的处理 （1）蛋壳消毒
实验步骤
（3）胚体匀浆 用灭菌剪将胚体剪碎至1mm3小碎块。加入PBS（淹住
组织碎块即可），轻摇，静置1-2min，待组织块下沉，吸去上 层悬液。重复2-3次（以除去其中的红细胞），至上悬液不混 浊为止，移入灭菌的锥形瓶中，吸去PBS。
实验步骤
2、分散细胞 （1）胰酶消化
将剪碎的组织块放入锥形瓶中，加入适量的胰酶。包 紧瓶口，37℃水域消化30min，每隔5min轻轻摇动1次。当组织 块变得蓬松透明时，吸弃消化液，用PBS洗两遍，中止消化。 如再继续消化，可破坏细胞膜而不易贴壁生长，如果消化不够， 则细胞不易分散。
实验步骤
（四）细胞形态观察 检查时注意培养液的颜色变化，变黄但不混浊表示有
细胞生长，变红表示细胞未生长或生长不佳。37℃培养24-48h 后，于倒置显微镜下观察，细胞可以长成单层，细胞透亮，呈 纤维状，细胞膜清晰。
实验步骤
五、注意事项 1、整个过程严格无菌操作 2、培养液不要太多，应有足够的空间保证细胞对氧的需要 3、放入CO2培养箱培养时，将CO2浓度控制在5%。 4、吸除消化液，向瓶内注入PBS数毫升，轻轻转动培养瓶，把 残余消化液冲掉。注意冲洗细胞时，动作要轻，以免把已松动 的细胞冲掉流失，如用胰蛋白酶液单独消化，吸除胰酶液后， 可不用PBS冲洗，直接加入培养液。 5、细胞培养对玻璃器皿洗涤要求严格，彻底洗涤后用蒸馏水 冲洗，再用双蒸水冲洗，干燥 灭菌后备用。所有的溶液都要 用双蒸水配制，所用药品试剂用分析纯。
鸡胚发育图解(课堂PPT)
鸡胚孵化图片
第14天 尿囊血管 充分发育并紧贴 壳膜，通过内外 壳膜，蛋壳排除 二氧化碳和水蒸 气，吸进氧气； 尿囊液增加，主 要集中于羊膜周 围，新陈代谢旺 盛，胎儿增重迅 速，解剖胚蛋时 尿囊血管很容易 破裂。
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鸡胚孵化图片
第15天 尿 囊所包 围的蛋 白减少， 照视胚 蛋，小 端发亮 部位缩 小，胚 体与卵 黄的黑 影部分 增多。
鸡胚孵化图片
种蛋 优良种蛋
是获得高孵化
率的物质基础，
是集现代家禽
遗传育种，全
价营养饲料和
疾病净化科技
成果的“载
体”。现代蛋
用种鸡的种蛋
分白壳和褐壳
两类，肉用种
鸡在选育过程
中不注重蛋壳
颜色，其蛋壳
颜色间于白壳
与褐
1
鸡胚孵化图片
壳之间，中国 地方鸡种的蛋 壳颜色也与此 类似。市场上 流通的主要是 商品代和父母 代种蛋。白壳 蛋鸡品种与褐 壳蛋鸡品种正 反杂交后，产 生的后代母鸡 在成年后均生 产浅褐壳的商 品蛋。
受精，受精卵在
母体内滞留期间
不断分裂，到种
蛋产出体外时已
分裂成一团细胞，
此时为胚胎发育
的囊胚期，从正
面看囊胚像覆盖
在卵黄表面的圆
盘，中央为明区，
边缘为暗区，通
常成为胚盘。
4
鸡胚孵化图片
第1天 经过 24小时的 孵育，胚 盘变大变 厚，明区 和暗区同 时增大， 在卵黄上 可见到椭 圆形的盾 壮区称为 胚盾是未 来的胚区。
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新进来的水分并
不与卵黄液全面
融合而主要存于
胚区。胚胎与伸
展的卵黄囊血管
形似蚊子，白壳
种蛋通过照视可
鸡胚发育图解课件PPT
天增大了一倍，
几乎包围了卵黄
囊，从第4天到第
8天是尿囊发育的
第一阶段，胚胎
由卵黄囊呼吸转
化为尿囊呼吸，
胎儿外形发育趋
于完整，上喙白
色，破壳齿明显
可见，胸腹腔尚
未封闭，心、肝、
胃都暴露与体腔
外。羊水与尿囊
液迅202速1/3/1增0 多。
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鸡胚孵化图片
第9天 尿囊沿内壳 膜迅速向下端发 展，包围了胎儿 和卵黄，并包围 部分蛋白。胎儿 皮肤透明度下降， 皮肤表面出现排 列整齐的小点， 即羽毛原基。胸 腹腔已封闭，心、 肝、胃等器官已 包入体腔。
第15天 尿
囊所包
围的蛋
白减少，
照视胚
蛋，小
端发亮
部位缩
小，胚
体与卵
黄的黑
影部分
增多。
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鸡胚孵化图片
第16天 尿囊所
包围的蛋白
进一步减少，
尿囊液颜色
变混，有少
量尿酸盐沉
积，由于吞
食蛋白，胚
胎代谢产物
增多，排泄
的尿酸盐储
存在尿囊中。
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鸡胚孵化图片
第17天 这
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鸡胚孵化图片
第6天 尿囊增长迅速， 一天之内增长了约4 倍，尿囊血管系统 迅速发育，已经覆 盖羊膜与部分卵黄 囊，但较卵黄囊血 管细，卵黄囊血管 分布在卵黄面积2/3 以上，胚胎以初具 翼和腿的外形，眼 睛黑色素更多，照 蛋可见头部与躯干 部两个小圆团，俗 称“双珠”。
2021/3/10
内壳膜，可与外
界进行气体交换。
照蛋时卵黄不易
转动，胚与卵黄
实验一-鸡胚成纤维细胞的培养
02
实验过程中，细胞形态和生长曲线的变化符合预期，表明实验
操作和Байду номын сангаас件控制得当。
传代培养后细胞稳定增殖，表明所使用的培养基和条件能够支
03
持鸡胚成纤维细胞的正常生长。
对实验的改进和展望
在未来的实验中，可以尝试优化培养基的成分，以提高细胞的生长速度和活性。
可以进一步研究不同条件对鸡胚成纤维细胞生长和功能的影响，如温度、pH、气体 环境等。
了解细胞培养的基本原理和操作流程
掌握细胞生长和增殖 的基本原理，了解细 胞周期和细胞分裂的 过程。
了解细胞培养过程中 的注意事项和安全措 施。
熟悉细胞培养的基本 流程，包括原代细胞 的培养和传代细胞的 继代培养。
学习细胞培养的实验设计和数据分析方法
01 学习如何设计细胞培养的实验方案，确定实验参 数和对照组设置。
实验一-鸡胚成纤维 细胞的培养
目 录
• 实验目的 • 实验原理 • 实验步骤 • 结果分析 • 实验结论
01
CATALOGUE
实验目的
掌握鸡胚成纤维细胞的培养技术
01
掌握细胞培养的基本操作，如细胞分离、传代、计 数等。
02
熟悉细胞培养所需的仪器和试剂，如显微镜、细胞 培养皿、胰蛋白酶等。
03
了解细胞培养的环境条件，如温度、湿度、气体等 。
细胞形态的观察结果分析
总结词
观察鸡胚成纤维细胞的形态变化，分析 细胞形态与细胞功能的关系。
VS
详细描述
在实验过程中，通过显微镜观察鸡胚成纤 维细胞的形态变化，记录细胞的形态特征 。通过对比不同培养时间的细胞形态，可 以分析细胞形态与细胞功能的关系，进一 步了解细胞的生理状态和变化规律。
室温消化法制备鸡胚成纤维细胞的试验研究
室温消化法制备鸡胚成纤维细胞的试验研究鸡胚组织是组织培养最早被利用的对象。
早年组织培养工作者，如Carrel等曾用鸡胚做过大量研究工作。
目前，鸡胚成纤维细胞已被广泛应用于细胞和分子生物学研究的许多方面，这主要是由于成纤维细胞是最易培养的细胞，其良好的耐受性使之易于进行从基因转染到微注射等较多领域的研究。
本试验经长期摸索、比较、找到一种制备鸡胚成纤维细胞的优化方法——室温消化法。
1材料与方法1．1材料1013龄SPF鸡胚由广东省永顺兽医厂提供。
DMEM原粉购自美国GIBCO公司，按说明书添加双蒸水、NaHCO，，调pH值至7．0，正压滤过除菌，4~C保存。
使用前添加10％~b牛血清、1％双抗。
小牛血清购自上海实生细胞生物技术有限公司，一20~C保存，使用前56℃水溶30min，再用孔径0．22m的滤膜滤过除菌。
Hanks液用江苏宜兴市赛尔生物化工厂生产的Hanks液干粉，按说明书添加双蒸水正压滤过除菌，用前调pH值至7．2—7．6，4℃保存。
2．5g／L胰蛋白液由胰蛋白酶(东方科学仪器进出口公司分装，活性1：250)加Hanks液、双抗液配制而成，一20％保存用前调pH值至7．6—7．8。
％10000U／mL青霉素和10000g ／mL链霉素的双抗及7．5％碳酸氢钠液按常规方法制备。
1．2鸡胚成纤维细胞的制备取1013龄鸡胚2个，用无菌方法将胚提出放入无菌平皿中，去喙、爪、翅和内脏，剪成小块以Hanks液洗2～3次，移入无菌内含磁力搅拌棒的50mL锥形瓶中，再用Hanks搅拌洗涤23次，然后以每个鸡胚10mL 的量加入2．5g／L胰蛋白酶液，室温低速磁力搅拌消化10～15min。
消化完毕，以8层灭菌纱布滤过，将滤液离心去除胰蛋白酶消化液，再用DMEM细胞培养液将细胞悬起计数分装于细胞培养瓶中，置37~C含5％CO的培养箱中培养24h。
2结果每个鸡胚可以制备出约1．8X10个细胞。
培养4h即先贴壁生长，20～22h细胞能至70％～80％贴壁长满单层，细胞团块及少、死亡未贴壁的悬浮细胞少且整体贴壁细胞长势旺盛，这种细胞最易于进行转染等应的基因工程操作如图所示，如果应用于病毒分离培养等操作，应延长培养细胞至24h为宜。
鸡胚成纤维细胞的原代培养
鸡胚成纤维细胞的原代培养171850044生拔钱诗晨一、背景知识1.1原代培养与传代培养1.1.1原代培养是指直接从生物体取材（细胞、组织或器官）进行的第一次培养（中途不分割培养物、不更换培养物的生长器皿）。
1.1.2传代细胞培养分割细胞培养物进行的再配养注：细胞培养的代不是指细胞分裂次数，而是指培养的次数1.2细胞体外培养要求的条件✓无菌✓适宜温度：哺乳动物细胞36.5℃ 0.5℃，植物细胞原生质体25℃左右✓生理渗透压✓适宜酸碱度：7.2-7.4✓气体：95%空气+5%二氧化碳✓培养基：提供水、各种有机营养（糖、氨基酸、维生素等）及无机盐、生长调节因子等1.3培养细胞生长类型悬浮型：培养时不黏附于支持物之上。
而呈现悬浮生长的细胞。
贴壁型：培养时需要黏附于一定固相支持物表面才能很好生长的细胞。
又称黏附依赖型细胞（分如下四类）✧成纤维细胞：胞体呈梭形或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。
✧上皮型：细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。
✧游走型：呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。
此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。
在一定条件下，如培养基化学性质变动等，它们也可能成纤维细胞形态。
✧多形型：是一些形态上不规则的细胞。
细胞一般分胞体和胞突两部分，胞体呈不规则多边形，胞突呈细长丝状。
如神经元和神经胶质细胞1.4原代细胞培养的一般办法1.4.1植块培养法直接将组织块接入培养皿底部，待组织块贴牢在底部后再加入培养基培养的方法1.4.2离散细胞培养法用酶消化组织，使细胞之间连接破坏，将组织离散成单细胞悬液进行培养的方法注：原代培养中的植块培养法与组织培养不是一回事；植物组织培养又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织、器官或细胞、原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。
鸡胚成纤维细胞培养doc
一、鸡胚成纤维细胞的体外培养鸡胚成纤维细胞在病毒学研究中十分常用。
孵化8－12d的鸡胚可用作培养的材料来源。
（一）实验材料1. 鸡胚：孵化10d的受精蛋数个。
孵化方法是将受精蛋放到38.5℃孵卵箱或恒温箱中，静置。
每日翻动1—2次，以防止鸡胚粘连到蛋壳上影响发育。
箱内湿度(40～70％)可通过在箱底放一盛水盘来维持。
鸡胚的孵化期为2ld。
孵化前，如遇蛋壳表面污物较多，可用刀片等器具刮除，不要用湿布擦拭，更不能用酒精棉球消毒或者用水洗蛋。
孵育前可将受精蛋保存在10℃左右，保存期一般不超过10d。
也有人将受精蛋保存在4℃冰箱中。
2. 消化液：含0.25％胰蛋白酶、青霉素100 1U／ml、链霉素100 μg/ml混合消化液。
用Hanks 液或HEPES液配制。
3. 培养液：DMEM培养液，添加10％－20％的胎牛血清（FCS）、青霉素100 IU/ml、链霉素100 μg/mL。
4. 其它培养用品：手术器械、平皿、三角瓶或15ml血清瓶、离心管、100目不锈钢筛网、培养瓶或培养板、振荡水浴箱、离心机等。
（二）操作步骤1)取孵化10d的鸡胚，分别用碘酒与酒精棉球擦拭消毒，晾干。
用一已消毒金属器具将受精蛋大头端击破，用镊子小心夹去破碎蛋壳，然后撕去气室外面的膜，暴露出尿囊绒膜及附着的血管。
开口大小以受精蛋内容物不溢出为宜，但不宜太小。
用镊子轻轻夹住鸡胚的颈部，小心取出鸡胚，放于无菌培养皿中，除去头部、四肢、内脏和皮肤。
2)胚体用Hanks液或生理盐水清洗3次，切成1－2 mm3的小块，然后转移到容积适中的三角瓶或15ml血清瓶内。
3)加入适量消化液，一般每10个鸡胚加20 m1消化液，用胶塞密封瓶口。
4)在振荡水浴箱上37℃慢速搅拌5－10 min。
加入少量血清钝化胰蛋白酶。
然后通过100目不锈钢筛网，制备细胞悬液，将细胞悬液转移到离心管中。
5)离心（800 rpm，10 min），弃上清液，将细胞沉淀用培养液洗2次。
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用4层脱脂纱布将吹打后的细胞过滤到平皿中，收集滤液。
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实验步骤
（四）细胞形态观察 检查时注意培养液的颜色变化，变黄但不混浊表示有细胞
生长，变红表示细胞未生长或生长不佳。37℃培养24-48h后， 于倒置显微镜下观察，细胞可以长成单层，细胞透亮，呈纤维 状，细胞膜清晰。
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实验步骤
五、注意事项
1、整个过程严格无菌操作
将剪碎的组织块放入锥形瓶中，加入适量的胰酶。包紧瓶 口，37℃水域消化30min，每隔5min轻轻摇动1次。当组织块 变得蓬松透明时，吸弃消化液，用PBS洗两遍，中止消化。如 再继续消化，可破坏细胞膜而不易贴壁生长，如果消化不够， 则细胞不易分散。
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实验步骤
（2）分散细胞 将消化好的细胞悬液从水浴锅中取出，弃去上层液体，加
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实验步骤
（3）胚体匀浆 用灭菌剪将胚体剪碎至1mm3小碎块。加入PBS（淹住
组织碎块即可），轻摇，静置1-2min，待组织块下沉，吸去 上层悬液。重复2-3次（以除去其中的红细胞），至上悬液不 混浊为止，移入灭菌的锥形瓶中，吸去PBS。
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实验步骤
2、分散细胞 （1）酶消化
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实验原理
病毒能在易感的组织或单层细胞内增殖，并可产生细胞病变，因此， 细胞培养是病毒学研究的重要手段，是进行病毒性疫苗生产和病毒性 疾病诊断必不可少的工具。原代细胞培养是体外制备细胞培养物的必 经过程，从供体体内取出组织分散成单个细胞接种于培养液中为初次 培养，从初次培养到第一次传代培养为原代培养。本实验以鸡胚成纤 维细胞作为原代细胞，通过细胞培养实践操作，认识和体会原代细胞 的制备方法和影响细胞培养的主要因素，并掌握原代细胞培养的方法。
鸡胚成纤维细胞的制备和培养
鸡胚成纤维细胞的制备
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实验目的
学习和掌握鸡胚成纤维细胞的制备和培养方法； 了解原代细胞培养的原理和方法。
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鸡胚成纤维细胞元代培养
CEF的培养是在一定条件下，在体外模拟体内生理环 境，使从体内取出的成纤维组织细胞生存、生长和传 代，并维持原有组织细胞的结构和功能特性。
2、培养液不要太多，应有足够的空间保证细胞对氧的需要
3、放入CO2培养箱培养时，将CO2浓度控制在5%。
4、吸除消化液，向瓶内注入PBS数毫升，轻轻转动培养瓶， 把残余消化液冲掉。注意冲洗细胞时，动作要轻，以免把已松 动的细胞冲掉流失，如用胰蛋白酶液单独消化，吸除胰酶液后， 可不用PBS冲洗，直接加入培养液。
5、细胞培养对玻璃器皿洗涤要求严格，彻底洗涤后用蒸馏水
冲洗，再用双蒸水冲洗，干燥 灭菌后备用。所有的溶液都要
用双蒸水配制，所用药品试剂用分析纯。
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液和胰蛋白酶液放入37℃水浴锅内预热；
2、用75%酒精棉擦拭双手和紫外线照射过的超净
工作台；
3、正确摆放要使用的器械：保证足够的操作空 间，不仅便于操作而且可减少污染；
4、点燃酒精灯. 5、准备好将要使用的消毒后的培养瓶。 6、取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球 擦拭好后方能放入超净台内。
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实验步骤
（二）鸡胚成纤维细胞的制备 1、鸡胚的处理 （1）蛋壳消毒
取9-11日龄的鸡胚，用检卵灯选取血管清楚、活动正常的 鸡胚，置蛋架上，令气室端向上，用碘酒棉消毒蛋壳气室部位。 （2）胚体采集
以镊子击破卵壳气室部位，并除去该部位卵壳。用无菌的 眼科镊子撕开蛋壳气室膜并小心拨开绒毛尿囊膜和羊膜，用弯 镊子夹住鸡胚颈部，移入灭菌的平皿内。用剪刀剪去胚头、四 肢及内脏，用PBS洗去体表血液，移入灭菌小烧杯中。
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实验所需器材、试剂
超净工作台，检卵灯，灭菌的细胞培养瓶、眼科剪、眼科镊、平皿、 吸管、离心管等；9-11日龄鸡胚；PBS，0.25%胰酶消化液，DMEM 营养液，75%酒精棉。
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实验步骤
（一）操作前的准备 1、预热培养液：把已经配制好的生长液、Hanks
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实验步骤
（三）分装与培养 1、细胞计数
用细胞计数器计数，根据计数结果，加入DMEM生长液， 调整细胞浓度至50万-60万个/ml。
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实验步骤
2、分装与培养 在培养瓶中加入2mLDMEM生长液(如果是50mL的培养
瓶，加4mL生长液)，小心吸出过滤后的细胞悬液0.25mL至培 养瓶中（如果是50mL的培养瓶，加0.5mL的细胞悬液)，吹打 均匀盖好瓶塞。在瓶上注明组别、日期，置37℃温箱中培养 (4h后细胞即可贴壁，24-36h生长成单层细胞，此时可更换培 养液，并接种病毒)。分装后2-4h不可大幅度移动培养瓶，以 免影响细胞的贴壁和生长。