鸡胚成纤维细胞制备PPT课件
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
5mL 含 血 清 的 DMEM 生 长 液 （ DMEM 营 养 液 +5% 犊 牛 血 清 +100IU/ml青链霉素，用7.5%NaHCO3溶液调pH7.2），以 吸管反复吹吸数次，使细胞分散，此时可见生长液混浊，即为 细胞悬液。静置1min后，使未冲散的组织块下沉。 （3）过滤
用4层脱脂纱布将吹打后的细胞过滤到平皿中，收集滤液。
2020/7/13
.
13
实验步骤
（四）细胞形态观察 检查时注意培养液的颜色变化，变黄但不混浊表示有细胞
生长，变红表示细胞未生长或生长不佳。37℃培养24-48h后， 于倒置显微镜下观察，细胞可以长成单层，细胞透亮，呈纤维 状，细胞膜清晰。
2020/7/13
.
14
实验步骤
五、注意事项
1、整个过程严格无菌操作
将剪碎的组织块放入锥形瓶中，加入适量的胰酶。包紧瓶 口，37℃水域消化30min，每隔5min轻轻摇动1次。当组织块 变得蓬松透明时，吸弃消化液，用PBS洗两遍，中止消化。如 再继续消化，可破坏细胞膜而不易贴壁生长，如果消化不够， 则细胞不易分散。
2020/7/13
.
10
实验步骤
（2）分散细胞 将消化好的细胞悬液从水浴锅中取出，弃去上层液体，加
2020/7/13
.
7
实验步骤
（3）胚体匀浆 用灭菌剪将胚体剪碎至1mm3小碎块。加入PBS（淹住
组织碎块即可），轻摇，静置1-2min，待组织块下沉，吸去 上层悬液。重复2-3次（以除去其中的红细胞），至上悬液不 混浊为止，移入灭菌的锥形瓶中，吸去PBS。
2020/7/13
.
8
.
9
实验步骤
2、分散细胞 （1）酶消化
2020/7/13
.
3
实验原理
病毒能在易感的组织或单层细胞内增殖，并可产生细胞病变，因此， 细胞培养是病毒学研究的重要手段，是进行病毒性疫苗生产和病毒性 疾病诊断必不可少的工具。原代细胞培养是体外制备细胞培养物的必 经过程，从供体体内取出组织分散成单个细胞接种于培养液中为初次 培养，从初次培养到第一次传代培养为原代培养。本实验以鸡胚成纤 维细胞作为原代细胞，通过细胞培养实践操作，认识和体会原代细胞 的制备方法和影响细胞培养的主要因素，并掌握原代细胞培养的方法。
鸡胚成纤维细胞的制备和培养
鸡胚成纤维细胞的制备
.
1
实验目的
学习和掌握鸡胚成纤维细胞的制备和培养方法； 了解原代细胞培养的原理和方法。
2020/7/13
.
2
鸡胚成纤维细胞元代培养
CEF的培养是在一定条件下，在体外模拟体内生理环 境，使从体内取出的成纤维组织细胞生存、生长和传 代，并维持原有组织细胞的结构和功能特性。
2、培养液不要太多，应有足够的空间保证细胞对氧的需要
3、放入CO2培养箱培养时，将CO2浓度控制在5%。
4、吸除消化液，向瓶内注入PBS数毫升，轻轻转动培养瓶， 把残余消化液冲掉。注意冲洗细胞时，动作要轻，以免把已松 动的细胞冲掉流失，如用胰蛋白酶液单独消化，吸除胰酶液后， 可不用PBS冲洗，直接加入培养液。
5、细胞培养对玻璃器皿洗涤要求严格，彻底洗涤后用蒸馏水
冲洗，再用双蒸水冲洗，干燥 灭菌后备用。所有的溶液都要
用双蒸水配制，所用药品试剂用分析纯。
2020/7/13
.
15
@your name
2020/7/13
.
16
液和胰蛋白酶液放入37℃水浴锅内预热；
2、用75%酒精棉擦拭双手和紫外线照射过的超净
工作台；
3、正确摆放要使用的器械：保证足够的操作空 间，不仅便于操作而且可减少污染；
4、点燃酒精灯. 5、准备好将要使用的消毒后的培养瓶。 6、取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球 擦拭好后方能放入超净台内。
2020/7/13
.
6
实验步骤
（二）鸡胚成纤维细胞的制备 1、鸡胚的处理 （1）蛋壳消毒
取9-11日龄的鸡胚，用检卵灯选取血管清楚、活动正常的 鸡胚，置蛋架上，令气室端向上，用碘酒棉消毒蛋壳气室部位。 （2）胚体采集
以镊子击破卵壳气室部位，并除去该部位卵壳。用无菌的 眼科镊子撕开蛋壳气室膜并小心拨开绒毛尿囊膜和羊膜，用弯 镊子夹住鸡胚颈部，移入灭菌的平皿内。用剪刀剪去胚头、四 肢及内脏，用PBS洗去体表血液，移入灭菌小烧杯中。
2020/7/13
.
4
实验所需器材、试剂
超净工作台，检卵灯，灭菌的细胞培养瓶、眼科剪、眼科镊、平皿、 吸管、离心管等；9-11日龄鸡胚；PBS，0.25%胰酶消化液，DMEM 营养液，75%酒精棉。
2020/7/13
.
5
实验步骤
（一）操作前的准备 1、预热培养液：把已经配制好的生长液、Hanks
2020/7/13
.
11
实验步骤
（三）分装与培养 1、细胞计数
用细胞计数器计数，根据计数结果，加入DMEM生长液， 调整细胞浓度至50万-60万个/ml。
2020/7/13
.
12
实验步骤
2、分装与培养 在培养瓶中加入2mLDMEM生长液(如果是50mL的培养
瓶，加4mL生长液)，小心吸出过滤后的细胞悬液0.25mL至培 养瓶中（如果是50mL的培养瓶，加0.5mL的细胞悬液)，吹打 均匀盖好瓶塞。在瓶上注明组别、日期，置37℃温箱中培养 (4h后细胞即可贴壁，24-36h生长成单层细胞，此时可更换培 养液，并接种病毒)。分装后2-4h不可大幅度移动培养瓶，以 免影响细胞的贴壁和生长。
用4层脱脂纱布将吹打后的细胞过滤到平皿中，收集滤液。
2020/7/13
.
13
实验步骤
（四）细胞形态观察 检查时注意培养液的颜色变化，变黄但不混浊表示有细胞
生长，变红表示细胞未生长或生长不佳。37℃培养24-48h后， 于倒置显微镜下观察，细胞可以长成单层，细胞透亮，呈纤维 状，细胞膜清晰。
2020/7/13
.
14
实验步骤
五、注意事项
1、整个过程严格无菌操作
将剪碎的组织块放入锥形瓶中，加入适量的胰酶。包紧瓶 口，37℃水域消化30min，每隔5min轻轻摇动1次。当组织块 变得蓬松透明时，吸弃消化液，用PBS洗两遍，中止消化。如 再继续消化，可破坏细胞膜而不易贴壁生长，如果消化不够， 则细胞不易分散。
2020/7/13
.
10
实验步骤
（2）分散细胞 将消化好的细胞悬液从水浴锅中取出，弃去上层液体，加
2020/7/13
.
7
实验步骤
（3）胚体匀浆 用灭菌剪将胚体剪碎至1mm3小碎块。加入PBS（淹住
组织碎块即可），轻摇，静置1-2min，待组织块下沉，吸去 上层悬液。重复2-3次（以除去其中的红细胞），至上悬液不 混浊为止，移入灭菌的锥形瓶中，吸去PBS。
2020/7/13
.
8
.
9
实验步骤
2、分散细胞 （1）酶消化
2020/7/13
.
3
实验原理
病毒能在易感的组织或单层细胞内增殖，并可产生细胞病变，因此， 细胞培养是病毒学研究的重要手段，是进行病毒性疫苗生产和病毒性 疾病诊断必不可少的工具。原代细胞培养是体外制备细胞培养物的必 经过程，从供体体内取出组织分散成单个细胞接种于培养液中为初次 培养，从初次培养到第一次传代培养为原代培养。本实验以鸡胚成纤 维细胞作为原代细胞，通过细胞培养实践操作，认识和体会原代细胞 的制备方法和影响细胞培养的主要因素，并掌握原代细胞培养的方法。
鸡胚成纤维细胞的制备和培养
鸡胚成纤维细胞的制备
.
1
实验目的
学习和掌握鸡胚成纤维细胞的制备和培养方法； 了解原代细胞培养的原理和方法。
2020/7/13
.
2
鸡胚成纤维细胞元代培养
CEF的培养是在一定条件下，在体外模拟体内生理环 境，使从体内取出的成纤维组织细胞生存、生长和传 代，并维持原有组织细胞的结构和功能特性。
2、培养液不要太多，应有足够的空间保证细胞对氧的需要
3、放入CO2培养箱培养时，将CO2浓度控制在5%。
4、吸除消化液，向瓶内注入PBS数毫升，轻轻转动培养瓶， 把残余消化液冲掉。注意冲洗细胞时，动作要轻，以免把已松 动的细胞冲掉流失，如用胰蛋白酶液单独消化，吸除胰酶液后， 可不用PBS冲洗，直接加入培养液。
5、细胞培养对玻璃器皿洗涤要求严格，彻底洗涤后用蒸馏水
冲洗，再用双蒸水冲洗，干燥 灭菌后备用。所有的溶液都要
用双蒸水配制，所用药品试剂用分析纯。
2020/7/13
.
15
@your name
2020/7/13
.
16
液和胰蛋白酶液放入37℃水浴锅内预热；
2、用75%酒精棉擦拭双手和紫外线照射过的超净
工作台；
3、正确摆放要使用的器械：保证足够的操作空 间，不仅便于操作而且可减少污染；
4、点燃酒精灯. 5、准备好将要使用的消毒后的培养瓶。 6、取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球 擦拭好后方能放入超净台内。
2020/7/13
.
6
实验步骤
（二）鸡胚成纤维细胞的制备 1、鸡胚的处理 （1）蛋壳消毒
取9-11日龄的鸡胚，用检卵灯选取血管清楚、活动正常的 鸡胚，置蛋架上，令气室端向上，用碘酒棉消毒蛋壳气室部位。 （2）胚体采集
以镊子击破卵壳气室部位，并除去该部位卵壳。用无菌的 眼科镊子撕开蛋壳气室膜并小心拨开绒毛尿囊膜和羊膜，用弯 镊子夹住鸡胚颈部，移入灭菌的平皿内。用剪刀剪去胚头、四 肢及内脏，用PBS洗去体表血液，移入灭菌小烧杯中。
2020/7/13
.
4
实验所需器材、试剂
超净工作台，检卵灯，灭菌的细胞培养瓶、眼科剪、眼科镊、平皿、 吸管、离心管等；9-11日龄鸡胚；PBS，0.25%胰酶消化液，DMEM 营养液，75%酒精棉。
2020/7/13
.
5
实验步骤
（一）操作前的准备 1、预热培养液：把已经配制好的生长液、Hanks
2020/7/13
.
11
实验步骤
（三）分装与培养 1、细胞计数
用细胞计数器计数，根据计数结果，加入DMEM生长液， 调整细胞浓度至50万-60万个/ml。
2020/7/13
.
12
实验步骤
2、分装与培养 在培养瓶中加入2mLDMEM生长液(如果是50mL的培养
瓶，加4mL生长液)，小心吸出过滤后的细胞悬液0.25mL至培 养瓶中（如果是50mL的培养瓶，加0.5mL的细胞悬液)，吹打 均匀盖好瓶塞。在瓶上注明组别、日期，置37℃温箱中培养 (4h后细胞即可贴壁，24-36h生长成单层细胞，此时可更换培 养液，并接种病毒)。分装后2-4h不可大幅度移动培养瓶，以 免影响细胞的贴壁和生长。