鸡胚成纤维细胞的原代培养

鸡胚成纤维细胞的原代培养
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生拔钱诗晨
一、背景知识
1.1原代培养与传代培养
1.1.1原代培养是指直接从生物体取材（细胞、组织或器官）进行的第一次培养（中途不分割培养物、不更换培养物的生长器皿）。

1.1.2传代细胞培养分割细胞培养物进行的再配养
注：细胞培养的代不是指细胞分裂次数，而是指培养的次数
1.2细胞体外培养要求的条件
✓无菌
✓适宜温度：哺乳动物细胞36.5℃ 0.5℃，植物细胞原生质体25℃左右
✓生理渗透压
✓适宜酸碱度：7.2-7.4
✓气体：95%空气+5%二氧化碳
✓培养基：提供水、各种有机营养（糖、氨基酸、维生素等）及无机盐、生长调节因子等1.3培养细胞生长类型
悬浮型：培养时不黏附于支持物之上。

而呈现悬浮生长的细胞。

贴壁型：培养时需要黏附于一定固相支持物表面才能很好生长的细胞。

又称黏附依赖型细胞（分如下四类）
✧成纤维细胞：胞体呈梭形或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射
状。

✧上皮型：细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。

✧游走型：呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规
则。

此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。

在一定条件下，如培养基化学性质变动等，它们也可能成纤维细胞形态。

✧多形型：是一些形态上不规则的细胞。

细胞一般分胞体和胞突两部分，胞体呈不规则多
边形，胞突呈细长丝状。

如神经元和神经胶质细胞
1.4原代细胞培养的一般办法
1.4.1植块培养法直接将组织块接入培养皿底部，待组织块贴牢在底部后再加入培养基培养的方法
1.4.2离散细胞培养法用酶消化组织，使细胞之间连接破坏，将组织离散成单细胞悬液进行培养的方法
注：原代培养中的植块培养法与组织培养不是一回事；植物组织培养又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织、器官或细胞、原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。

二、实验目的
●了解体外培养的原理及原代细胞培养的基本方法
●掌握无菌操作的一般技术
●学习观察体外培养细胞的形态及生长状况
三、实验原理
模仿体内生长环境，使来自机体的细胞、组织、器官能够在人工培养条件下生存、生长、繁殖。

四、实验材料、试剂及用品
4.1实验材料：7-12日龄鸡胚
注：幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养；分化程度低的组织比分化高的容易培养；肿瘤组织比正常组织容易培养。

4.2实验试剂
✓Hanks液
✓D-Hanks液
✓0.25%胰蛋白酶
✓M199基础培养液
✓小牛血清
✓青、链霉素
%5NaHCO
✓
3
✓2%碘酒
✓75%酒精
✓重铬酸钾洗液
4.3培养用主要仪器设备及用品
✓纯水设备
✓干燥消毒设备：电热干燥箱、高压蒸汽消毒锅、过滤器（真空式、针头式）及0.22μm 滤膜
✓超净工作台
CO培养箱
✓培养设施：普通培养箱、2
✓贮存设备：冰箱、液氮罐
✓观察设备：倒置相差显微镜
✓其他设备：天平、离心机、水浴锅等
✓用品：培养瓶皿、计数板、解剖器械等
五、实验操作
5.1培养前的准备工作
5.1.1用品清洗
玻璃用品：用重铬酸钾洗液浸泡24h以上，再用自来水、去离子水冲洗
金属、乳胶、塑料用品：不可用重铬酸钾洗液浸泡
5.1.2用品包装及消毒
玻璃、金属用品：牛皮纸包裹或封口，干热180℃2h
乳胶、塑料用品：纸包裹或置于封闭容器（如不锈钢饭盒），高压蒸汽（湿热）121℃维持15~20min
5.1.3溶液配制与消毒
无生物活性、不易挥发或分解的溶液（如平衡盐）：高压蒸汽灭菌
有生物活性的溶液（如培养液、肝素钠、PHA、酶等）及易挥发的溶液（如碳酸氢钠等）：
过滤消毒。

M199完全培养液组成：M199基础培养液90%，小牛血清10%，青霉素100IU/ml，链霉素100μg/ml
5.1.4工作间及超净台消毒紫外线（2h以上）、消毒液。

5.1.5洗手和着装
5.1.6进入无菌室关闭紫外线，开启日光灯和鼓风机；转入消毒好的用品；手部及工作台面消毒；点燃酒精灯
5.2细胞培养操作
过滤培养液：每人20ml
消毒鸡胚：70%酒精
cm腿部肌肉及其他组织，分别放 取材：取出鸡胚，D-Hanks液清洗污液；剪取约0.33
入2个盛有D-Hanks液的青霉素瓶中。

洗涤组织：用D-Hanks液洗涤肌肉块1次
mm小块，再用D-Hanks液洗3次
分割组织：将组织块剪成约13
加酶消化：5~6倍体积（1mL）的0.25%胰蛋白酶液，37℃中消化25~30min。

终止消化：加入5mL完全培养液终止胰酶消化作用。

吹打离散细胞：用吸管吸打细胞液1~2min。

静置使未消化组织块下沉。

离心收集细胞。

1000r/min离心8min，弃上清液。

加培养液分装培养：加5mL完全培养液重悬，装于6cm培养皿或25mL细胞培养瓶中，放入37℃5%CO2培养箱。

六、注意事项
严格避免微生物污染。

用酶消化不能过度。

火焰消毒过的金属器械应待冷却后再挟取组织，以免造成组织烫伤；
吸取过营养液的用具应先用酒精棉球擦拭后再过火焰烧，以免焦化物对细胞产生毒性。

七、无菌操作细节
操作应在酒精灯火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼。

凡超净台外进行的操作器皿需封口；结束超净台外的操作后重新移入超净台的器皿应用酒精棉球擦拭外面消毒。

不能用手触摸已消毒器皿的工作部分。

尽量减少材料暴露的时间。

避免对着超净台讲话和随意走动。

开口的试剂瓶尽量保持倾斜放置。

打开的盖子口要朝下放于工作台上。

八、结果观察
8.1有无污染（细菌、真菌）
真菌污染：肉眼可看到真菌菌落漂浮于培养液中或附着在培养器皿表面；倒置显微镜下可看到各种形态的真菌菌丝。

细菌污染：肉眼可见培养液变浑浊、颜色可能变黄；相差显微镜下可观察到培养液中大量活动的细菌，甚至覆盖细胞。

支原体污染：肉眼及显微观察均不可见，需应用PCR法及免疫学方法等进行检测。

8.2培养基是否太酸或太碱（酚红在7.0左右时颜色为红色，偏酸时发黄，偏碱时发紫）。

8.3细胞形态及生长情况
细胞贴壁，单独或成片生长于培养瓶皿底部，形态多三角形或梭形、细条形。

如有大量细胞悬浮于培养液中未贴壁，说明消化过度导致大量细胞损伤死亡。

状态良好细胞：明亮、透明而饱满，轮廓不清。

状态不良细胞：形态不规则，轮廓增强、透明性降低，胞质中出现空泡、脂滴和其他颗粒状物质。

严重者细胞脱壁悬浮。

8.4培养温度和CO2浓度
【后续】细胞传代实验
1、清洗除培养液（主要去血清）及死亡细胞：用D-Hanks液，洗2次。

2、酶消化：6cm平皿，2~3mL胰酶消化液，桌面水平轻轻摆动数次，持续约0.5min；吸出酶液，另加2~3mL酶液，轻轻摆动数次，吸出大部分酶液，仅留约0.5mL；倒置显微镜监测消化情况，待细胞突起缩回、胞间间隙增大、细胞近乎缩成圆形时停止消化。

这个过程大概需要2~5min。

3、终止消化：加入4mL新鲜完全培养液。

4、收集细胞：转入10mL离心管中，1500r/min离心5min。

5、分割培养：按照1︰2或1︰3的比例分割培养物继续培养。

6、检测细胞活率。

结果分析：第一次原代培养未染菌，细胞生长良好，饱满密集；第二次传代染菌，估计是培养皿未消毒；然后就重做了
做一个洗涤前后的对照，发现未洗涤的溶液中有被台盼蓝染色的细胞，之后就几乎没有。

洗涤前洗涤后。