鸡胚成纤维细胞的原代培养
鸡胚细胞的原代培养
2.塑料篮子内：无菌袖套
操
1. 2. 3. 4. 5. 6.
作
照egg, 画气室线。 戴无菌袖套。点燃酒精灯，手部消毒。 台面消毒; 将egg置于蛋座（气室朝上），外表消毒。 中镊敲碎蛋壳，沿气室线剥开。 小镊撕内膜，挑出鸡胚→培养皿A中清洗。
标记气室示意图
操
• • • • • •
作
照egg, 画气室线。 戴无菌袖套。点燃酒精灯，手部消毒。 台面消毒; 将egg置于蛋座（气室朝上），外表消毒。 中镊敲碎蛋壳，沿气室线剥开。 小镊撕内膜，挑出鸡胚→培养皿A中用 Hank’s液清洗。
鉴定各种细胞产物的程序。
无血清培养液中补加物具有独特性：适用于某
种细胞株的培养液，很可能不适合另一种细胞 株的生长。即使同源组织的不同细胞株，所需 补加物也不同。
无血清培养基的目前使用情况：尚处于研究阶
段，难以推广。目前，绝大多数人工合成培养 基使用时还需添加血清
人间充质干细胞无血清培养基:上海依科赛公司 CHO无血清培养基：维森特公司 树突状细胞无血清培养基：达优公司
肺
肝
腿部 肌肉
肾脏
摘自 《细胞培养基本知识》-Invitrogen
注 意
清理台面,用品洗净,交回。酒பைடு நூலகம்灯和酒精棉球瓶要补 加酒精。 实验报告：这次的原代培养与细胞传代和冻存的实验 一起写一份细胞报告。 重点：要对实验结果进行分析和讨论。 实验考核：本次实验的实验结果记入一次实验课成绩 考核内容。无菌实验操作记入实验考核。
鸡胚细胞的原代培养
摘自 《细胞培养基本知识》-Invitrogen
细胞培养的用途
照片来自 《动物细胞培养-基本技术指南》
提
纲
1.培养基的类型及配制 2.原代培养的过程 3.原代培养的注意事项 4. 本次实验操作要点 5.实践操作
实验三、鸡胚细胞的原代培养
原代培养的概念
原代培养 （primary culture）：也叫初代 培养，指直接从体内取出的细胞、组织 和器官进行的第一次的培养。在首次传 代前的培养可认为是原代培养。原代培 养的细胞生长比较缓慢。
原代培养
• 优点：组织和细胞刚刚离体，生物性状尚未 发生很大变化，在一定程度上能反映体内状 态。在供体来源充分、生物学条件稳定的情 况下，采用原代培养做各种实验，如药物测 试、细胞分化等，效果很好。
• 2．操作前要洗手，进入超净工作台后手要 用75%酒精擦试，试剂瓶等也要擦试。
• 3. 凡在超净台外操作的步骤，各器皿需用 盖子或橡皮塞，以防止细菌落入。
• 4. 在超净台中，组织细胞、培养液等不能 暴露过久，以免溶液蒸发。
• 5. 点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐 热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧 灼时间不能太长，并冷却后才能夹取组织， 吸取过营养液的用具不能再烧灼，以免烧 焦形成碳膜。
• 二、 培养细胞的生长方式 • 1、贴附生长：必须贴附于支持
物表面才能生长。见于各种实体 瘤细胞 • 2、悬浮生长：于悬浮状态下即 可生长，不需要贴附于支持物表 面。各种造血系统肿瘤细胞
每代贴附生长细胞的生长过程
• 潜伏期 • 对数生长期 • 停止期（平台期）
• 游离期：
• 细胞接种后在培养液中呈悬浮 状态．也 称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆 球形。
• A.切取合适大小的组织块或者器官，在平 衡盐溶液或者培养液中洗涤，除去血污， 剔除脂肪、被膜结缔组织以及坏死的组 织。可滴加培养液或者平衡盐溶液来保 持湿润；
• B. 将组织块放置于盛有培养液的培养皿中， 剪碎，（接种），组织碎块和培养液一 起移到离心管中，吸去上清液；
C. 加入蛋白酶消化液，密封于37℃消化 ；
实验报告-细胞原代培养实验
细胞生物学实验报告实验三细胞原代培养1引言1.1 实验目的1. 理解细胞原代培养原理。
2. 了解细胞原代培养的应用。
3. 独立进行鼠胚和鸡胚细胞原代培养操作。
4. 巩固无菌操作技术。
1.2 实验原理细胞原代培养：原代培养组织直接从机体获取后，通过组织块长出单层细胞或者用酶消化或机械方法将组织分散成单个细胞开始培养，严格意义上的原代培养指在首次传代前的培养，但通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。
2实验仪器、试剂及操作步骤2.1 实验仪器超净工作台、倒置相差显微镜、CO2培养箱、酒精灯、酒精棉球、酒精喷壶、试管架、滴管筒（头）、废液缸、手术小直剪刀、眼科直镊子、眼科弯镊子、玻璃平皿、培养瓶等2.2 实验试剂DMEM培养基、D-Hanks缓冲液、血清、抗生素、胰蛋白酶消化液等2.3 实验材料动物：9至12日龄的鸡胚、15日龄的鼠胚2.4 实验步骤A.鸡胚成纤维细胞的原代培养1.实验室和超净工作台消毒，紫外照射20Min左右。
2.穿好实验服，进无菌室前穿鞋套、洗手。
3.关闭紫外灯，开日光灯和开风机，超净工作台台面应整洁，用75%酒精擦双手消毒，擦拭台面。
4.在D-Hanks缓冲液中按1：100的比例加入双抗。
5.取9-12日龄鸡胚，用照蛋器照检，画出气室边界和胎位。
将鸡胚置于鸡卵架上，用酒精棉球擦拭蛋壳。
6.用镊子在鸡蛋气室位置敲一道划痕，然后用镊子小心去除气室部位的蛋壳。
7.换用洁净的无菌镊子揭开膜，取出鸡胚至灭菌的培养皿中，用D-Hanks缓冲液冲洗鸡胚。
8.用眼科剪去除鸡胚的头部、四肢以及内脏，然后用D-Hanks缓冲液充分洗涤躯干。
9.将躯干置于小平皿盖中，用D-Hanks缓冲液至少洗涤3次，充分弃除红细胞。
10.用无菌眼科小剪刀将鸡胚躯干剪成1mm3的碎块。
在胚胎组织块中加入1mL的胎牛血清，用滴管吸取组织块接种到培养瓶内。
在培养瓶中放置10-15个组织块。
11.在培养瓶的另一侧面加入完全培养基，注意不要冲到组织块。
细胞原代培养细胞生物学实验报告
细胞生物学实验报告细胞原代培养姓名：学号：班级：专业：同组成员：一、实验原理细胞培养是生物学和医学研究中最常用的手段之一，可分为原代培养和传代培养两种。
原代培养是直接从生物体获取组织或器官的一部分进行培养。
由于培养的细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。
这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段。
同时也为以后传代培养创造条件。
原代培养的方法：1、组织块法在平皿中用弯头剪把组织尽量剪碎，每个组织块小于1mm3大小。
用Hanks 液洗涤2—3次，自然沉淀。
用吸管吸去上清液。
将组织块贴于培养瓶进行培养。
2、酶消化法将1mm3大小的组织块放入1个三角瓶内加入10—30ml的%的胰蛋白酶。
370C磁棒搅拌消化20－30分钟。
然后终止消化。
用几层无菌纱布过滤。
取过滤液，离心800rpm 5—10分钟收集细胞。
弃上清，加入带有双抗的培养基，放入培养瓶培养。
取材注意事项：取材要注意新鲜和保鲜。
取材应严格无菌。
取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。
要仔细去除所取材料上的血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织，切碎组织时应避免组织干燥，可在含少量培养液的器皿中进行。
取材应注意组织类型、分化程度、年龄等，一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。
二、实验目的1、理解细胞原代培养原理2、熟悉细胞原代培养方法与过程3、了解细胞原代培养的应用4、独立进行细胞原代培养操作三、实验材料手术小直剪刀、眼科直镊子、眼科弯镊子、玻璃平皿、培养瓶、试管、移液管、巴斯德吸管、废液缸、75%酒精棉球、酒精灯。
动物：9-12日龄的鸡胚蛋四、实验步骤1、购买9-12日龄鸡胚蛋。
放入孵化箱中孵养待用。
2、取鸡胚蛋一枚放入超净工作台中，用酒精棉球擦拭鸡蛋壳后，气室处擦拭两遍，用镊子小心去除气室部分的蛋壳。
细胞工程实验总结
实验一、细胞培养实验器材和试剂的准备1、哪些物品适合于高压灭菌，并说明理由。
①材料：微孔滤膜(直径25 cm)：孔径为0.22μm、微孔滤膜(直径90 cm)：孔径为0.22 μm、过滤器(直径25 cm)。
②仪器和器材：眼科剪刀和镊子、长镊子、培养皿、培养瓶、试剂瓶（或盐水瓶）、移液枪、10毫升试管、10毫升离心管、巴氏吸管、5毫升（或10毫升）吸量管、不锈钢过滤器、塑料过滤器、注射器、超净工作台、干燥箱、高压灭菌锅、正压泵。
理由：适合于高压灭菌是布类、橡胶制品(如胶塞)、金属器械、玻璃器皿、某些耐高温的塑料制品以及加热后不发生沉淀的无机溶液(如Hanks液、PBS等)。
2、细胞培养常用液体如何配制和灭菌？1）PBS ：8.0g NaCl、0.2gKCl、2.2gNa2HPO4、0.12gKH2PO4溶于1000 mL双蒸水，高压灭菌，4℃保存。
（准备试剂瓶）灭菌方法：高压灭菌。
2）干粉培养基过滤除菌（先准备好不锈钢过滤器及滤膜，安装后高压灭菌，适度烘干；铝盒4个，三角瓶2个，容量瓶，不锈钢过滤器一套，酒精灯，酒精棉球3瓶，吸耳球3个，吸量管10毫升和5毫升各5根，分装用瓶，血清，超纯水，抗生素）认真阅读说明书。
说明书都注明干粉不包含的成分，常见的有NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES等。
这些成分有些是必须添加的，如NaHCO3、谷氨酰胺，有些根据实验需要决定。
配制方法（1L）：1）在一个尽可能接近总体积的容器中加入大约500mL双蒸水。
2）在室温（20℃到30℃）的水中加入干粉培养基。
3）水洗袋内残留培养基，全部转移到容器内，轻轻搅拌，不要加热。
4）完全溶解之后，1袋1L粉状DMEM加3.7g NaHCO3，1mmoL∕L丙酮酸钠，即0.11g/L，添加双抗。
5）用双蒸水定容到1L，搅拌溶解。
注意不要过分搅拌。
6）通过缓慢搅拌加入1N NaOH 或1N HCL调节pH值培养基在过滤前要保持密封。
鸡胚成纤维细胞制备实验
42生物技术世界BIOTECHWORLD细胞培养是病毒学研究的重要手段,是进行病毒性疾病诊断必不可少的工具。
泛地应用于病毒的分离、鉴定,人工感染的细胞培养物制成的弱毒疫苗和灭活疫苗以及筛选异源和同源的弱毒株都离不开细胞的培养工作。
[1]病毒能在易感的组织和单层细胞内增殖,并可产生细胞病变。
成纤维细胞是结缔组织中最常见的细胞,由胚胎时期的间充质细胞分化而来。
鸡成纤维细胞具有相对容易获得、增值能力强、适应性强、良好的耐受性、性状较稳定等特点,所以被广泛的应于在病毒培养等领域。
鸡胚成纤维细胞培养可分为原代细胞培养、传代细胞培养。
原代细胞培养是体外制备细胞培养物的必经过程,自供体体内取出组织分散单个成单个细胞接种于培养液中为初次培养,从初次培养到第一次传代培养为原代细胞培养。
由组织刚刚分离出来的细胞能够分裂增殖,形成单层细胞。
[2]1 所需材料:鸡胚:9-10日龄SPF 鸡胚消化液:含0.25％胰蛋白酶(预先置于37℃温箱中);培养基:用DMEM培养基,含10%胎牛血清;洗液:pH7.2的PBS洗液;器具与物品:无菌剪刀、镊子、平皿、细胞培养瓶;带两层纱布的无菌烧杯,CO2培养箱、超净工作台、显微镜、高压灭菌锅、水浴箱、培养瓶、吸管、移液管、酒精灯、酒精棉等。
2 操作[3]2.1 操作前的准备(1)预热培养用液:把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。
(2)用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。
(3)正确摆放使用的器械:保证足够的操作空间,不仅便于操作而且可减少污染。
(4)点燃酒精灯:注意火焰不能太小。
(5)准备好将要使用的消毒后的培养瓶。
2.2 成纤维细胞制备(1)取9-11日龄的鸡胚。
先用75%的酒精喷淋整个鸡胚,消毒后置于超净工作台内先后用碘酒和酒精对气室及周边进行擦拭消毒。
用无菌剪刀、镊子打开蛋皮,取出鸡胚,放入灭菌好的平皿中,去除鸡头、鸡翅、鸡爪、内脏。
实验报告——精选推荐
实验报告细胞培养实验写报告内容1⽬的2 原理3材料与⽅法（操作步骤）4实验结果5结论或结果分析实验⼀鸡胚原代成纤维细胞的制备与培养实验⼆滤泡性⼝炎病毒（VSV）的增殖（纯培养）实验三 Hep-2细胞的传代培养实验四 VSV TCID50滴定实验五⼲扰素活性（效价）的测定实验六 VSV中和试验（稀释⾎清固定病毒法）实验⼆鸡胚原代成纤维细胞的制备与培养⼀、⽬的1、掌握鸡胚原代成纤维细胞的制备及培养的基本步骤；2、掌握活细胞的显微镜下观察；3熟悉病毒在细胞内增殖的基本判断⽅法。
⼆、原理离体动物组织通过温和的⼿段（机械和酶消化）形成单个细胞后，在适宜的外界环境中，包括温度、酸碱度和⽓相环境，并给予充⾜合适的营养条件，能⽣存、⽣长形成单层细胞，这种原代培养的细胞具有原来体内所具备的基本特性，⽐如肌⾁细胞的收缩功能；上⽪细胞的分泌功能等。
通常把这种从体内取出组织细胞开始培养到第⼀次进⾏传代之前的这⼀段时期称为原(初)代培养。
原代细胞最接近体内细胞的特性，因⽽对外界环境的变化也最敏感，因此⽐较适合病毒的增殖，药物的作⽤机制等的研究。
三、材料（按2⼈/组的量发放）四、操作步骤1、在DMEM和Hank’s 液中分别⽆菌操作以1％的量加⼊双抗，吸出10～15mlHank’s 液⾄⽆菌平⽫中备⽤；2、碘酒和酒精棉球分别拭擦鸡胚⽓室外卵壳；3、取出两只⽆菌平⽫，并标记①和②，待⽤。
4、⼤镊⼦轻敲卵壳顶部然后⼩⼼去掉⽓室外卵壳；5、消毒镊⼦后⼩⼼撕破卵膜，两⼈互相配合取出鸡胚置于盛有Hank’s 液的平⽫①中，⼩⼼去头、内脏、⽖和粘液及⾎球，洗涤后置于盛有Hank’s 液的平⽫②中，再充分洗涤；6、取出洗净的组织块置于⼤青霉素瓶中，在⽕焰附近⽤⽆菌眼科剪⼑将其剪成约0.5～1mm3的⼩块（约250次），此时体积约0.5ml；⽤Hank s’液洗涤两次。
7、按照10倍量加⼊0.25％胰蛋⽩酶，调节pH⾄约7.3～8.0（⾁眼观为⾁红⾊）盖上瓶塞，写好标记；8、将上述细胞瓶置于37℃⽔浴中，开始计时，约15～30min，其间缓慢摇匀以充分消化。
鸡胚成纤维细胞制备PPT课件
用4层脱脂纱布将吹打后的细胞过滤到平皿中，收集滤液。
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实验步骤
（四）细胞形态观察 检查时注意培养液的颜色变化，变黄但不混浊表示有细胞
生长，变红表示细胞未生长或生长不佳。37℃培养24-48h后， 于倒置显微镜下观察，细胞可以长成单层，细胞透亮，呈纤维 状，细胞膜清晰。
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实验步骤
五、注意事项
1、整个过程严格无菌操作
将剪碎的组织块放入锥形瓶中，加入适量的胰酶。包紧瓶 口，37℃水域消化30min，每隔5min轻轻摇动1次。当组织块 变得蓬松透明时，吸弃消化液，用PBS洗两遍，中止消化。如 再继续消化，可破坏细胞膜而不易贴壁生长，如果消化不够， 则细胞不易分散。
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实验步骤
（2）分散细胞 将消化好的细胞悬液从水浴锅中取出，弃去上层液体，加
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实验步骤
（3）胚体匀浆 用灭菌剪将胚体剪碎至1mm3小碎块。加入PBS（淹住
组织碎块即可），轻摇，静置1-2min，待组织块下沉，吸去 上层悬液。重复2-3次（以除去其中的红细胞），至上悬液不 混浊为止，移入灭菌的锥形瓶中，吸去PBS。
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实验步骤
2、分散细胞 （1）酶消化
鸡胚成纤维细胞制备优秀课件
间，不仅便于操作而且可减少污染； 4、点燃酒精灯. 5、准备好将要使用的消毒后的培养瓶。 6、取出预热好的培养用液：取出已经预热好的养用液，用酒精棉球 擦拭好后方能放入超净台内。
实验步骤
（二）鸡胚成纤维细胞的制备 1、鸡胚的处理 （1）蛋壳消毒
实验步骤
（3）胚体匀浆 用灭菌剪将胚体剪碎至1mm3小碎块。加入PBS（淹住
组织碎块即可），轻摇，静置1-2min，待组织块下沉，吸去上 层悬液。重复2-3次（以除去其中的红细胞），至上悬液不混 浊为止，移入灭菌的锥形瓶中，吸去PBS。
实验步骤
2、分散细胞 （1）胰酶消化
将剪碎的组织块放入锥形瓶中，加入适量的胰酶。包 紧瓶口，37℃水域消化30min，每隔5min轻轻摇动1次。当组织 块变得蓬松透明时，吸弃消化液，用PBS洗两遍，中止消化。 如再继续消化，可破坏细胞膜而不易贴壁生长，如果消化不够， 则细胞不易分散。
实验步骤
（四）细胞形态观察 检查时注意培养液的颜色变化，变黄但不混浊表示有
细胞生长，变红表示细胞未生长或生长不佳。37℃培养24-48h 后，于倒置显微镜下观察，细胞可以长成单层，细胞透亮，呈 纤维状，细胞膜清晰。
实验步骤
五、注意事项 1、整个过程严格无菌操作 2、培养液不要太多，应有足够的空间保证细胞对氧的需要 3、放入CO2培养箱培养时，将CO2浓度控制在5%。 4、吸除消化液，向瓶内注入PBS数毫升，轻轻转动培养瓶，把 残余消化液冲掉。注意冲洗细胞时，动作要轻，以免把已松动 的细胞冲掉流失，如用胰蛋白酶液单独消化，吸除胰酶液后， 可不用PBS冲洗，直接加入培养液。 5、细胞培养对玻璃器皿洗涤要求严格，彻底洗涤后用蒸馏水 冲洗，再用双蒸水冲洗，干燥 灭菌后备用。所有的溶液都要 用双蒸水配制，所用药品试剂用分析纯。
鸡胚原代细胞培养
鸡胚原代细胞培养细胞是一微小而完整的生命单位，它组成各种生物体并生长、繁殖。
在生命体外，如果提供类似生物体内的环境条件，细胞也能生长繁殖。
要使每个细胞都能从人造环境中获得营养物质，必须将组织块分散成单个细胞。
组织培养法是目前培养病毒应用最广的一种方法，其优点是：一般没有隐性感染，没有免疫抵抗力，便于选择易感细胞，实验条件易于控制，成本便宜，经济适用。
组织培养法多应用于病毒的分离、鉴定、病毒感染细胞的机制、生产疫苗和抗原等。
很多组织，包括鸡胚，各种动物的肾脏组织，人胎羊膜细胞或流产胎儿组织等均可作组织培养的来源。
细胞来源的选择，主要是根据细胞对病毒的敏感性而定。
组织培养的方法中以单层细胞培养是最常用的方法，它又有原代和次代细胞培养、二倍体细胞株和传代细胞系三种类型。
原代培养是指将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖的过程。
本试验介绍原代细胞的鸡胚成纤维细胞培养方法。
（一）实验目的了解单层细胞培养方法（二）实验材料1、10日龄鸡胚。
2、1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank’s液，碘酒。
3、无菌组织培养瓶、吸管、滴管、剪子、镊子、超净工作台、CO2培养箱、蒸水器、纯水器（生物级）、滤器、真空泵、高压灭菌锅、培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃）。
（三）实验方法1、用碘酒消毒鸡卵气室端外壳，并将鸡胚直立于卵架上。
以镊子将小鸡取出放在无菌培养皿内，去头，爪、内脏和骨骼，用Hanks氏溶液洗2-3次。
2、用小剪在小烧瓶内将鸡胚剪成小块（1～２mm3），加Hankr氏溶液（约１０ml）冲洗2-3次，静置１～２分钟，用毛细吸管吸去液体，依同法再洗涤２次，将血球充分洗去。
３、用镊子将组织块放入无菌三角烧瓶内，加入１０～１５ml0.25液，37?水溶浴20分钟，中间摇动几次，由于胰酶的作用可使大量的细胞游离，液体变混，经四层纱布过滤后的细胞悬液，低速离心沉淀（1000转/分钟以内），5分钟，吸上去清液，再用Hanks氏溶液洗一次，沉淀物加入适量营养液，用白细胞计数的方法进行计数，使成每毫升含50～８０万细胞的细胞悬液。
实验八、鸡胚细胞的原代培养-上课用
用品器材
1. 超净工作台内：
污物缸1个、酒精灯2个、酒精棉球2瓶、酒精喷壶1 瓶、大镊子2把、打火机1个、1mL移液器2把，1mL 枪头2盒、PBS 50mL(50mL离心管) 、 DMEM 15mL1 管(50mL离心管，2组共用)；
2. 眼科手术剪及镊子各1把，烧杯1个，带有纱布的 50mL锥形瓶1个。培养皿1个，一次性平皿2个，吸管 3根，吸耳球1个。
位置上降解蛋白，使细胞间结合处蛋白降解， 这时细胞由于自身内部细胞骨架的张力作用而 成为球形，从而使细胞分开。在pH为8.0、温 度为37℃时，胰酶溶液的作用能力最强。
注意：胰酶本身就是消化蛋白的，而细胞膜 又富含各种膜蛋白，消化过度会对细胞造成损 伤。
本次实验内容
原代培养的过程
取材——培养材料的制备 ——消化过滤——加培养
➢ 优点: 标准化生产，组分和含量相对固定，成本低 。 ➢ 缺点细胞生存，要想使细 胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基(如血 清)。
抗生素的使用
➢抗生素的作用：在培养液配制后，培养液 内常加适量抗生素，以抑制可能存在的细 菌的生长。
鸡胚成纤维细胞具有相对容易获得、 增殖能力强、适应性强、良好的耐受性、 性状比较稳定等特点,使得其被广泛地应 用于分子和细胞生物学研究的许多方面。
提纲
1.关于原代培养的概念 2.培养基的类型及配制 3.原代培养的过程 4.原代培养的注意事项 5.本次实验操作要点 6 .实践操作.
原代培养的概念
原代培养也称初代培养，严格的说即从体 内取出组织接种培养到第一次传代阶段，但实 际上，通常把第一代至第十代以内的培养细胞 统称为原代细胞培养。原代培养的细胞叫做细 胞株。一般持续1-4周。此期细胞呈活跃的移动， 可见细胞分裂，但不旺盛。原代培养细胞与体 内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。
鸡胚成纤维细胞制备
用4层脱脂纱布将吹打后的细胞过滤到平皿中,收集滤 液.
病毒能在易感的组织或单层细胞内增殖,并可产生细胞病变,因此,细胞 培养是病毒学研究的重要手段,是进行病毒性疫苗生产和病毒性疾病诊 断必不可少的工具.原代细胞培养是体外制备细胞培养物的必经过程,从 供体体内取出组织分散成单个细胞接种于培养液中为初次培养,从初次 培养到第一次传代培养为原代培养.本实验以鸡胚成纤维细胞作为原代 细胞,通过细胞培养实践操作,认识和体会原代细胞的制备方法和影响细 胞培养的主要因素,并掌握原代细胞培养的方法.
以镊子击破卵壳气室部位,并除去该部位卵壳.用无菌的眼科 镊子撕开蛋壳气室膜并小心拨开绒毛尿囊膜和羊膜,用弯镊子夹 住鸡胚颈部,移入灭菌的平皿内.用剪刀剪去胚头、四肢及内脏, 用PBS洗去体表血液,移入灭菌小烧杯中.
实验步骤
〔3胚体匀浆 Байду номын сангаас灭菌剪将胚体剪碎至1mm3小碎块.加入PBS〔淹住
组织碎块即可,轻摇,静置1-2min,待组织块下沉,吸去上层悬液. 重复2-3次〔以除去其中的红细胞,至上悬液不混浊为止,移入 灭菌的锥形瓶中,吸去PBS.
实验步骤
〔四细胞形态观察 检查时注意培养液的颜色变化,变黄但不混浊表示有细
胞生长,变红表示细胞未生长或生长不佳.37℃培养24-48h后, 于倒置显微镜下观察,细胞可以长成单层,细胞透亮,呈纤维状, 细胞膜清晰.
实验步骤
五、注意事项 1、整个过程严格无菌操作 2、培养液不要太多,应有足够的空间保证细胞对氧的需要 3、放入CO2培养箱培养时,将CO2浓度控制在5%. 4、吸除消化液,向瓶内注入PBS数毫升,轻轻转动培养瓶,把残 余消化液冲掉.注意冲洗细胞时,动作要轻,以免把已松动的细 胞冲掉流失,如用胰蛋白酶液单独消化,吸除胰酶液后,可不用 PBS冲洗,直接加入培养液. 5、细胞培养对玻璃器皿洗涤要求严格,彻底洗涤后用蒸馏水冲 洗,再用双蒸水冲洗,干燥 灭菌后备用.所有的溶液都要用双 蒸水配制,所用药品试剂用分析纯.
实验一-鸡胚成纤维细胞的培养
02
实验过程中，细胞形态和生长曲线的变化符合预期，表明实验
操作和Байду номын сангаас件控制得当。
传代培养后细胞稳定增殖，表明所使用的培养基和条件能够支
03
持鸡胚成纤维细胞的正常生长。
对实验的改进和展望
在未来的实验中，可以尝试优化培养基的成分，以提高细胞的生长速度和活性。
可以进一步研究不同条件对鸡胚成纤维细胞生长和功能的影响，如温度、pH、气体 环境等。
了解细胞培养的基本原理和操作流程
掌握细胞生长和增殖 的基本原理，了解细 胞周期和细胞分裂的 过程。
了解细胞培养过程中 的注意事项和安全措 施。
熟悉细胞培养的基本 流程，包括原代细胞 的培养和传代细胞的 继代培养。
学习细胞培养的实验设计和数据分析方法
01 学习如何设计细胞培养的实验方案，确定实验参 数和对照组设置。
实验一-鸡胚成纤维 细胞的培养
目 录
• 实验目的 • 实验原理 • 实验步骤 • 结果分析 • 实验结论
01
CATALOGUE
实验目的
掌握鸡胚成纤维细胞的培养技术
01
掌握细胞培养的基本操作，如细胞分离、传代、计 数等。
02
熟悉细胞培养所需的仪器和试剂，如显微镜、细胞 培养皿、胰蛋白酶等。
03
了解细胞培养的环境条件，如温度、湿度、气体等 。
细胞形态的观察结果分析
总结词
观察鸡胚成纤维细胞的形态变化，分析 细胞形态与细胞功能的关系。
VS
详细描述
在实验过程中，通过显微镜观察鸡胚成纤 维细胞的形态变化，记录细胞的形态特征 。通过对比不同培养时间的细胞形态，可 以分析细胞形态与细胞功能的关系，进一 步了解细胞的生理状态和变化规律。
《动物细胞工程学》实验课教学大纲
《动物细胞工程学》实验课程教学大纲实验名称：动物细胞工程学实验课程编码：0141014学时：32学分：2适用专业：生物工程执笔人：唐业刚审订人：郭云贵一、课程的性质与任务动物细胞培养技术是动物胚胎工程技术的基础和核心技术，开设该门实验课的最大任务和任务就是让学生掌握动物细胞培养技术的原理和基本方法，锻炼学生的专业素养。
应此，在教学过程中应着重培养和锻炼学生自己寻找感兴趣的小课题并能运用理论和实验操作知识独立进行实验设计、实验可行性等这种提出问题、分析问题和解决问题的能力。
二、教学目标与基本要求：了解动物细胞培养实验室的设计和基本设备。
理解动物细胞培养的实验原理和常用基本仪器设备的作用。
掌握常见大型仪器的使用方法和原代细胞培养、传代培养的流程和方法。
三、实验项目与类型：四、实验教学内容及学时分配：实验一、动物细胞一般培养过程教学录像观摩………………………………………（4学时）1.目的要求：了解动物细胞培养实验室组成、仪器及细胞培养的一般过程。
2.方法原理：通过观看教学录像，以及参观实验室，加深对动物细胞培养条件的理解；通过学习教学录像内容，认识到无菌操作技术在整个细胞培养实验中的重要作用。
3.掌握要点：熟悉动物细胞培养的总体流程；掌握实验所需的关键仪器设备的使用方法；认识到动物细胞培养比其他实验要求更高、更严。
4.实验内容：讲述动物细胞培养的发展历史。
观看录像，利用PPT多媒体教学手段观看细胞培养教学录像。
参观实验室的仪器设备及实验室设计，讲解仪器使用方法及实验室设计思路。
简要介绍该课程整体实验项目，课程考核方式及成绩评定办法等事宜说明。
实验二、实验室组成设计及实验容器具的洗涤、包扎和灭菌………………………（4学时）1.目的要求：掌握清洁液的配置方法；掌握动物细胞培养所用器皿的种类、作用及清洗灭菌方法；掌握滤器的使用方法2.方法原理：体外培养的动物细胞对微量有害物质十分敏感，了获得较好培养效果，对培养容器具的无害化处理是十分重要的。
鸡胚成纤维细胞的原代培养
鸡胚成纤维细胞的原代培养171850044生拔钱诗晨一、背景知识1.1原代培养与传代培养1.1.1原代培养是指直接从生物体取材（细胞、组织或器官）进行的第一次培养（中途不分割培养物、不更换培养物的生长器皿）。
1.1.2传代细胞培养分割细胞培养物进行的再配养注：细胞培养的代不是指细胞分裂次数，而是指培养的次数1.2细胞体外培养要求的条件✓无菌✓适宜温度：哺乳动物细胞36.5℃ 0.5℃，植物细胞原生质体25℃左右✓生理渗透压✓适宜酸碱度：7.2-7.4✓气体：95%空气+5%二氧化碳✓培养基：提供水、各种有机营养（糖、氨基酸、维生素等）及无机盐、生长调节因子等1.3培养细胞生长类型悬浮型：培养时不黏附于支持物之上。
而呈现悬浮生长的细胞。
贴壁型：培养时需要黏附于一定固相支持物表面才能很好生长的细胞。
又称黏附依赖型细胞（分如下四类）✧成纤维细胞：胞体呈梭形或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。
✧上皮型：细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。
✧游走型：呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。
此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。
在一定条件下，如培养基化学性质变动等，它们也可能成纤维细胞形态。
✧多形型：是一些形态上不规则的细胞。
细胞一般分胞体和胞突两部分，胞体呈不规则多边形，胞突呈细长丝状。
如神经元和神经胶质细胞1.4原代细胞培养的一般办法1.4.1植块培养法直接将组织块接入培养皿底部，待组织块贴牢在底部后再加入培养基培养的方法1.4.2离散细胞培养法用酶消化组织，使细胞之间连接破坏，将组织离散成单细胞悬液进行培养的方法注：原代培养中的植块培养法与组织培养不是一回事；植物组织培养又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织、器官或细胞、原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。
鸡胚成纤维细胞原代培养与纯化的初探
１． ． ６冰箱 ： ２ 阿里斯 顿。
１３ 主 要试 剂 ．
Ｐ Ｓ液 ； Ｍ Ｍ 培 养 基 ；． ％胰 蛋 白酶 ；． ％Ｅ — Ｂ Ｄ Ｅ Ｏ５ ２ ０ ２ Ｄ ０
Ｔ — ａ１０ Ｉ ｌ Ａ Ｎ ； Ｕ／ 的青 、 ０ ｍ 链霉素溶液 ； 灭活的血清 ； 双蒸水 ；
三蒸水 。
２ 实 验方 法
器中培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体 。美国 Ｅ ｄｔｎｅ ｎｏ ｏｉ公 ｒ
司用 中空 纤维 生物反应 器大规 模培养 动物 细胞生 产 出免 疫 球 蛋 白 Ｇ Ａ、 和尿激 酶 、人 生长激 素等 。美 国 Ｇ ｎｎ ｅ 、 Ｍ ｅｅｔ ｈ ｅ 公 司应 用 Ｓ ４ Ｖ ０为载体 ，将 乙型 肝炎 病毒 表 面抗 原 基 因插
１． ． ５倒置 显微镜 ： ２ 上海 照相机三 厂 。
维细胞在一定生理状态下所需的各种条件 。体外培养 的细 胞在培养条件下便于控制条件 ， 可以做一些非常精确 的细
胞生 物学研 究 ， 胚成纤 维细胞 的原代 培养 在分 子生物 学 ， 鸡
细胞学 ， 遗传学 ， 免疫学 ， 病毒学， 肿瘤学 ， 及细胞工程学等
２ １ 胚成纤 维细胞 的原代 培养 ．鸡 ２ １１取材 ．．
生成素 、单克隆抗体等产品。该技术经从使用转瓶（ｌｒ ｒｌ ｏｅ
ｂｔｅ 、ｅＣ ｂ 等 贴 壁 细 胞 培 养 ，发 展 为 生 物 反 应 器 ｏｌ Ｃｌ ｕ ｅ ｔ） ｌ
（ｉ ｅｅ ｒ进行大规模细胞培养 。由于动物细胞培养技术 Ｂｏ ａｔ ） ｒ ｏ
领域 口 ， 展成 为一 门重 要 的生物技 术 ， 得显 著成 就 ， ｌ 发 ４ 并取 因而 细胞培养 是探索 和指示 细胞生命 活动规 律 的一种 简便 易行 的实验技 术 。 随着 细胞 培养 的原理 与方法 日 完善 ， 臻 动物 细胞 大规 模培养 技术趋 于成熟 。 十数年来 ， 功生产 了包括 狂犬 近 已成 病疫苗 、 疫疫苗 、 口蹄 甲型肝炎 疫苗 、 乙型肝炎 疫苗 、 细胞 红
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鸡胚成纤维细胞的原代培养
171850044
生拔钱诗晨
一、背景知识
1.1原代培养与传代培养
1.1.1原代培养是指直接从生物体取材（细胞、组织或器官）进行的第一次培养（中途不分割培养物、不更换培养物的生长器皿）。
1.1.2传代细胞培养分割细胞培养物进行的再配养
注：细胞培养的代不是指细胞分裂次数，而是指培养的次数
1.2细胞体外培养要求的条件
✓无菌
✓适宜温度：哺乳动物细胞36.5℃ 0.5℃，植物细胞原生质体25℃左右
✓生理渗透压
✓适宜酸碱度：7.2-7.4
✓气体：95%空气+5%二氧化碳
✓培养基：提供水、各种有机营养（糖、氨基酸、维生素等）及无机盐、生长调节因子等1.3培养细胞生长类型
悬浮型：培养时不黏附于支持物之上。
而呈现悬浮生长的细胞。
贴壁型：培养时需要黏附于一定固相支持物表面才能很好生长的细胞。
又称黏附依赖型细胞（分如下四类）
✧成纤维细胞：胞体呈梭形或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射
状。
✧上皮型：细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。
✧游走型：呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规
则。
此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。
在一定条件下，如培养基化学性质变动等，它们也可能成纤维细胞形态。
✧多形型：是一些形态上不规则的细胞。
细胞一般分胞体和胞突两部分，胞体呈不规则多
边形，胞突呈细长丝状。
如神经元和神经胶质细胞
1.4原代细胞培养的一般办法
1.4.1植块培养法直接将组织块接入培养皿底部，待组织块贴牢在底部后再加入培养基培养的方法
1.4.2离散细胞培养法用酶消化组织，使细胞之间连接破坏，将组织离散成单细胞悬液进行培养的方法
注：原代培养中的植块培养法与组织培养不是一回事；植物组织培养又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织、器官或细胞、原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。
二、实验目的
●了解体外培养的原理及原代细胞培养的基本方法
●掌握无菌操作的一般技术
●学习观察体外培养细胞的形态及生长状况
三、实验原理
模仿体内生长环境，使来自机体的细胞、组织、器官能够在人工培养条件下生存、生长、繁殖。
四、实验材料、试剂及用品
4.1实验材料：7-12日龄鸡胚
注：幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养；分化程度低的组织比分化高的容易培养；肿瘤组织比正常组织容易培养。
4.2实验试剂
✓Hanks液
✓D-Hanks液
✓0.25%胰蛋白酶
✓M199基础培养液
✓小牛血清
✓青、链霉素
%5NaHCO
✓
3
✓2%碘酒
✓75%酒精
✓重铬酸钾洗液
4.3培养用主要仪器设备及用品
✓纯水设备
✓干燥消毒设备：电热干燥箱、高压蒸汽消毒锅、过滤器（真空式、针头式）及0.22μm 滤膜
✓超净工作台
CO培养箱
✓培养设施：普通培养箱、2
✓贮存设备：冰箱、液氮罐
✓观察设备：倒置相差显微镜
✓其他设备：天平、离心机、水浴锅等
✓用品：培养瓶皿、计数板、解剖器械等
五、实验操作
5.1培养前的准备工作
5.1.1用品清洗
玻璃用品：用重铬酸钾洗液浸泡24h以上，再用自来水、去离子水冲洗
金属、乳胶、塑料用品：不可用重铬酸钾洗液浸泡
5.1.2用品包装及消毒
玻璃、金属用品：牛皮纸包裹或封口，干热180℃2h
乳胶、塑料用品：纸包裹或置于封闭容器（如不锈钢饭盒），高压蒸汽（湿热）121℃维持15~20min
5.1.3溶液配制与消毒
无生物活性、不易挥发或分解的溶液（如平衡盐）：高压蒸汽灭菌
有生物活性的溶液（如培养液、肝素钠、PHA、酶等）及易挥发的溶液（如碳酸氢钠等）：
过滤消毒。
M199完全培养液组成：M199基础培养液90%，小牛血清10%，青霉素100IU/ml，链霉素100μg/ml
5.1.4工作间及超净台消毒紫外线（2h以上）、消毒液。
5.1.5洗手和着装
5.1.6进入无菌室关闭紫外线，开启日光灯和鼓风机；转入消毒好的用品；手部及工作台面消毒；点燃酒精灯
5.2细胞培养操作
过滤培养液：每人20ml
消毒鸡胚：70%酒精
cm腿部肌肉及其他组织，分别放 取材：取出鸡胚，D-Hanks液清洗污液；剪取约0.33
入2个盛有D-Hanks液的青霉素瓶中。
洗涤组织：用D-Hanks液洗涤肌肉块1次
mm小块，再用D-Hanks液洗3次
分割组织：将组织块剪成约13
加酶消化：5~6倍体积（1mL）的0.25%胰蛋白酶液，37℃中消化25~30min。
终止消化：加入5mL完全培养液终止胰酶消化作用。
吹打离散细胞：用吸管吸打细胞液1~2min。
静置使未消化组织块下沉。
离心收集细胞。
1000r/min离心8min，弃上清液。
加培养液分装培养：加5mL完全培养液重悬，装于6cm培养皿或25mL细胞培养瓶中，放入37℃5%CO2培养箱。
六、注意事项
严格避免微生物污染。
用酶消化不能过度。
火焰消毒过的金属器械应待冷却后再挟取组织，以免造成组织烫伤；
吸取过营养液的用具应先用酒精棉球擦拭后再过火焰烧，以免焦化物对细胞产生毒性。
七、无菌操作细节
操作应在酒精灯火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼。
凡超净台外进行的操作器皿需封口；结束超净台外的操作后重新移入超净台的器皿应用酒精棉球擦拭外面消毒。
不能用手触摸已消毒器皿的工作部分。
尽量减少材料暴露的时间。
避免对着超净台讲话和随意走动。
开口的试剂瓶尽量保持倾斜放置。
打开的盖子口要朝下放于工作台上。
八、结果观察
8.1有无污染（细菌、真菌）
真菌污染：肉眼可看到真菌菌落漂浮于培养液中或附着在培养器皿表面；倒置显微镜下可看到各种形态的真菌菌丝。
细菌污染：肉眼可见培养液变浑浊、颜色可能变黄；相差显微镜下可观察到培养液中大量活动的细菌，甚至覆盖细胞。
支原体污染：肉眼及显微观察均不可见，需应用PCR法及免疫学方法等进行检测。
8.2培养基是否太酸或太碱（酚红在7.0左右时颜色为红色，偏酸时发黄，偏碱时发紫）。
8.3细胞形态及生长情况
细胞贴壁，单独或成片生长于培养瓶皿底部，形态多三角形或梭形、细条形。
如有大量细胞悬浮于培养液中未贴壁，说明消化过度导致大量细胞损伤死亡。
状态良好细胞：明亮、透明而饱满，轮廓不清。
状态不良细胞：形态不规则，轮廓增强、透明性降低，胞质中出现空泡、脂滴和其他颗粒状物质。
严重者细胞脱壁悬浮。
8.4培养温度和CO2浓度
【后续】细胞传代实验
1、清洗除培养液（主要去血清）及死亡细胞：用D-Hanks液，洗2次。
2、酶消化：6cm平皿，2~3mL胰酶消化液，桌面水平轻轻摆动数次，持续约0.5min；吸出酶液，另加2~3mL酶液，轻轻摆动数次，吸出大部分酶液，仅留约0.5mL；倒置显微镜监测消化情况，待细胞突起缩回、胞间间隙增大、细胞近乎缩成圆形时停止消化。
这个过程大概需要2~5min。
3、终止消化：加入4mL新鲜完全培养液。
4、收集细胞：转入10mL离心管中，1500r/min离心5min。
5、分割培养：按照1︰2或1︰3的比例分割培养物继续培养。
6、检测细胞活率。
结果分析：第一次原代培养未染菌，细胞生长良好，饱满密集；第二次传代染菌，估计是培养皿未消毒；然后就重做了
做一个洗涤前后的对照，发现未洗涤的溶液中有被台盼蓝染色的细胞，之后就几乎没有。
洗涤前洗涤后。