鸡胚成纤维细胞制备ppt课件
鸡胚成纤维细胞(CEF)的制作及细胞培养
鸡胚成纤维细胞（CEF）的制作及细胞培养（一）CEF的制备1. 实验试剂1×DMEM（不含丙酮酸钠）、小牛血清、高压过的PBS、胰酶、双抗。
2. 实验设备和材料酒精灯、酒精喷壶、酒精棉、打火机、计时器、一次性手套废液缸、镊子、细胞瓶、50 mL试管架、50 mL离心管、1000ul 移液枪及枪头、100 uL移液枪及枪头、塑料吸管、一次性培养皿、SPF鸡胚（9-11日龄均可）将3把小镊子、1把剪刀、1个50 mL离心管、1个玻璃培养皿放入一个大号饭盒内；取一中号锥形瓶，瓶口由内到外分别盖上6层纱布、锡箔纸、报纸包好，高压30 min备用。
3. 实验步骤（1）将所用材料放入超净工作台（小牛血清及胰酶除外），紫外照射30 min。
（2）用镊子取出高压过的平皿、镊子，倒入PBS液；（3）酒精消毒气室处蛋壳，去除蛋壳，撕开壳膜、尿囊膜和羊膜，取出鸡胚，置于培养皿中用镊子去除头、四肢和内脏，并将胚体置于另一个培养皿中冲洗干净；（4）将胚体置于高压过的50 mL离心管内，略水平放置，用剪刀充分剪碎，越碎越好；（5）加入胰酶（5 mL/个），37℃水浴锅内消化5-8 min，待胚体呈绒毛状即可，吸除消化液；（6）加入30 mL含10%血清的DMEM，充分吹打，静置片刻，过滤至锥形瓶内；（7）重复第六步；（8）分装至培养瓶或将细胞按1.2×106 cells/well传到6孔板中，每孔 2 mL。
（二）细胞冻存（1）倒去细胞上清液，加入PBS洗去残留的培养基，洗两次。
（2）加入0.25%的胰酶，消化10-20 s后倒去。
（3）1瓶细胞加入1 mL培养基吹打均匀，吸入到离心管中。
（4）将细胞离心，1000 rpm，2-3 min。
（5）根据计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20% FBS+10% DMSO）重悬细胞，一般两瓶细胞冻存三管（FBS越高，细胞复苏时活力越大）。
DMSO一定要配成10%。
鸡胚成纤维细胞的制作及培养
鸡胚成纤维细胞培养1、准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。
开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。
2、布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。
3、选胚：取9-10日龄鸡胚，（注：鸡胚日龄越小，形成细胞活力越好，但产量较低）用新洁尔灭消毒蛋壳10分钟后放净化台。
用碘酒、酒精消毒蛋壳。
用镊子打开气室。
4、用另一套镊子将壳膜打开将鸡胚夹起去头、爪、眼，放灭菌生理盐水中。
5、把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。
6、剪切：用眼科剪把组织切成1~2毫米大小的块，以便于消化。
7、处理组织：将已剪碎的组织碎片倒入一个带玻璃珠的灭菌三角瓶中，其中加入0.25%的胰酶，10个胚约7ml，或加组织消化液，一个胚1ml（组织消化液以及胰酶的配置见微生物指导）结扎瓶口或塞以胶塞。
8、消化：将其置入37℃水浴箱中或用恒温水浴，消化中应不停摇动，如用电磁恒温搅拌器消化更好。
消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。
消化10－15分钟。
一般约12分钟。
视鸡胚日龄大小而定。
越小消化时间越短。
见组织松软即可。
一般不可消化时间太长否则容易导致细胞活力不足。
9、分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，加入0.5％的含5％犊牛血清双抗的的水解乳蛋白Hank，s液少许。
（制法见微生物试验实习指导），用力震摇，或用吸管吹打。
使细胞分散，脱落。
然后用纱布过滤或随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。
低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清（可以不离心吸掉上清），加入适量含有血清的培养液。
10、计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。
对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。
鸡胚成纤维细胞制备实验
42生物技术世界BIOTECHWORLD细胞培养是病毒学研究的重要手段,是进行病毒性疾病诊断必不可少的工具。
泛地应用于病毒的分离、鉴定,人工感染的细胞培养物制成的弱毒疫苗和灭活疫苗以及筛选异源和同源的弱毒株都离不开细胞的培养工作。
[1]病毒能在易感的组织和单层细胞内增殖,并可产生细胞病变。
成纤维细胞是结缔组织中最常见的细胞,由胚胎时期的间充质细胞分化而来。
鸡成纤维细胞具有相对容易获得、增值能力强、适应性强、良好的耐受性、性状较稳定等特点,所以被广泛的应于在病毒培养等领域。
鸡胚成纤维细胞培养可分为原代细胞培养、传代细胞培养。
原代细胞培养是体外制备细胞培养物的必经过程,自供体体内取出组织分散单个成单个细胞接种于培养液中为初次培养,从初次培养到第一次传代培养为原代细胞培养。
由组织刚刚分离出来的细胞能够分裂增殖,形成单层细胞。
[2]1 所需材料:鸡胚:9-10日龄SPF 鸡胚消化液:含0.25％胰蛋白酶(预先置于37℃温箱中);培养基:用DMEM培养基,含10%胎牛血清;洗液:pH7.2的PBS洗液;器具与物品:无菌剪刀、镊子、平皿、细胞培养瓶;带两层纱布的无菌烧杯,CO2培养箱、超净工作台、显微镜、高压灭菌锅、水浴箱、培养瓶、吸管、移液管、酒精灯、酒精棉等。
2 操作[3]2.1 操作前的准备(1)预热培养用液:把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。
(2)用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。
(3)正确摆放使用的器械:保证足够的操作空间,不仅便于操作而且可减少污染。
(4)点燃酒精灯:注意火焰不能太小。
(5)准备好将要使用的消毒后的培养瓶。
2.2 成纤维细胞制备(1)取9-11日龄的鸡胚。
先用75%的酒精喷淋整个鸡胚,消毒后置于超净工作台内先后用碘酒和酒精对气室及周边进行擦拭消毒。
用无菌剪刀、镊子打开蛋皮,取出鸡胚,放入灭菌好的平皿中,去除鸡头、鸡翅、鸡爪、内脏。
鸡胚成纤维细胞的制备
鸡胚成纤维细胞的制备一、材料和试剂1、鸡胚：9-10日龄发育良好的SPF胚2、试剂：0.25％胰酶，MEM培养基，新生牛血清，1万IU双抗，3%谷氨酰胺，7.5%碳酸氢钠3、仪器和器材：，带6-8层纱布的100ml烧杯两个，直径9cm的平皿两个，中号镊子四把，倒置显微镜，培养箱，50ml细胞培养瓶，10ml刻度吸管两根、5ml刻度吸管，250ml生理盐水瓶两个，无菌的细胞培养瓶，灭菌好的PBS，酒精棉球，废液缸等二、操作步骤1、操作前的准备：○1预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。
○2用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。
○3正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。
○4点燃酒精灯：注意火焰不能太小。
○5准备好将要使用的消毒后的培养瓶。
○6取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。
2、成纤维细胞制备：①将选好的9-10日龄的发育良好的SPF胚用5%的碘棉消毒蛋壳气室部位，再用酒精棉脱碘。
②无菌取出鸡胚，放入灭菌的玻璃皿内，用PH7.2的PBS冲洗一次，去头，四肢和内脏。
③再用PH7.2的PBS冲洗两次。
④用镊子捏成小块（2-3mm3）, 用PH7.2的PBS冲洗两次。
⑤鸡胚约加4ml0.25%胰酶溶液，38℃消化30min，期间15min轻摇一次。
⑥期间配制细胞培养液：培养基：MEM双抗：2%7.5% 碳酸氢钠：2%牛血清：6%3% 谷氨酰胺：1%⑦消化结束，弃掉胰酶消化液，用PH7.2的PBS冲洗两次，再用细胞生长液冲洗一次。
⑧加入适量的细胞生长液，用刻度吸管反复吹打（使细胞充分分散）。
⑨将细胞分散液倒入带6-8层纱布的100ml烧杯中（过滤之前先用少许细胞培养液润湿纱布），加入适量培养液（40ml/胚），过滤。
⑩重复步骤⑨的操作重虑一遍。
11计数，要求每1ml滤液中约含活细胞100万-150万个。
鸡胚成纤维细胞制备PPT课件
用4层脱脂纱布将吹打后的细胞过滤到平皿中，收集滤液。
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实验步骤
（四）细胞形态观察 检查时注意培养液的颜色变化，变黄但不混浊表示有细胞
生长，变红表示细胞未生长或生长不佳。37℃培养24-48h后， 于倒置显微镜下观察，细胞可以长成单层，细胞透亮，呈纤维 状，细胞膜清晰。
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实验步骤
五、注意事项
1、整个过程严格无菌操作
将剪碎的组织块放入锥形瓶中，加入适量的胰酶。包紧瓶 口，37℃水域消化30min，每隔5min轻轻摇动1次。当组织块 变得蓬松透明时，吸弃消化液，用PBS洗两遍，中止消化。如 再继续消化，可破坏细胞膜而不易贴壁生长，如果消化不够， 则细胞不易分散。
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实验步骤
（2）分散细胞 将消化好的细胞悬液从水浴锅中取出，弃去上层液体，加
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实验步骤
（3）胚体匀浆 用灭菌剪将胚体剪碎至1mm3小碎块。加入PBS（淹住
组织碎块即可），轻摇，静置1-2min，待组织块下沉，吸去 上层悬液。重复2-3次（以除去其中的红细胞），至上悬液不 混浊为止，移入灭菌的锥形瓶中，吸去PBS。
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实验步骤
2、分散细胞 （1）酶消化
鸡胚成纤维细胞制备
取孵化9-10日龄的鸡胚，碘酒→酒精消毒→取出鸡胚→放入盛有Hank’s液的灭菌平皿内→用Hank’s液洗三次→将鸡胚去内脏、爪、翅、头部→再用Hank’s液洗2次胚体→用镊子将胚体夹碎→将夹碎的胚体用镊子夹到培养瓶中→加0.25%胰酶消化液（2ml/胚或盖住沉淀为宜）→密封瓶口→37℃水浴消化10～20分钟（长毛刺时方可）。
将消化好的胚体取出→将胰酶液倒掉→再用Hank’s液冲洗3次，加入培养液→用吸管敲打（吹打）碎，→倒入带纱布的烧瓶内（16层纱布）→用培养液冲洗培养瓶→过滤到250ml瓶中→制成细胞悬液。
最后细胞稀释到80～110万个/ml,在细胞培养瓶中生长。
抗原进入机体后，除少数可以直接作用于淋巴细胞外，大多数抗原都要经过吞噬细胞的摄取和处理。
经过处理的抗原，可将其内部隐蔽的抗原决定簇暴露出来。
体液免疫：
吞噬细胞将抗原呈递给T细胞，再由T细胞呈递给B细胞——（感应阶段），再由B细胞产生记忆B细胞和效应B细胞（浆细胞），从而产生抗体——（反应阶段）。
抗体处理抗原——（效应阶段）
有的抗原可以直接刺激B细胞（后面程序一样）。
这种抗原呈递，多数是通过细胞表面的直接相互接触来完成的
细胞免疫：
T细胞产生记忆T细胞和效应T细胞——（感应阶段）。
效应T细胞将病毒的宿主细胞裂解，暴露出抗原——（反应阶段）。
然后由吞噬细胞将其消灭——（效应阶段）。
鸡胚成纤维细胞制备优秀课件
间，不仅便于操作而且可减少污染； 4、点燃酒精灯. 5、准备好将要使用的消毒后的培养瓶。 6、取出预热好的培养用液：取出已经预热好的养用液，用酒精棉球 擦拭好后方能放入超净台内。
实验步骤
（二）鸡胚成纤维细胞的制备 1、鸡胚的处理 （1）蛋壳消毒
实验步骤
（3）胚体匀浆 用灭菌剪将胚体剪碎至1mm3小碎块。加入PBS（淹住
组织碎块即可），轻摇，静置1-2min，待组织块下沉，吸去上 层悬液。重复2-3次（以除去其中的红细胞），至上悬液不混 浊为止，移入灭菌的锥形瓶中，吸去PBS。
实验步骤
2、分散细胞 （1）胰酶消化
将剪碎的组织块放入锥形瓶中，加入适量的胰酶。包 紧瓶口，37℃水域消化30min，每隔5min轻轻摇动1次。当组织 块变得蓬松透明时，吸弃消化液，用PBS洗两遍，中止消化。 如再继续消化，可破坏细胞膜而不易贴壁生长，如果消化不够， 则细胞不易分散。
实验步骤
（四）细胞形态观察 检查时注意培养液的颜色变化，变黄但不混浊表示有
细胞生长，变红表示细胞未生长或生长不佳。37℃培养24-48h 后，于倒置显微镜下观察，细胞可以长成单层，细胞透亮，呈 纤维状，细胞膜清晰。
实验步骤
五、注意事项 1、整个过程严格无菌操作 2、培养液不要太多，应有足够的空间保证细胞对氧的需要 3、放入CO2培养箱培养时，将CO2浓度控制在5%。 4、吸除消化液，向瓶内注入PBS数毫升，轻轻转动培养瓶，把 残余消化液冲掉。注意冲洗细胞时，动作要轻，以免把已松动 的细胞冲掉流失，如用胰蛋白酶液单独消化，吸除胰酶液后， 可不用PBS冲洗，直接加入培养液。 5、细胞培养对玻璃器皿洗涤要求严格，彻底洗涤后用蒸馏水 冲洗，再用双蒸水冲洗，干燥 灭菌后备用。所有的溶液都要 用双蒸水配制，所用药品试剂用分析纯。
实验一-鸡胚成纤维细胞的培养
02
实验过程中，细胞形态和生长曲线的变化符合预期，表明实验
操作和Байду номын сангаас件控制得当。
传代培养后细胞稳定增殖，表明所使用的培养基和条件能够支
03
持鸡胚成纤维细胞的正常生长。
对实验的改进和展望
在未来的实验中，可以尝试优化培养基的成分，以提高细胞的生长速度和活性。
可以进一步研究不同条件对鸡胚成纤维细胞生长和功能的影响，如温度、pH、气体 环境等。
了解细胞培养的基本原理和操作流程
掌握细胞生长和增殖 的基本原理，了解细 胞周期和细胞分裂的 过程。
了解细胞培养过程中 的注意事项和安全措 施。
熟悉细胞培养的基本 流程，包括原代细胞 的培养和传代细胞的 继代培养。
学习细胞培养的实验设计和数据分析方法
01 学习如何设计细胞培养的实验方案，确定实验参 数和对照组设置。
实验一-鸡胚成纤维 细胞的培养
目 录
• 实验目的 • 实验原理 • 实验步骤 • 结果分析 • 实验结论
01
CATALOGUE
实验目的
掌握鸡胚成纤维细胞的培养技术
01
掌握细胞培养的基本操作，如细胞分离、传代、计 数等。
02
熟悉细胞培养所需的仪器和试剂，如显微镜、细胞 培养皿、胰蛋白酶等。
03
了解细胞培养的环境条件，如温度、湿度、气体等 。
细胞形态的观察结果分析
总结词
观察鸡胚成纤维细胞的形态变化，分析 细胞形态与细胞功能的关系。
VS
详细描述
在实验过程中，通过显微镜观察鸡胚成纤 维细胞的形态变化，记录细胞的形态特征 。通过对比不同培养时间的细胞形态，可 以分析细胞形态与细胞功能的关系，进一 步了解细胞的生理状态和变化规律。
鸡胚成纤维细胞(CEF)制备
取9~11日龄SPF鸡胚，分别用碘酒和酒精棉由鸡胚中央向四周擦拭消毒，然后放入超净台，将有气室的部位朝上，小心地用无菌镊子磕破蛋壳，沿气室边缘夹掉蛋壳，注意不让蛋壳碎屑落入蛋内，换用新的无菌镊子揭开尿囊绒毛膜，再用弯头镊子深入胚内夹住鸡胚颈部取出，放入平皿中，将取出的鸡胚去脑、四肢、内脏，放入一小烧杯中，然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎，直到成1 mm3左右的小块，再用PBS清洗3遍，至组织块发白为止。
将剪碎的组织块移入另一小烧杯中，加入适量的（1ml左右）0.5%胰酶和9mlPBS，于37℃水浴中消化10min左右。
倒掉PBS和胰酶混合液然后加入生长液25ml终止消化，用枪头充分吹打成单个细胞。
再用8层灭菌纱布过滤，将过滤的得到的细胞悬浮液稀释10倍，使细胞终浓度达到50万个/ml，每个细胞瓶加入8ml。
放入CO2培养箱中，37℃培养24小时，直至细胞长成单层致密，及可以接毒。
鸡胚成纤维细胞的制作与培养 (2)
• 3.洗涤： • 取出三角瓶后静置1min，让组织块下沉后，吸去胰酶液，用3-5mL的
Hanks液反复清洗3次，吸去胰酶，吸干上清液，留组织块。
• 4.吹打： • 加2mL含血清DMEM培养液，以吸管反复吹吸数次，使细胞分散，此时
可见营养液混浊，即为细胞悬液。静置1min后，使未冲散的组织块下沉。
胞培养瓶中，轻轻均匀（注意不要溢到瓶盖）。盖好瓶塞，置37℃温箱 进行培养。在瓶上注明组别，日期，4h后细胞即可贴壁，24~36h生长 成单层细胞，此时可更换培养液，并接种病毒。
注意事项
• 细胞培养对玻璃器皿洗涤要求严格，彻底洗涤后用 蒸馏水冲洗3次，再用双蒸水冲洗3次，干燥后灭 菌备用。所有的溶液都要用双蒸水配制，所用药品 试剂要用分析纯试剂，严格要求无菌操作。
2.消化：
• 先将胰酶放在37℃温箱中预热。
• 将组织块移到三角瓶中，加入量约3~5倍的 0.25%胰酶（一个鸡胚约5mL胰酶），然后将 三角瓶放入水浴箱中消化约15-30min左右，每 隔5min轻轻摇动和观察一次，由于胰酶作用， 使细胞与细胞之间的氨基和羧基游离，待液体变 混而稍稠，此时再轻摇可见组织块悬浮在液体内 而不易下沉时或组织块棱角变模糊则需中止消化。 如再继续消化下去，可破坏细胞膜而不易贴壁生 长（细胞死悼），如果消化不够，则细胞不易分 散。
将组织块移到三角瓶中加入量约35倍的025胰酶一个鸡胚约5ml胰酶然后将三角瓶放入水浴箱中消化约1530min左右每隔5min轻轻摇动和观察一次由于胰酶作用使细胞与细胞之间的氨基和羧基游离待液体变混而稍稠此时再轻摇可见组织块悬浮在液体内而不易下沉时或组织块棱角变模糊则需中止消化
实验八
鸡胚成纤维细胞的制 作与培养
• 实验目的：了解原代细胞培养的原理，掌握鸡胚 成纤维细胞的体外培养方法。
实验一——鸡胚成纤维细胞的培养PPT课件
拔出瓶塞、塞上瓶塞时瓶口和塞子要灼烧；倾 倒液体前后都要灼烧瓶口，并且瓶口向下，低 于瓶底；倾倒液体时两瓶口之间不能接触。
瓶内是严格无菌的，所以要保证吸管不接触到 瓶口的外壁。若一旦接触，更换新的吸管。
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3
实验材料
预加10%FCS和双抗的1640培养液；消化液 (0.25%胰蛋白酶- 0.02%EDTA溶液)；DHanks平衡盐溶液；
灭菌培养皿、青瓶、细胞培养瓶各1个； 巴氏吸管若干支、纱布若干；眼科镊1把，剪
刀1把； 碘酒，75％酒精棉球；酒精灯1台；废液缸。
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实验设备
（1） 37℃-CO2培养箱 （2）倒置显微镜 （3）超净台
5.培养 于37℃-CO2温箱内培养。24-48h后可长成 单层细胞。
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实验结果
1、观察原代细胞的形态和生长状况；
2、如出现细胞培养液浑浊情况，请鉴别是否细 菌污染。
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注意事项
1. 切割组织块时务必要切成小块 2. 整个操作过程要严格保持无菌 3.严格控制胰酶消化时间 4. 放入孵箱前应在培养瓶表面标明细胞名称、日期 和组别 1 5. 实验用品放回原处，摆放整齐
2
无菌操作的一般要求
用75％酒精擦拭消毒双手。 超净台台面应整洁，用0.1％新洁尔灭擦净。 打开超净台的紫外灯照射台面30min左右。使用
超净台时，打开风机，点燃酒精灯。
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严格在酒精灯无菌范围之内操作。 使用巴氏吸管以及其他吸管时，取出后要手拿末端
安上橡皮头后，过酒精灯火焰略烧后插在无菌盐水 瓶或试管内。 操作时，严禁说话，尽量不用手直接拿无菌的物品， 如瓶塞等，而要用器械，如镊子等去拿。 不能用手接触瓶口、吸管口以及镊子和剪刀的头部。
鸡胚成纤维细胞的制备
鸡胚成纤维细胞的制备一、材料和试剂1、鸡胚：9-10日龄发育良好的SPF胚2、试剂：0.25％胰酶，MEM培养基，新生牛血清，1万IU双抗，3%谷氨酰胺，7.5%碳酸氢钠3、仪器和器材：，带6-8层纱布的100ml烧杯两个，直径9cm的平皿两个，中号镊子四把，倒置显微镜，培养箱，50ml细胞培养瓶，10ml刻度吸管两根、5ml刻度吸管，250ml生理盐水瓶两个，无菌的细胞培养瓶，灭菌好的PBS，酒精棉球，废液缸等二、操作步骤1、操作前的准备：○1预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。
○2用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。
○3正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。
○4点燃酒精灯：注意火焰不能太小。
○5准备好将要使用的消毒后的培养瓶。
○6取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。
2、成纤维细胞制备：①将选好的9-10日龄的发育良好的SPF胚用5%的碘棉消毒蛋壳气室部位，再用酒精棉脱碘。
②无菌取出鸡胚，放入灭菌的玻璃皿内，用PH7.2的PBS冲洗一次，去头，四肢和内脏。
③再用PH7.2的PBS冲洗两次。
④用镊子捏成小块（2-3mm3）, 用PH7.2的PBS冲洗两次。
⑤鸡胚约加4ml0.25%胰酶溶液，38℃消化30min，期间15min轻摇一次。
⑥期间配制细胞培养液：培养基：MEM双抗：2%7.5% 碳酸氢钠：2%牛血清：6%3% 谷氨酰胺：1%⑦消化结束，弃掉胰酶消化液，用PH7.2的PBS冲洗两次，再用细胞生长液冲洗一次。
⑧加入适量的细胞生长液，用刻度吸管反复吹打（使细胞充分分散）。
⑨将细胞分散液倒入带6-8层纱布的100ml烧杯中（过滤之前先用少许细胞培养液润湿纱布），加入适量培养液（40ml/胚），过滤。
⑩重复步骤⑨的操作重虑一遍。
11计数，要求每1ml滤液中约含活细胞100万-150万个。
鸡胚成纤维细胞的培养2008
细胞数/mL=4大格细胞总数/4×10 000×稀释倍数 注意事项 1、 务必使细胞分散成单个细胞，取样计数前，应充 分混匀细胞悬液。 2、 对于分布在刻线上的细胞，依照“数上不数下， 数左不数右“的原则进行计数。计数时，如发现各中方格 的细胞数目相差20个以上，表示细胞分布不均匀，必须 重新计数
[实验内容及操作程序] 1. 取胚及剪碎 将胚蛋气室端向上直立于蛋座上， 用碘酊消毒气室，以镊子击破卵壳并弃之，撕破卵膜， 继撕破绒尿膜、羊膜，取出胚胎于灭菌平皿中。剪去 头部、翅爪及内脏，用PBS液(简称P液)洗去体表血液， 移入另一灭菌平皿中，用灭菌剪刀剪碎鸡胚，使成为 约1mm3大小的碎块，加3mL P液轻摇，后将P液与组 织碎块一起用滴管移入细胞瓶中。
6．分装到细胞瓶后放入37 ℃中进行培养.
防止污染是决定细胞培养是否成功的首要条件:
1. 在实验前,操作室,无菌工作台等实验场所需用紫外灯消 毒30分钟.
2. 实验前先洗手,并用75%的酒精消毒手及放入无菌台的 器具.
3. 在进入无菌台后,先点燃酒精灯.吸管在吸液体前,瓶口在 打开和关闭前都应在火焰上旋转灭菌,以免附在瓶口的细菌污染 液体.烧过的金属器械要待冷后才能接准确,敏捷,但不必太快,以 免引起空气流动过大,增加污染机会.为拿取方便,工作台面上的 用品要合理摆放.液体在未用前不要过早打开瓶盖,用后应及时 封闭瓶口.操作时不要向着无菌台讲话或咳嗽,以免把口腔中的 微生物带入工作台而发生污染.
1、用镊子敲碎气室的蛋壳部，掀开各层膜，取出胚体。 2、放进平皿中，去头，去肢，去内脏，用PBS洗涤。 3、洗好的组织放进另外一半平皿，加一管PBS，一起剪 碎组织。 4、静置一段时间，吸出一部分清液，将组织和少量的清 液一起移入细胞瓶。 5、吸取胰酶到细胞瓶中，放入水浴锅消化，5min摇动一 次，到液体混浊，20-30分钟。 6、加入两管PBS，吹打，静置1min，吸出上层的清液， 再加入PBS,重复1-2次。 7、加两管培养基到另外一个细胞瓶中，盖好盖子备用。 （旧瓶）加一管培养基，吹打，静置少许时间，吸取适 量的悬液（此时是细胞悬液），放入加好了培养基的新瓶 中，稍微吹散。 8、放入37℃温箱培养。
鸡胚发育图解(课堂PPT)
鸡胚孵化图片
第14天 尿囊血管 充分发育并紧贴 壳膜，通过内外 壳膜，蛋壳排除 二氧化碳和水蒸 气，吸进氧气； 尿囊液增加，主 要集中于羊膜周 围，新陈代谢旺 盛，胎儿增重迅 速，解剖胚蛋时 尿囊血管很容易 破裂。
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鸡胚孵化图片
第15天 尿 囊所包 围的蛋 白减少， 照视胚 蛋，小 端发亮 部位缩 小，胚 体与卵 黄的黑 影部分 增多。
鸡胚孵化图片
种蛋 优良种蛋
是获得高孵化
率的物质基础，
是集现代家禽
遗传育种，全
价营养饲料和
疾病净化科技
成果的“载
体”。现代蛋
用种鸡的种蛋
分白壳和褐壳
两类，肉用种
鸡在选育过程
中不注重蛋壳
颜色，其蛋壳
颜色间于白壳
与褐
1
鸡胚孵化图片
壳之间，中国 地方鸡种的蛋 壳颜色也与此 类似。市场上 流通的主要是 商品代和父母 代种蛋。白壳 蛋鸡品种与褐 壳蛋鸡品种正 反杂交后，产 生的后代母鸡 在成年后均生 产浅褐壳的商 品蛋。
受精，受精卵在
母体内滞留期间
不断分裂，到种
蛋产出体外时已
分裂成一团细胞，
此时为胚胎发育
的囊胚期，从正
面看囊胚像覆盖
在卵黄表面的圆
盘，中央为明区，
边缘为暗区，通
常成为胚盘。
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鸡胚孵化图片
第1天 经过 24小时的 孵育，胚 盘变大变 厚，明区 和暗区同 时增大， 在卵黄上 可见到椭 圆形的盾 壮区称为 胚盾是未 来的胚区。
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新进来的水分并
不与卵黄液全面
融合而主要存于
胚区。胚胎与伸
展的卵黄囊血管
形似蚊子，白壳
种蛋通过照视可
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实验目的 学习和掌握鸡胚成纤维细胞的制备和培养方法； 了解原代细胞培养的原理和方法。
鸡胚成纤维细胞元代培养 CEF的培养是在一定条件下，在体外模拟体内生理环 境，使从体内取出的成纤维组织细胞生存、生长和传 代，并维持原有组织细胞的结构和功能特性。
实验原理
病毒能在易感的组织或单层细胞内增殖，并可产生细胞病变，因此， 细胞培养是病毒学研究的重要手段，是进行病毒性疫苗生产和病毒性
鸡胚，置蛋架上，令气室端向上，用碘酒棉消毒蛋壳气室部位。
（2）胚体采集 以镊子击破卵壳气室部位，并除去该部位卵壳。用无菌的 眼科镊子撕开蛋壳气室膜并小心拨开绒毛尿囊膜和羊膜，用弯 镊子夹住鸡胚颈部，移入灭菌的平皿内。用剪刀剪去胚头、四 肢及内脏，用PBS洗去体表血液，移入灭菌小烧杯中。
实验步骤
（3）胚体匀浆 用灭菌剪将胚体剪碎至1mm3小碎块。加入PBS（淹住 组织碎块即可），轻摇，静置1-2min，待组织块下沉，吸去上 层悬液。重复2-3次（以除去其中的红细胞），至上悬液不混 浊为止，移入灭菌的锥形瓶中，吸去PBS。
实验步骤
（三）分装与培养 1、细胞计数 用细胞计数器计数，根据计数结果，加入 DMEM 生长液， 调整细胞浓度至50万-60万个/ml。
实验步骤
2、分装与培养 在培养瓶中加入 2mLDMEM 生长液 ( 如果是 50mL 的培养瓶， 加4mL生长液)，小心吸出过滤后的细胞悬液0.25mL至培养瓶中 （如果是50mL的培养瓶，加0.5mL的细胞悬液)，吹打均匀盖好 瓶塞。在瓶上注明组别、日期，置 37℃温箱中培养 (4h 后细胞 即可贴壁，24-36h生长成单层细胞，此时可更换培养液，并接 种病毒 ) 。分装后 2-4h 不可大幅度移动培养瓶，以免影响细胞 的贴壁和生长。
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实验所需器材、试剂
超净工作台，检卵灯，灭菌的细胞培养瓶、眼科剪、眼科镊、平皿、
吸管、离心管等；9-11日龄鸡胚；PBS，0.25%胰酶消化液，DMEM营养
液，75%酒精棉。
实验步骤
（一）操作前的准备 1、预热培养液：把已经配制好的生长液、Hanks 液和胰蛋白酶液放入37℃水浴锅内预热； 2、用75%酒精棉擦拭双手和紫外线照射过的超净
实验步骤
（四）细胞形态观察 检查时注意培养液的颜色变化，变黄但不混浊表示有 细胞生长，变红表示细胞未生长或生长不佳。37℃培养24-48h 后，于倒置显微镜下观察，细胞可以长成单层，细胞透亮，呈 纤维状，细胞膜清晰。
实验步骤
五、注意事项 1、整个过程严格无菌操作 2、培养液不要太多，应有足够的空间保证细胞对氧的需要 3、放入CO2培养箱培养时，将CO2浓度控制在5%。 4、吸除消化液，向瓶内注入PBS数毫升，轻轻转动培养瓶，把 残余消化液冲掉。注意冲洗细胞时，动作要轻，以免把已松动 的细胞冲掉流失，如用胰蛋白酶液单独消化，吸除胰酶液后， 可不用PBS冲洗，直接加入培养液。 5 、细胞培养对玻璃器皿洗涤要求严格，彻底洗涤后用蒸馏水 冲洗，再用双蒸水冲洗，干燥 灭菌后备用。所有的溶液都要 用双蒸水配制，所用药品试剂用分析纯。
疾病诊断必不可少的工具。原代细胞培养是体外制备细胞培养物的必
经过程，从供体体内取出组织分散成单个细胞接种于培养液中为初次 培养，从初次培养到第一次传代培养为原代培养。本实验识和体会原代细胞
的制备方法和影响细胞培养的主要因素，并掌握原代细胞培养的方法。
工作台；
3、正确摆放要使用的器械：保证足够的操作空 间，不仅便于操作而且可减少污染； 4、点燃酒精灯. 5、准备好将要使用的消毒后的培养瓶。 6、取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球 擦拭好后方能放入超净台内。
实验步骤
（二）鸡胚成纤维细胞的制备 1、鸡胚的处理 （1）蛋壳消毒 取9-11日龄的鸡胚，用检卵灯选取血管清楚、活动正常的
实验步骤
2、分散细胞 （1）胰酶消化 将剪碎的组织块放入锥形瓶中，加入适量的胰酶。包 紧瓶口，37℃水域消化30min，每隔5min轻轻摇动1次。当组织
块变得蓬松透明时，吸弃消化液，用PBS 洗两遍，中止消化。
如再继续消化，可破坏细胞膜而不易贴壁生长，如果消化不够， 则细胞不易分散。
实验步骤
（2）分散细胞 将消化好的细胞悬液从水浴锅中取出，弃去上层液体， 加 5mL 含 血 清 的 DMEM 生 长 液 （ DMEM 营 养 液 +5% 犊 牛 血 清 +100IU/ml青链霉素，用7.5%NaHCO3溶液调pH7.2），以吸管反 复吹吸数次，使细胞分散，此时可见生长液混浊，即为细胞悬 液。静置1min后，使未冲散的组织块下沉。 （3）过滤 用4层脱脂纱布将吹打后的细胞过滤到平皿中，收集滤 液。