原代培养中成纤维细胞的抑制
人牙龈成纤维细胞原代培养
人牙龈成纤维细胞原代培养
人牙龈成纤维细胞原代培养是指从人牙龈组织中分离出的成纤维细胞在体外的培养过程。
具体步骤如下：
1. 采集人牙龈组织样本，通常通过牙龈刮片或手术切取进行采集。
2. 将采集到的组织样本放入含有抗生素和抗真菌药物的培养基中，以避免污染。
3. 组织样本经过消化酶的处理，将细胞从组织中分离出来。
4. 将分离出的细胞转移到含有营养物质和生长因子的培养基中。
5. 在适当的温度、湿度和二氧化碳条件下，将细胞培养在细胞培养箱中。
6. 观察和检测细胞的生长状态，通常通过显微镜观察细胞形态、细胞数量和细胞活力等指标。
7. 经过一段时间的培养，当细胞达到足够数量时，可以进行细胞传代，即将细胞从原培养瓶中转移到新的培养瓶中，以保证细胞的正常生长和建立永久细胞库。
人牙龈成纤维细胞原代培养可以用于研究人牙龈组织的生理和病理过程，以及在临床牙周疾病和牙体牙髓疾病的治疗中的应用。
西罗莫司对肌成纤维细胞表达Ⅰ型胶原和纤维连接蛋白的抑制作用
原代培养的大鼠肾皮质肌成纤 维细胞 （ ｙｆ ｒｂａｔ ＭｙＦ 。实验各 时间点分别设对 照组和用西 罗莫司 ４ ｇ Ｌ ｍ ｏ ｂｏｌ ， ｏ ） ｉ ｓ ０ｍ ／ 处理组。将细胞培养 １ ， ４ｈ ４ 后分别收集细胞和细胞培养上清液 ， Ｗｅｔｒ ｌ 方法检测细胞内 ｏ 平滑 ２ｈ ２ ， ８ｈ 用 ｓ ｎｂ ｔ ｅ ｏ ｔ － 肌肌动蛋白（ ｓ ｏｔ ｍ ｓｌ ａｔ ， －ＭＡ）纤维连接蛋 白（ ｂｏｅｔ ， Ｎ） ． ｏ ｕｃ ｃｎ Ｓ ｍ ｈ ｅ ｉ 、 ｉ ｆ ｒｎｅｎ Ｆ 、Ｉ型胶原 （ ｐ ｃｌｇｎ Ｃ ｌ 和 ｉ ｔ ｅＩ ｏ ａｅ ， ｏ— ｙ ｌ Ｉ） 上清液 中 Ｆ Ｃｌ 蛋 白水平的表达 ； Ｎ， ｏ Ｉ — 用实时荧光定量 Ｐ Ｒ ｒａ ｔ ｅ ｕ ｎｉｔ ｅ Ｃ 法 检测细胞培养 １ ， ， Ｃ （ｅｌｉ ａｔａｉ Ｒ） —ｍ ｑ ｔ ｖＰ ２ｈ ４ ｈ ｈ ６ｈ各时问点前胶原 Ｉ（ｒｃｌｇｎＩ） Ｒ Ａ表达 的变化 ； 明胶 酶谱法检测细胞培养上清 液中基质金属蛋 白 ， ｐｏｏａｅ — ｍ Ｎ ｌ 用 酶．（ ａ ｘｍ ｔｌｐｏ ｉａｅ ， ２ ｍ ｔ ｅ ｌ ｒｔｎ ｓ． ＭＭＰ２ 和基质金属蛋 白酶＿（ ａ ｘ ｔ ｌ ｍｔ ｎｓ－ ， ＭＰ９ 的活性 。 ｉ ｒ ａｏ ｅ ２ －） ９ ｍ ｔ ａｏ ｅ ａｅ９ Ｍ －） ｉ ｒ ｍｅ ｐ ｉ ｌ 实验结果 分别以各时间点对照组作为基线 １ 计算与对照组的 比值 。结亲：（ ） ， １ 西罗莫 司于各个 时间点对 细胞 内 ｏＳ Ａ的 ｔＭ —
表达均无影响。（ ） ２ 用西罗莫司处理后 ，于 ２ 对细胞 内 Ｃ ｌ 蛋 白表达量明显少于对照组 ， ４ｈ ｏＩ － 并持续至 ４ ， ８ｈ 分别
为各时间点对照组 的（． ８４ ． ５ 倍和（ ．３±０ １ ） ， ０５ ００ ） － ０６ ． ８ 倍 差异有统计 学意义 （ Ｐ＜００ ） ３ 与各 时间点对照组 ． ５ 。（ ） 相 比， 细胞 内 ｐｏｏａｅ —ｍＲ Ａ在 １ｈ ２ｈ ｒｃｌ ｎＩ Ｎ ｌ ｇ ， 时表达均减少 ， 分别为（ ．８± ． ５ 倍和 （． ５４ ．６ 倍 ， ０３ ００ ） ０ ５ ０ １ ） 差异有统 －
大鼠原代心肌细胞提取方法
大鼠原代心肌细胞提取方法原代心肌细胞培养是体外研究心血管疾病相关机制的主要手段和基本技术基础实验中，与细胞系相比，原代心肌细胞的形态及电生理方面更接近在体细胞，因此，培养原代心肌细胞的质量直接关系实验的进程及结果。
乳鼠原代心肌细胞分离须注意以下几点：1. 鼠龄的选择：新生1-3d龄，最好半日龄。
新生大鼠心肌细胞在出生后3 d内具有部分的增殖能力，成年大鼠心肌细胞则为终末分化细胞，不再具有分裂增殖能力。
因此，大鼠出生时间越短，其心肌细胞分离后成活率越高，越容易贴壁生长。
建议选择1~3 d龄大鼠分离其心肌细胞进行原代培养。
2.消化酶的选择：胰蛋白酶和胶原酶混合使用（0.4%胶原酶:0.05%胰酶=2:1）。
常用的消化酶有2种：胰蛋白酶和胶原酶，胰蛋白酶作用较强，容易造成心肌细胞损坏，胶原酶作用较缓和，能消化细胞间质中的胶原纤维以释放细胞，对细胞损伤小。
3.消化程度的把握：组织由红转白呈半透明状态时，停止消化。
新生大鼠心肌细胞对消化酶极为敏感。
消化不足，细胞聚集成团，无法得到单层细胞，不利于观察和后续实验；消化过度可使肌原纤维出现萎缩，细胞死亡率增加或丧失贴壁能力及搏动能力；消化的适宜温度为35~37℃。
4.抑制成纤维细胞生长：加入BrdU，更换小牛血清。
分离出来的心肌细胞会伴有较多成纤维细胞，成纤维细胞具有较强增殖能力会干预心肌细胞的贴壁和增殖，需要尽量去除成纤维细胞。
成纤维细胞较心肌细胞更容易贴壁，可以通过差速贴壁去除大部分成纤维细胞，但仍有少量成纤维细胞混杂于心肌细胞之中。
溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine, BrdU)可干扰细胞的有丝分裂，故常规使用BrdU抑制成纤维细胞的生长。
由于胎牛血清所含的促细胞有丝分裂的因子较多，BrdU很难完全抑制成纤维细胞的生长.改用小牛血清则可克服这种现象的出现，获得高达90％以上的心肌细胞。
5.培养液pH值：pH范围在7.2~7.4之间。
操作过程：手持大鼠乳鼠（出生24h内），75%乙醇消毒皮肤，剪开胸部皮肤，再消毒1次，更换手术器械，弯镊提取心脏，置于盛有PBS（1:50双抗）的大皿中；将心脏表面附着的大血管剪去，剪去心房，放入5ml灭菌离心管中充分剪碎成肉泥状；加3ml左右胶原酶和1.5ml 0.05%胰酶充分吹匀，37℃消化8 min，自然沉淀，弃上清，再加3ml左右胶原酶和1.5ml0.05%胰酶，充分吹匀，37℃消化10min；取上清，3000 rpm 5min，铺中皿加含有10%胎牛血清的DMEM培养基（记1），剩余沉淀中加入3ml左右胶原酶和1.5ml0.5%胰酶，充分吹匀，37℃消化10min；重复4的步骤4-5次，直至组织块消化完毕，记（2-5）放培养箱2到3小时待成纤维细胞贴壁后轻轻吹打培养基，所有的中皿上清移入离心管离心3000 rpm 5min，弃上清，加含有10%小牛血清的DMEM培养基以及Brdu（10mM）（1:80），铺中皿培养。
EGCG改善高浓度TNF-α对人皮肤创伤愈合中成纤维细胞的抑制作用
EGCG改善高浓度TNF-α对人皮肤创伤愈合中成纤维细胞的抑制作用余红梅;胡宏鸯;吴霞;方海云【摘要】AIM:To explore the effect of high tumor necrosis factor α ( TNF - α ) level and pre - treatment of epigall o cat he chin - 3 gallate ( EGCG ) on the process of wound healing in dermal fibroblasts. METHODS: Primary dermal fibroblasts were cultured in vitro. The cells were treated with TNF -α at α concentration of 10μg/L for 24 h or co - treated with EGCG( 40μmol/L). The cell counting assay was used to observe the proliferation. The cell migration was assessed by wound healing assay. Western blotting was used to observe the expression of collagen type I. RESULTS: High TNF - a level significantly inhibited the proliferation and migration of dermal fibroblasts. However, EGCG pre -treatment attenuated the inhibitory effect of TNF -α on the proliferation in a dose - dependent manner. The inhibited cell migration was also improved by EGCG. The expression of collagen type I was down - regulated by TNF -α and recovered by EGCG pre - treatment. CONCLUSION: EGCG abrogates the inhibitory effect of TNF - a on the proliferation and migration of dermal fibroblasts in wound healing. The expression of collagen type I is also improved. The results suggest that EGCG has protective effect on wound healing.%目的:探讨高浓度肿瘤坏死因子α(TNF-α)对人皮肤创伤愈合中成纤维细胞的抑制作用以及表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)的干预效应.方法:体外培养原代人皮肤成纤维细胞,以10 μg/L TNF-α作用24 h或联合EGCG预处理干预,用细胞计数试剂盒观察细胞增殖,细胞划痕愈合实验观察成纤维细胞的迁移,Western blotting法研究I型胶原蛋白的表达.结果:TNF-α显著抑制皮肤成纤维细胞的增殖和迁移,EGCG呈浓度依赖性地改善TNF-α的增殖抑制作用,以EGCG(40 μmol/L)预处理后,TNF-α对细胞迁移的抑制作用也得到恢复.Western blotting发现TNF-α还能抑制I型胶原蛋白的表达,而加入EGCG(40 μmol/L)后其表达有显著恢复.结论:EGCG能显著改善高浓度TNF-α对人皮肤成纤维细胞增殖和迁移的抑制作用,并恢复I型胶原的表达,从而促进皮肤创口的愈合.【期刊名称】《中国病理生理杂志》【年(卷),期】2012(028)001【总页数】4页(P155-158)【关键词】成纤维细胞;表没食子儿茶素没食子酸酯;肿瘤坏死因子;伤口愈合【作者】余红梅;胡宏鸯;吴霞;方海云【作者单位】浙江大学医学院附属邵逸夫医院,普外科,浙江,杭州,310006;浙江大学医学院附属邵逸夫医院,普外科,浙江,杭州,310006;浙江大学医学院附属邵逸夫医院,皮肤科,浙江,杭州,310006;浙江大学医学院附属邵逸夫医院,普外科,浙江,杭州,310006【正文语种】中文【中图分类】R285.5;R641皮肤创口愈合是一个复杂的生物学过程。
成纤维细胞原代培养
利用组织块可以成功地培养得到原代培养的人皮肤真皮成纤维细胞。
培养中应该注意以下事项：①一般皮肤主要取白手术过程中切除的部分组织，方法似外科取断层皮片手术操作，但组织一般2—3cm 即可，注意取材时不要用碘酒消毒．此外，不要切取太厚，要尽量去除皮下组织，如果皮下脂肪太厚会影响组织块的贴壁，不易于日后细胞的游出．②尽量去除表皮，如有表皮未被完全剔除，则可能造成表皮细胞竞争生长，最为常见的为角质形成细胞的污染，它可以和成纤维细胞共同生长．虽说在今后的传代培养时可通过细胞纯化方法适当去除，但这种混和生长状态会对后续实验产生影响．所以，一旦发现细胞污染，应立即停止实验，重新培养．③在剪切组织块时要注意保持组织块湿润，可向其表面滴加几滴培养液，要始终保持其成湿润状态，这一点要特别注意而且十分重要．剪切时要掌握好时间，尽量在短时间内完成．④组织块在最初贴壁时不是很牢固，所以开始加液不应太多，以刚刚浸没组织块为易，特别要注意，在最初几天时要减少移动培养瓶次数，避免过多晃动而造成组织块脱壁，最好在开始3 d内不换液．⑤文献报告成纤维细胞培养多在CO 培养箱内进行，培养箱内环境为CO 浓度50 ml／L，湿度95％，培养瓶为开放式．因其湿度，温度及氧气与人体内实际情况较为接近，所以适合成纤维细胞的成长．但开放式培养的同时也增加了细胞培养污染的机率，所以，可以根据自己实验室的条件选用合适的培养方法，如半开放式和充气后密闭瓶口，其效果也十分理想．但同时要密切观察培养液的pH变化，以保持适宜的酸碱度．⑥细胞培养失败的最常见原因是污染，其中以微生物污染最常见，污染一旦明确，多数将无法救治，应尽快弃之，以防止污染扩大，影响其他细胞．因此，应在各个阶段严格遵守无菌操作原则，把好每一关口，尽可能禁止其他污染的物品进入操作环节，以避免造成时间、人力、物力的浪费．。
综合选修0211概念4细胞工程02--3.3 胚胎工程的应用及前景试题及答案
综合选修0211概念4细胞工程02--3．3胚胎工程的应用及前景试题及答案1．胚胎移植的概念：( )。
[单选题] *指将雌性动物体内的早期胚胎或通过体外受精及其他方式得到的胚胎，移植到同种的、生理状态相同的其他雌性动物体内，使之继续发育为新个体的技术。
(正确答案)2．胚胎移植的实质：( )。
[单选题] *从过程看，实际上是生产胚胎的供体和孕育胚胎的受体共同繁殖后代的过程。
从结果看，是早期胚胎在相同生理环境条件下空间位置的转移。
(正确答案)3．胚胎移植在胚胎工程中的地位：( )。
[单选题] *是胚胎工程其他技术的最后一道“工序”。
(正确答案)4．胚胎移植在胚胎工程中的意义：( )。
[单选题] *可充分发挥雌性优良个体的繁殖潜力。
(正确答案)5．胚胎分割的概念：( )。
[单选题] *指采用机械方法将早期胚胎切割成2等份、4等份或8等份等，经移植获得同卵双胎或多胎的技术，所得后代遗传物质相同。
(正确答案)6．胚胎分割的仪器设备：( )。
[单选题] *实体显微镜和显微操作仪。
(正确答案)7．胚胎分割的特点：( )。
[单选题] *后代遗传物质相同。
(正确答案)8．胚胎分割的操作程序：( )。
[单选题] *胚胎分割的操作程序：(1)选择发育良好、形态正常的桑椹胚或囊胚，移入盛有操作液的培养皿中。
(2)用分割针或分割刀片切开胚胎，吸出其中的半个胚胎，注入空透明带或直接将裸半胚移植入受体。
此时还可用分割针分割滋养层，做胚胎DNA分析性别鉴定。
(正确答案)9．胚胎分割的注意事项：( )。
[单选题] *分割囊胚时要将内细胞团均等分割，否则会影响分割后胚胎的恢复和进一步发育。
(正确答案)10．胚胎干细胞的概念：( )。
[单选题] *由早期胚胎或原始性腺中分离出来的一类细胞，简称ES或EK细胞。
(正确答案) 11．胚胎干细胞的应用：( )。
[单选题] *胚胎干细胞的应用：(1)可以用于治疗人类的某些顽症。
人牙周膜成纤维细胞的原代培养及鉴定
ｖｉｔｒｏ ｆ ｏｒ ｆｕｔｕｒｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ Ｈ ＰＬＦ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ ｅｙｔｏｋｉｎｅｓ．
【关键词 】 牙周膜 ；成纤维细胞 ；细胞培养技术
Ｔｈｅ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｉｄｅｎｔ ｉｆ ｉｃａｔ ｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ ｌｉｇａｍｅｎｔ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ＲＥＮ Ｊｕａｎ，ＬＩ Ｘｉａ，ＳＵＮ Ｋｅ—
ｑｉｎ，ＣＨＥＮＧ Ｊｕｅ，ＷＡＮＧ Ｘｉａｎｇ－ｙｕ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｏｒａ ｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏ ｆ Ｓｈａ ｎｘｉ Ｍｅｄｉｃａ ｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔａｉｙｕａ ｎ
研究牙周组织疾病 的重要手段 。日前关于牙周膜细 医科大学 口腔医院 口外科因正畸而拔 除的双尖牙 ．
胞的原代培养有酶消化法和组织块培养法【１，２１两种 ， 年 龄 １２～２６岁 ，所选 牙齿 均无 龋坏 、根尖 周疾 病及 牙
本实验采用组织块法培养牙周膜细胞 ，并对其进行 周 炎 。拔牙前 嘱患者用 ３％双氧水 含漱 ，碘 伏 消毒 术
【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】 Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ ｌｉｇａｍｅｎｔ； Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ；Ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
人 牙周 膜 成 纤 维 细胞 （ｈｕｍａｎ ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ ｌｉｇａ— ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；ＣＯ２培 养 箱 （Ａｓｈｅｖｉｌｌｅ ＮＣ，ＵＳＡ）；ＧＢ一 Ⅱ
一、肿瘤细胞体外培养的重要性
5．培养基
在癌细胞建系中，选择性培养基的应用 是提高癌细胞体外存活、抑制成纤维细 胞生长的关键技术改进。选择培养基是 针对特殊细胞生长的营养要求设计的。 针对癌细胞的特点，选择性培养基应含 少量血清。
血清对上皮细胞有抑制作用有利于成纤维细胞生长。因 此用低或无血清培养基为好。改良RPMI-1640培养基可 提高癌细胞存活。
在人类的脑部、肺部和胰腺等部位的肿瘤中 EGFR的含量极高，Artrazeneca公司的研究人员 于1998年率先提出通过开发阻断EGFR的药物，
可以抑制肿瘤的生长，这种全新的疗法就是现在
的靶向性疗法，它没有毒副作用，不会杀死正常
细胞，按照这种思路，基因技术公司开发出一种 治疗晚期乳腺癌的药物Herceptin，并于1998年 获准上市。Herceptin是一种单克隆抗体药物，靶 向HER-2，这种药物能使只有5个月寿命的晚期 乳腺癌病人继续生存。为什么Herceptin成功获准，
由于临床试验中没有同时对所有乳腺癌患者进行 试验，而是选择了其中的一小部分（大约占25℅） 的那些HER-2含量异常高的晚期乳腺癌患者。
Astrazeneca公司的肺癌药Iressa等都是靶 向 药 物 ， 靶 EGFR， 但 成 功 的 只 有 Herceptin。Iressa 只 在 1 0 ℅ 肺 癌 患 者 中 有 神奇作用，但在大规模的临床试验中90℅ 人无效。花3亿美元，10年时间，未获批准。
肿瘤发生发展结局的机理研究进入分子水平，人类 最终认识肿瘤才可以征服肿瘤。若癌变 的始发变化
是基因活动的调控失常，癌变就具有潜在的可逆行， 就可以为肿瘤治疗开辟一个完全新的途径—控制调 控机制；若癌变的本质是基因突变，那就意味着癌 变不可逆，只有了解其突变的部位，只有通过基因 治疗，而所有这种机理的研究，其中一个重要的手 段是通过肿瘤细胞的体外培养进行研究。虽然体外 培养不能完全反映体内情况，但为单因素、多因素 研究提供模型。
原代成纤维细胞培养基配方
原代成纤维细胞培养基配方1.引言1.1 概述成纤维细胞是一类常见的细胞，广泛存在于人体各个组织中，包括皮肤、血管、肌肉和内脏等。
在细胞培养技术的发展过程中，原代成纤维细胞培养基的配方变得越来越重要。
原代成纤维细胞培养基是一种提供养分和适宜环境的培养液，可以维持原代成纤维细胞的生长和增殖。
原代成纤维细胞培养基的配方包括多种关键成分，如培养基基础成分、生长因子、附加物等。
不同的组分可以提供细胞所需的营养和信号物质，使细胞能够在体外环境下继续生长和繁殖。
原代成纤维细胞培养基配方的研究对于细胞生物学、组织工程和再生医学等领域具有重要意义。
通过优化培养基的配方，可以提高原代成纤维细胞的增殖速度和存活率，同时改善其功能和特性，为细胞研究和临床应用提供更好的工具和基础。
然而，目前关于原代成纤维细胞培养基的配方研究还比较有限。
不同实验室和研究者之间存在着很大的差异，配方的选择和调整仍然依赖经验和试错。
因此，进一步的研究和探索仍然是十分必要和迫切的。
本文将深入探讨原代成纤维细胞培养基配方的概念和重要性。
我们将详细介绍培养基的组成、各种成分的作用机制，并总结现有研究的进展和局限性。
最后，我们将展望未来的研究方向，希望通过进一步的研究和探索，为原代成纤维细胞培养基的配方优化和应用提供更好的指导和支持。
1.2 文章结构文章结构部分的内容可以包括以下内容：文章结构部分的主要目的是为读者提供对整篇文章的摘要和框架。
通过描述文章的组织结构，读者可以更好地理解文章的内容和逻辑顺序。
首先，本文将介绍原代成纤维细胞培养基的概念和重要性。
这一部分将讨论成纤维细胞在生物医学和生命科学研究中的重要作用，以及为什么培养基对于细胞培养的成功和细胞功能的研究是至关重要的。
其次，本文将详细介绍原代成纤维细胞培养基的组成。
这一部分将讨论培养基中各种组分的作用和功能，如营养物质、生长因子、酶和血清的添加等。
读者将了解到培养基中各种组分的重要性和对细胞生长和功能的影响。
肿瘤细胞培养
第6章肿瘤细胞得培养肿瘤细胞培养就是研究癌变机理、抗癌药得敏感性、肿瘤细胞与癌分子生物学特性得重要手段。
癌细胞就是比较容易培养得细胞，当前所建立得细胞系中癌细胞就是最多得。
应用体外细胞培养技术进行肿瘤研究具有许多优点：(1)可免受机体内环境因素得影响，避免了个体差异性，便于探索各种物理、化与生物因素对肿瘤细胞生命活动得影响。
(2)既便于从细胞水平上研究肿瘤细胞得结构与功能，又便于从基因及分子水平上研究癌变得发生机理；(3)可长期传代、保存，便于观察肿瘤细胞生物学特性与遗传行为得改变。
(4)可用于快速筛选抗癌药物与研究耐药机理。
(5)研究周期短，比较经济。
但就是它也有缺点，如长期培养可使细胞生物学特性发生改变;体外实验所得得结果不能完全代表体内得情况，应与体内试验结合研究更为合理等。
一、肿瘤细胞培养得生物学特性1、形态与性状形态不规则,细胞界限淸晰，伸展较差,核膜、核仁轮廉明显，核仁多、核浆丰富、折光性强, 电镜观察细胞表而微绒毛多而细密，与肿瘤细胞具不左向运动与铺着不依赖性有关、2、生物特性癌细胞在无血淸或低血淸(2%~ 5 %)时仍能生长,营养要求不奇，因能自分泌促增殖因子, 在软琼脂培养时单个细胞能形成集落，生长方向性消失，再加上失去了接触抑制，癌细胞数量增多时可呈多层重叠生长，细胞饱与密度大，有丰富得三极有丝分裂，分裂指数髙，细胞倍增周期短。
3、永生性永生性也称不死性,在体外培养中表现为可无限制传代而不凋亡(Apoptos i s ),体外培养得肿瘤细胞系(株)都表现有这种特性。
但体外培养得永生性与体内肿瘤得恶性(包括侵润性) 就是两种性状，受不同基因调控得，因恶性肿瘤多数在体外培养时并不那么容易获得成功，生长增殖能力并不旺盛，有时只能传若「代,说明体外培养得永生性可在体外培养后获得得。
另外，体外培养得许多细胞系，如N 1H3T3、Rat -1 10T1/2等均具有永生性而无恶性。
但两者有相关性，永生性可能就是细胞恶性变得某一阶段。
原代培养中成纤维细胞的抑制
尽量除去杂质细胞：现在一般的做法是：将消化完全的细胞悬液先在大的培养瓶中培养1~2小时，然后再小心的吸出仍然悬浮的心肌细胞，再接种到6孔或24孔板上。这样做主要是尽量除去成纤维细胞。由于成纤维细胞贴壁迅速，而心肌通常在4h后才开始贴壁，这样才能尽量利用差速贴壁法除去成纤维细胞。
（2）机械划除法
原代培养成功后，上皮细胞和成纤维细胞所数都同时出现，混杂生长。这种混杂生长常常分区成片，每种细胞都以小片或区域性分布的方式生长在瓶壁上。因此可以采用机械的方法去除不需要的细胞。
（3）反复贴壁法
成纤维细胞与上皮细胞相比，其贴壁过程快，大部分细胞常能在短时间内大约10－30min完成附着过程，而上皮细胞大部分在短时间内不能附着或附着不稳定，稍加振荡即浮起，这样可以利用此差别来纯化细胞。
方法：
1.取材：4～6ｗＷｉｓｔａｒ大鼠,大剂量2%戊巴比妥钠麻醉处死，将处死后的大鼠浸入75%酒精中，放入超净台。在无菌状态下剪开胸腹腔，分离胸主动脉,用2ｍｌ注射器从主动脉弓处向胸主动脉注入D-Hank’s液,驱除残血,取主动脉弓至肾动脉一段，两端结扎剪断，放入60℃预热无菌水中2秒。然后置于准备好的RPMi1640培养基（含双抗）中。
【wangtsy】胰岛的分离与纯化
取新生1-3天SD大鼠10-15只，无菌条件下剖腹取出胰腺置入无菌培养皿中，用眼科剪去除非胰腺组织，4℃Hanks液清洗三次后，用眼科剪反复剪切至<0.5mm3组织块，取浓度为1g/L的V型胶原酶溶液5-10ml与之混合,转入三角烧瓶中，于37℃恒温水浴振荡器消化30-40min，加入两倍体积4℃Hanks液终止消化，用吸管反复吹吸后过80目筛网，滤液以800rpm低速离心70s去上清液，并用4℃Hank's液低速离心清洗2次，除去单个腺泡及上皮细胞。加入含2.5mg/L碘乙酸的PRMI1640完全培养基（含10%胎牛血清、10mmol/L HEPES缓冲液、1mmol/L丙酮酸钠、100000u/L青霉素G钾、100mg/L链霉素、71.5umol/L β-巯基乙醇）中制成细胞悬液,接种于75ml玻璃培养瓶中,于37℃,5%CO2,95%空气条件下培养5h后，用无血清培养基低速离心清洗3次,以除去成纤维细胞。然后用正常完全培养基培养24h，转瓶弃去贴壁细胞，用无血清培养液低速离心洗涤两次，沉淀物即为纯化胰岛。再用PRMI1640完全培养基养吧，可长成胰岛单层细胞。
原代细胞培养
二、实体组织材料的分离方法
• 实体组织细胞间结合紧密，为了使组织中的细 胞充分分散，形成细胞悬液，可采用： • （一）机械分散法 • （二）消化分离法
（一）机械分散法
• 适用组织：纤维成分少的软组织。如脑组织，部 分胚胎组织 • 方法： • 采用剪刀剪切、用吸管吹打分散组织细胞 • 将已充分剪碎分散的组织放在注射器内使细胞通 过针头压出 • 在不锈钢网内用钝物压挤使细胞从网孔中压挤出。 • 特点：简便、快速，但对组织机械损伤大，而且 细胞分散效果差。
细胞培养之
---原代细胞的培养
基本概念
• 来源于胚胎、组织器官及外周血，经特殊分离方 法制备而来的原初培养的细胞称之为原代细胞。 • 能稳定生长传至10~20代以上的细胞可确立为细胞 系。
• 经单细胞克隆、纯化，大量扩增后所形成的生物 学特性稳定的克隆化细胞群，称之为细胞株。
原代细胞的培养
• 原代细胞的培养是从供体取得组织细胞在体外
第二节 原代细胞的分离和制作
• 一、悬浮细胞的分离方法 • 组织来源：血液、羊水、胸水或腹水 • 方法：1000r/min的低速离心10 min→沉淀用 无钙、镁PBS洗两次，培养基洗一次→调整适 当细胞浓度→分瓶培养 • 若选用悬液中某些细胞，加入细胞分层液，经 离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中 形成不同层。 • 如：淋巴细胞分离
注意事项
• （1）组织块必须漂洗2-3次以除去组织中的钙、 镁离子和血清对胰酶和EDTA的抑制作用。
• （2）胰酶浓度不宜过高，作用时间不能太长， 以避免毒性作用。 • （3）消化后组织不仅要尽量弃去消化液，以 避免毒性产生，而且动作要轻，以避免膨松的 细胞随漂洗而丢失。
第三节 原代细胞的培养方法
原代心肌细胞-原代心成纤维细胞培养方法
原代心肌细胞-原代心成纤维细胞培养方法实验准备：昆明乳鼠25~30只；生物安全柜；巴氏吸管2支；培养皿2个；原代器械盒；15ml 离心管；50ml离心管各一支；胰酶；PBS；1%双抗；封口膜；酒精灯；Dhanks；实验主要分为两大步骤进行：第一天晚上1、培养皿内加入预冷的PBS+1%双抗。
2、取乳鼠酒精喷全身取心脏放到提前准备的培养皿中无需剪碎稍抖动清洗。
3、所有心脏取完，用巴氏吸管将培养皿中的心脏吸到15ml离心管中，稍等沉降，吸去液体。
4、加入Dhanks冲洗心脏，吸出弃去，将心脏上沾有的血尽量冲洗干净。
5、加入3mlDhanks和5ml胰酶。
封口膜封好，放到饭盒里，四度摇床8-12小时。
第二天上午1、配置二型胶原酶（16.8mg二型胶原酶+21mL DMEM,配好后放到水浴锅预热，微孔滤膜过滤，现用现配）2、8-12小时后，向装有心脏的15ml离心管中加入5ml DMEM完全培养基中和胰酶。
之后小心吸去液体，加入7ml提前准备好的二型胶原酶。
放到37度摇床摇10min转速160r，摇10min后将上清吸到新的50ml离心管中。
这个过程重复3次，基本上心脏全部溶解，只有少量组织。
（每次可以少加二型胶原酶4-5ml多消化几次）3、将50ml离心管中3次收得的上清滤网过滤，离心1000r5min，弃上清，沉淀加入DMEM完全培养基，逐层吹起，加入到细胞培养瓶中。
5只鼠铺一个培养瓶。
4、1.5-2小时后差速，将培养瓶中的培养液转移到六孔板里。
心肌细胞10只鼠一个6孔板即可。
注：用心肌细胞的取6孔板中细胞培养48小时；用成纤维细胞的将培养瓶中差速的瓶用1000ul的枪冲洗30次得到的成纤维细胞相对较纯。
肺成纤维细胞原代培养基本步骤
肺成纤维细胞原代培养基本步骤一、引言肺成纤维细胞是肺组织中的主要细胞类型之一，它们在肺部的结构和功能维持中起着关键作用。
原代培养是研究肺成纤维细胞生物学特性的重要手段之一。
本文将介绍肺成纤维细胞原代培养的基本步骤。
二、实验材料1. 无菌工具：无菌操作台、无菌吸管、无菌离心管等2. 细胞培养基：DMEM/F12（含10% FBS）、Penicillin/Streptomycin3. 消化液：Trypsin/EDTA4. 细胞收获液：PBS（含1% P/S）三、实验步骤1. 准备培养皿和培养液将DMEM/F12培养液加入到6孔板中，每孔加入2ml。
然后将板放入37℃恒温箱中预热。
2. 收集组织样本从小鼠或人体组织中收集需要的肺组织样本，并迅速转移到含有PBS （含1% P/S）的离心管中。
3. 组织消化将组织样本切碎成小块，然后加入2ml的Trypsin/EDTA消化液，放置于37℃恒温箱中消化30分钟。
4. 细胞分离将消化后的组织样本转移到无菌离心管中，用DMEM/F12培养液洗涤2次。
然后加入2ml的DMEM/F12培养液，在37℃恒温箱中振荡5分钟，使细胞分散均匀。
5. 细胞计数和接种用细胞计数板计数细胞数量，并将细胞接种到预热好的6孔板中。
每孔接种1×10^4个细胞。
6. 培养和观察将6孔板放入37℃恒温箱中培养，每天更换一次DMEM/F12培养液。
观察细胞生长情况，并在需要时进行下一步实验操作。
四、实验注意事项1. 手术器械、培养皿和培养液必须严格无菌。
2. 组织样本必须迅速转移至含有PBS（含1% P/S）的离心管中。
3. 消化时间不能过长，否则会对细胞产生不良影响。
4. 细胞接种密度要适当，过高或过低都会影响细胞生长。
5. 培养液必须每天更换一次，以保证细胞正常生长。
五、总结肺成纤维细胞原代培养是研究肺部生物学特性的重要手段。
本文介绍了肺成纤维细胞原代培养的基本步骤，包括准备培养皿和培养液、收集组织样本、组织消化、细胞分离、细胞计数和接种以及培养和观察等步骤。
小鼠成纤维细胞原代培养
实验-小鼠成纤维细胞的原代培养一、实验目的1.掌握哺乳动物细胞原代培养与传代培养中的取材、消化及无菌操作等基本实验技术与操作过程。
2.熟悉在倒置相差显微镜下观察培养细胞的形态与生长状况的方法。
3.了解细胞原代培养与传代培养的原理与方法。
二、实验原理自17世纪下半叶Robert Hooke提出“细胞”概念直至20世纪中叶,细胞培养(Cell culture)才逐渐发展起来。
现代生命科学以及相关领域的研究前提就是细胞的维持与增殖,因此,细胞培养不仅就是细胞生物学的密不可分的组成部分,而且已经成为生物化学、生物物理学、遗传学、免疫学、肿瘤学、生理学、分子生物学与神经科学、甚至临床医学的重要内容。
细胞培养也就是细胞生物学延伸至相关学科的一条主要途径。
如今,细胞培养已经成为生命科学与医学研究最常用的基础技术之一。
细胞培养就是模拟机体内生理条件,将细胞从机体中取出,在人工条件下,使其生存、生长、繁殖与传代,进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。
细胞培养的直接目的就是维持或扩增细胞数量。
依据取材于动物组织或培养细胞,细胞培养分为原代培养与传代培养。
1.原代培养(primary culture)就是从供体取得组织或细胞后在体外进行首次培养直至成功地进行首次传代之前的培养。
但实际上通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。
原代培养就是建立细胞系的第一步,其最基本的方法有两种:组织块培养法与消化培养法。
组织块培养法就是指直接从机体取下组织与器官,通过组织块直接长出单层细胞,该培养法就是最常用的原代培养方法,其将刚刚离体的、生长活力旺盛的组织剪成小块接种在培养瓶中作为实验材料,一天后细胞可从贴壁的组织块四周游出并生长。
组织块培养法操作过程简便、易行,培养的细胞较易存活,适用于一些来源有限、数量较少的组织的原代培养。
消化培养法利用酶或机械方法将组织分散成单个细胞后,在不加任何粘附剂的情况下,直接移植在培养瓶壁上,加入培养基立即进行培养的方法。
人皮肤成纤维细胞原代培养及生物学特性_王晓华
人皮肤成纤维细胞原代培养及生物学特性王晓华，王扬，蒋涛，付立业，姜又红（中国医科大学附属第一医院肿瘤研究所，沈阳110001）摘要：目的探索和建立人皮肤成纤维细胞原代培养的方法，为皮肤成纤维细胞在临床医学中的应用提供可靠的科学依据。
方法胰蛋白酶消化法分离培养人皮肤成纤维细胞；细胞生长曲线及MTT 法测定细胞增殖能力；流式细胞仪测定细胞生长周期及细胞增殖指数；倒置显微镜下观察成纤维细胞生长状态；HE 染色观察细胞爬片下的形态及着色；免疫组织化学染色观察成纤维细胞中间丝波形蛋白；电子显微镜下观察成纤维细胞超微结构。
结果体外用胰蛋白酶消化法建立了人皮肤成纤维细胞；传5代内细胞及传5代内冻存复苏后人皮肤成纤维细胞增殖能力均很强；倒置镜下观察、HE 染色、波形蛋白免疫组化染色及电镜下观察鉴定培养细胞的形态及生物学特性符合成纤维细胞。
结论本研究确立了体外人皮肤成纤维细胞原代培养。
关键词：人；皮肤；原代培养；成纤维细胞；细胞增殖指数；细胞形态学中图分类号：R318.08文献标志码：A文章编号：0258-4646（2010）12-1041-04Primary Culture and Biological Characteristics of Human Skin Fibroblasts 随着年龄的增长，皮肤会出现松弛、干燥粗糙、弹性下降、皱纹增多等老化现象，这些现象都与成纤维细胞数量减少以及分泌合成功能下降或异常有关［1］。
人皮肤成纤维细胞是皮肤真皮网织层中最重要的细胞，是皮肤衰老和细胞受损后的主要修复细胞之一［2］。
它不但能够促进表皮细胞的迁移、增殖和分化，还能分泌大量的胶原蛋白、弹性纤维蛋白及多种细胞修复因子，具有强大的自我更新能力［3］，从而修复老化的皮肤。
成纤维细胞是维持皮肤弹性和韧性的重要细胞［4］，因其特有的生物学特性，在抗皮肤衰老中起着重要的作用。
本研究拟通过皮肤成纤维细胞的分离和体外培养，观察、总结体外培养的成纤维细胞生物学特性，在细胞水平上对皮肤成纤维细胞的形态及生物学特性进行研究，以获得在体外稳定生长的皮肤成纤维细胞，为成纤维细胞在医学美容除皱术中的应用提供可靠的科学依据［5］。
细胞原代培养实验报告
细胞原代培养实验报告一、实验目的本实验旨在通过细胞原代培养实验，学习细胞培养技术，了解细胞生长特性和生理功能，以及评估细胞毒性和细胞增殖能力。
二、实验原理细胞原代培养是指从组织或器官中分离出的一种或多种类型的原代细胞在无血清条件下进行传代培养。
该技术可以用于研究不同类型的细胞生长特性、生理功能和分子机制。
在无血清条件下进行原代细胞培养可以避免血清成分对实验结果的影响，并且有助于减少非特异性因素对实验结果的干扰。
三、实验步骤1. 准备工作：将所需物品（包括培养皿、离心管、移液器、显微镜等）消毒，并将所有物品放置在无菌条件下。
2. 组织取样：选择需要研究的组织或器官，如肝脏、肺组织等，并将其切成小块。
3. 组织分离：将组织块放入含有酶类消化液（如胰蛋白酶）的培养皿中，将其放置在37℃的恒温培养箱中进行消化。
消化时间根据不同的组织类型而异，通常需要30分钟至1小时。
4. 细胞分离：将消化后的组织过筛，用离心管收集细胞沉淀，并用生理盐水洗涤。
5. 细胞培养：将细胞沉淀转移至含有完整培养基（如DMEM/F12）的无菌培养皿中，并加入适量的血清替代物（如B27），以促进细胞生长和增殖。
将培养皿放置在37℃、5% CO2、95%湿度的恒温培养箱中进行传代培养。
6. 细胞检测：通过显微镜观察细胞形态和数量变化，并使用MTT法或CCK-8法评估细胞增殖能力。
同时可以使用流式细胞术等技术对细胞进行表型和功能分析。
四、实验结果通过原代细胞培养实验，我们成功地从肺组织中分离出了一种类型的原代肺成纤维细胞（primary lung fibroblasts）。
在无血清条件下进行传代培养后，我们观察到细胞数量逐渐增加，并且细胞形态发生了明显的变化。
同时，我们使用MTT法评估了细胞增殖能力，并发现细胞在培养24小时后开始快速增殖，直到培养72小时时达到峰值。
此外，我们还使用流式细胞术对原代肺成纤维细胞进行了表型和功能分析，并发现其具有一定的合成和分泌基质蛋白的能力。
小鼠成纤维细胞原代培养
实验—小鼠成纤维细胞得原代培养一、实验目得１.掌握哺乳动物细胞原代培养与传代培养中得取材、消化及无菌操作等基本实验技术与操作过程。
2。
熟悉在倒置相差显微镜下观察培养细胞得形态与生长状况得方法．3。
了解细胞原代培养与传代培养得原理与方法。
二、实验原理自１７世纪下半叶Robｅrt Hooｋｅ提出“细胞"概念直至2０世纪中叶，细胞培养(Cell culture)才逐渐发展起来.现代生命科学以及相关领域得研究前提就是细胞得维持与增殖，因此,细胞培养不仅就是细胞生物学得密不可分得组成部分,而且已经成为生物化学、生物物理学、遗传学、免疫学、肿瘤学、生理学、分子生物学与神经科学、甚至临床医学得重要内容。
细胞培养也就是细胞生物学延伸至相关学科得一条主要途径。
如今,细胞培养已经成为生命科学与医学研究最常用得基础技术之一。
细胞培养就是模拟机体内生理条件,将细胞从机体中取出,在人工条件下,使其生存、生长、繁殖与传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题得研究。
细胞培养得直接目得就是维持或扩增细胞数量。
依据取材于动物组织或培养细胞,细胞培养分为原代培养与传代培养．1.原代培养(pｒimary culture)就是从供体取得组织或细胞后在体外进行首次培养直至成功地进行首次传代之前得培养。
但实际上通常把第一代至第十代以内得培养细胞统称为原代细胞培养.原代培养就是建立细胞系得第一步,其最基本得方法有两种：组织块培养法与消化培养法.组织块培养法就是指直接从机体取下组织与器官,通过组织块直接长出单层细胞,该培养法就是最常用得原代培养方法，其将刚刚离体得、生长活力旺盛得组织剪成小块接种在培养瓶中作为实验材料，一天后细胞可从贴壁得组织块四周游出并生长。
组织块培养法操作过程简便、易行,培养得细胞较易存活，适用于一些来源有限、数量较少得组织得原代培养。
消化培养法利用酶或机械方法将组织分散成单个细胞后，在不加任何粘附剂得情况下，直接移植在培养瓶壁上,加入培养基立即进行培养得方法。
细胞原代培养实验报告
细胞原代培养实验报告细胞原代培养实验报告细胞原代培养是一种常用的实验方法，用于研究细胞的生物学特性和功能。
本实验旨在通过原代培养的方式，观察和分析细胞在体外环境下的生长和变化。
我们选择了小鼠胚胎成纤维细胞作为实验对象，以下是实验的详细步骤和结果分析。
实验步骤：1. 细胞分离：将小鼠胚胎取出，用无菌PBS洗涤去除血液和其他污染物。
然后将胚胎组织切碎，并用胰酶和胆汁酸溶液进行消化。
最后通过过滤器筛选，获取单个细胞悬浮液。
2. 细胞培养：将细胞悬浮液转移到含有培养基的培养皿中，加入适量的血清和抗生素。
将培养皿放入恒温培养箱中，保持适宜的温度、湿度和二氧化碳浓度。
3. 细胞观察：每天观察细胞的生长情况，记录细胞数量和形态的变化。
使用显微镜观察细胞的形态和结构，拍摄照片以备后续分析。
4. 细胞传代：当细胞达到80-90%的密度时，使用胰酶和胆汁酸溶液将细胞从培养皿上剥离下来。
将细胞悬浮液转移到新的培养皿中，加入新的培养基，并按照相同的条件进行培养。
实验结果：在细胞培养的过程中，我们观察到小鼠胚胎成纤维细胞的生长和变化。
初始阶段，细胞悬浮液中的细胞数量较少，呈现单个细胞的状态。
随着培养时间的延长，细胞开始聚集成群，形成细胞聚落。
在观察细胞形态时，我们发现细胞呈现出典型的成纤维细胞形态特征。
细胞体积较小，形状呈椭圆或长条状，有较长的细胞突起。
细胞质呈现出丰富的胞浆，胞核位于细胞的中央位置。
随着细胞的传代，我们观察到细胞的增殖速度逐渐加快。
细胞密度逐渐增加，细胞聚落的大小也逐渐增大。
同时，我们还观察到细胞形态的变化，细胞突起的数量和长度有所增加。
实验讨论：细胞原代培养是一种常用的实验方法，可以用于研究细胞的生长、增殖和分化等生物学特性。
在本实验中，我们成功地将小鼠胚胎成纤维细胞进行原代培养，并观察到了细胞的生长和变化。
细胞的形态特征对于细胞的功能和特性具有重要的指示意义。
在本实验中，我们观察到小鼠胚胎成纤维细胞呈现出典型的成纤维细胞形态特征，这与之前的研究结果一致。
成纤维细胞原代分离
成纤维细胞原代分离
成纤维细胞原代分离是指从组织中分离出成纤维细胞并进行初次培养的过程。
成纤维细胞广泛存在于各种组织中，如皮肤、肌肉、内脏器官等，它们在生理和病理过程中具有重要作用。
原代分离成纤维细胞有助于研究其生物学特性、功能及在疾病发生发展中的作用。
成纤维细胞原代分离的具体步骤如下：
1.选择实验动物或组织来源：根据研究需要，选择合适的实验动物或组织来源。
例如，研究心脏成纤维细胞，可以选择新生小鼠心脏作为组织来源。
2.取材：从实验动物或组织中获取成纤维细胞所在的部分，如心脏、皮肤等。
3.酶消化：使用适当的酶（如胶原酶、胰蛋白酶等）分解组织，以暴露成纤维细胞。
酶消化过程中，需要控制温度、时间和酶的浓度，以保证细胞充分分离。
4.分离细胞：将酶消化后的组织悬液通过离心、过滤等方法，分离出成纤维细胞。
此过程中，应注意保持细胞活力，避免过度剪切和机械损伤。
5.培养：将分离出的成纤维细胞接种到培养皿或培养瓶中，加入适当的培养基，置于适当的培养条件（如温度、湿度、气体环境等）下进行原代培养。
此时，成纤维细胞会开始生长、繁殖。
6.观察与检测：在培养过程中，通过倒置显微镜观察细胞形态、数量、生长速度等，以评估分离效果和细胞活力。
此外，还可以采用特定方法（如免疫细胞化学、细胞计数等）对细胞进行鉴定和功能研究。
成纤维细胞原代分离的成功与否取决于实验设计、操作技巧和细胞生物学知识。
为了获得高活力的成纤维细胞，需要在实验过程中严格控制条件，并熟练掌握相关技术。
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【victoh】不同来源的成纤维细胞在不同培养支撑介质上的贴壁时间应该是不一样的，此外也还受到其他一些因素的影响，至于上皮细胞，其本身种类就更加复杂了
上皮细胞
【warmbull】我现在正在做的培养，但发现有几瓶细胞可能是被成纤维细胞（长梭形、透明细胞）污染了，后来成纤维细胞抑制了色素上皮细胞的生长。现在又出现了这种情况，请问各位大侠，有什么办法可以除去杂细胞？还有，我养的色素上皮细胞生长增殖很缓慢，有的甚至慢慢萎缩，会是什么原因呢？
方法：
1.取材：4～6ｗＷｉｓｔａｒ大鼠,大剂量2%戊巴比妥钠麻醉处死，将处死后的大鼠浸入75%酒精中，放入超净台。在无菌状态下剪开胸腹腔，分离胸主动脉,用2ｍｌ注射器从主动脉弓处向胸主动脉注入D-Hank’s液,驱除残血,取主动脉弓至肾动脉一段，两端结扎剪断，放入60℃预热无菌水中2秒。然后置于准备好的RPMi1640培养基（含双抗）中。
【cl1202】我在SD大鼠胃粘膜壁细胞原代培养的文献中看到的：成纤维细胞大量生长是壁细胞分离培养失败的常见原因。培养基中加入血清会刺激成纤维细胞而抑制壁细胞生长，对壁细胞可能还有一定的毒性作用。为了减少成纤维细胞的生长，先加入含有胎牛血清（100ml/L）的培养液，时差贴壁30-45分钟，除去成纤维细胞，然后再换用无血清的培养液进行培养。不知道你有没有用？试试吧。
内皮细胞
【benn】看到园子里有好多同仁培养大鼠主动脉内皮细胞,我也在做内皮细胞培养,现在看到一种新的大鼠主动脉内皮细胞的培养方法,正在摸索中,说出来与大家讨论.
材料与方法：
材料:
1.培养皿、培养瓶、烧瓶、试管，玻璃针等。
2.眼科剪、眼科镊、手术刀片。
3.5%CO2孵箱、PH计。
4.恒温水浴箱。
5.RPMi1640培养基，D-Hank’s缓冲液、胎牛血清，内皮生长因子（ECGF），青霉素，链霉素,戊巴比妥钠等。
【sxtyzyq2】买sigma公司的brdu然后把它配成终浓度为1 mmol/l然后1ml培养液中加入5微升就可抑制成纤维细胞
【gfeng8078】我是养心肌原代，也需要抑制成纤维细胞，请问各位大侠，5-brdu用多大的浓度？
【cheerfulness】养心肌原代最初24h培养液中加入终浓度为0.1mmol/L的brdu
胰岛细胞
【genobody】大鼠胰岛细胞原代培养
一周龄Wistar大鼠，断颈处死，于75%乙醇浸泡15分钟，无菌取出胰脏，于冰冷无菌D-Hanks液中漂洗，用眼科剪仔细清除脂肪、包膜、血管等胰外组织，转入青霉素小瓶中，加入少量无菌D-Hanks液，用眼科剪剪成0.1-1.0mm3大小的碎片，用滴管轻轻吸出上层细小脂肪碎块和油滴，再用无菌D-Hanks液反复清洗8~10次，加入10倍体积无菌消化酶液[胰蛋白酶-胶原酶消化液：0.05g胰蛋白酶(Sigma)，0.025gⅤ型胶原酶(Sigma，663U/mg)，0.05g葡萄糖，溶于100 mL无Ca2+、Mg2+的0.01mol/LPBS（pH值为7.4）溶液，用0.22μm微孔滤膜滤菌]，38℃±1℃消化，消化过程中不断震荡，10分钟后吸出上面酶液弃去，用无菌D-Hanks液将组织块清洗2~3次，加入新鲜酶液继续消化，重复上述步骤。此时组织块边缘模糊，再将组织块浸入消化酶液中，38℃±1℃消化10分钟，将消化酶液与组织块分开，组织块重新加入新鲜消化酶液进行消化；而原消化酶液1500rpm离心10分钟，取沉淀即为消化下的细胞，重新用无菌D-Hanks悬浮，离心，重复1~2次，再用培养基洗2~3次，用培养基悬浮即得细胞悬液；将消化过的组织块重复消化5~6次至组织块消化完全，重复以上操作，合并几次所得细胞悬液，计数，调整细胞浓度为2×105个细胞/mL，将细胞悬液接种于24孔塑料培养板中，每孔1mL，置于37℃，5%CO2，饱和湿度培养箱中培养。由于成纤维细胞贴壁要比胰岛细胞迅速，接种15小时后，轻轻振荡培养板，将上面未贴壁的细胞接入新的培养板中，可除去部分成纤维细胞。将新培养板中细胞培养48小时后，换新鲜配置的含有2.5ng/mL的碘乙酸的培养基培养5小时，可除去绝大部分成纤维细胞，而胰岛细胞不受伤害，换不含碘乙酸的培养基洗2次，并换不含碘乙酸的培养基在37℃，5%CO2，饱和湿度培养箱中培养，每隔3天换培养液，获得单层胰岛细胞，
【pigpig】曾经看过一篇论著，具体名字记不清了，里面从分子和蛋白水平论证了视网膜色素上皮细胞传代4代以后基本没有RPE原有性质特征，只具有成纤维细胞的特征。
【qkk1229】同意N代后就是成纤维细胞的模样，很多细胞体外培养到后来，都长的象成纤维细胞，不知道为什么，有人知道吗？
【jamesxia】去除成纤维细胞
2.剪切：在超净台上，将血管置于培养皿中,用眼科镊小心剥离外膜面的结缔组织,并从根部剪去所有肋间动脉。无血清培养基冲洗数遍,去除残血后,将动脉转移至另一含少量培基的无菌培养皿中，用刀片将主动脉两末端切去,剩下的主动脉切成宽1～1.5ｍｍ的环。
（2）机械划除法
原代培养成功后，上皮细胞和成纤维细胞所数都同时出现，混杂生长。这种混杂生长常常分区成片，每种细胞都以小片或区域性分布的方式生长在瓶壁上。因此可以采用机械的方法去除不需要的细胞。
（3）反复贴壁法
成纤维细胞与上皮细胞相比，其贴壁过程快，大部分细胞常能在短时间内大约10－30min完成附着过程，而上皮细胞大部分在短时间内不能附着或附着不稳定，稍加振荡即浮起，这样可以利用此差别来纯化细胞。
成纤维型细胞：在培养中的细胞凡形态与成纤维细胞类似时，皆可称之为成纤维细胞。本型细胞由形态与体内成纤维细胞的形态相似而得名，细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长，细胞中央有卵园形核，胞质向外伸出2-3厘米个长短不同的突起，除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间质起源的组织细胞常呈本类形态生长。
培养细胞的纯化
【windboy77】乳鼠心肌细胞属于原代生长细胞，培养过程较为繁琐。文献上有多种浓度胰酶消化方法，我们在试验中摸索到0.06％浓度的胰酶对细胞损害较小，比起一些文献记载的0.15％浓度有一定的优越性，但这个浓度消化所需时间较长，所以我们又采取多次反复低浓度消化的方法，每次消化一些后，用吸管抽取出上清液，离心所得即为心肌细胞。利用心肌细胞和成纤维细胞贴壁时间的不同,采用差速贴壁1 h,除去成纤维细胞，达到纯化的目的。成纤维细胞胞体呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。很好和心肌细胞鉴别。
【我是小米2】培养细胞的纯化：
1、自然纯化
即利用某一种类细胞的增殖优势，而排挤其他细胞生长，靠自然的增值潜力最后留下生长优势细胞，去除其他细胞。有些恶性肿瘤细胞可以通过此方法，自然纯化建立细胞系。
2、人工纯化
（1）酶消化法
在消化培养细胞时，常是成纤维细胞先脱壁，而上皮细胞要消化相当长的时间才脱壁，特别是在原代培养和培养早期这种差别尤为明显，因而可以利用这种差异采用多次差别消化方法将上皮细胞和成纤维细胞分开。
【ccyy30】这种方法是否就是差速贴壁法，膜插片指的是多聚赖氨酸包被培养板吗
星形胶质细胞
【gaowei98755】我养过星形胶质细胞，我感觉想避免成纤维细胞的污染，需要注意两方面：1，取材时一定要将脑膜、血管等结构彻底除去，宁可少留些脑组织，也要将杂质（权且这样说，即其他结缔组织）去除干净。2，差速贴壁法，可以将细胞先差速贴壁20~30分钟，将成纤维细胞去除，然后再将细胞悬液接种到其他瓶中，培养。这两种方法可以联合使用，也可以只用第一种方法即可
1、反复贴壁法（差速贴壁法）：倒去旧培养液，用Hank′s液洗3次，然后加入消化液（0.2%EDTA+0.25%胰蛋白酶），37℃10min，镜下可见成纤维细胞成圆形，癌细胞维持原状。吸出消化液，加Hank′s液吹打细胞使成纤维细胞脱落，吸出旧液，组织块和癌细胞团用Hank′s液轻轻漂洗3次。加入培养液CO2孵箱，37℃，每周换液1次，处理1次。
猫耳朵】乳鼠心肌细胞培养
尽量除去杂质细胞：现在一般的做法是：将消化完全的细胞悬液先在大的培养瓶中培养1~2小时，然后再小心的吸出仍然悬浮的心肌细胞，再接种到6孔或24孔板上。这样做主要是尽量除去成纤维细胞。由于成纤维细胞贴壁迅速，而心肌通常在4h后才开始贴壁，这样才能尽量利用差速贴壁法除去成纤维细胞。
2、血清浓度，上皮细胞耐受低血清环境的能力较强，而成纤维细胞的耐受力较差，利用这个差异，用含1.5%血清的培养液可以降低培养物中成纤维细胞的生长。
垂体细胞
【ccyy30】我在胚胎大鼠腺垂体细胞的原代培养中发现有好多的成纤维细胞和神经细胞，如何纯化【luoyangu】原代培养中要除去较多的成纤维细胞，在接种细胞于膜插片前，按1～５*１０的５次方个／ml的细胞密度接种到大约5ml单个细胞悬液到２５立方厘米培养瓶中，原代培养２天后，不经胰酶消化，通过吹打收获漂浮的细胞和被分散的细胞，离心（１５００转／分，１０分钟），再用培养液将细胞沉淀重新悬浮成细胞悬液，然后接种在膜插片上，这样可以除去黏附的成纤维细胞而保留要的细胞．
（4）克隆法
采用细胞克隆法将细胞分成单个细胞，使之分别生长成克隆，选择出所需要的克隆。
（5）培养及限定方法
某些细胞在生长过程中必须存在或必须去除某种物质，否则无法生长，可以利用这种技术来纯化细胞。
（6）流式分选
brdu
【sxtyzyq2】除了Brdu能用于抑制成纤维细胞的生长，便宜易买到的
【snany】阿糖孢苷效果不是特别理想
心肌细胞
【gmwang1991】心肌细胞本来就是不容易贴壁的细胞，在除去心肌细胞中混杂的成纤维细胞和内皮细胞就是利用成纤维细胞和内皮细胞贴壁快而心肌细胞贴壁慢的原理进行换皿法来纯化心肌细胞的。换皿后最好48小时内对你所培养的心肌细胞不进行任何处理，包括观察，这样应该没有问题了。如果还是不能够贴壁的话，你可以考虑一下用塑料瓶，或者对培养用的玻璃瓶进行如下处理：在培养前进行鼠尾胶原包被或者硝酸蚀刻或者纤粘连蛋白包被，在这方面有许多文献报道的，你只需要注意看都会有解决办法的。