原代培养中成纤维细胞的抑制

1、反复贴壁法（差速贴壁法）：倒去旧培养液，用Hank′s液洗3次，然后加入消化液（0.2%EDTA+0.25%胰蛋白酶），37℃10min，镜下可见成纤维细胞成圆形，癌细胞维持原状。吸出消化液，加Hank′s液吹打细胞使成纤维细胞脱落，吸出旧液，组织块和癌细胞团用Hank′s液轻轻漂洗3次。加入培养液CO2孵箱，37℃，每周换液1次，处理1次。
方法：
1.取材：4～6ｗＷｉｓｔａｒ大鼠,大剂量2%戊巴比妥钠麻醉处死，将处死后的大鼠浸入75%酒精中，放入超净台。在无菌状态下剪开胸腹腔，分离胸主动脉,用2ｍｌ注射器从主动脉弓处向胸主动脉注入D-Hank’s液,驱除残血,取主动脉弓至肾动脉一段，两端结扎剪断，放入60℃预热无菌水中2秒。然后置于准备好的RPMi1640培养基（含双抗）中。
2、血清浓度，上皮细胞耐受低血清环境的能力较强，而成纤维细胞的耐受力较差，利用这个差异，用含1.5%血清的培养液可以降低培养物中成纤维细胞的生长。
垂体细胞
【ccyy30】我在胚胎大鼠腺垂体细胞的原代培养中发现有好多的成纤维细胞和神经细胞，如何纯化【luoyangu】原代培养中要除去较多的成纤维细胞，在接种细胞于膜插片前，按1～５*１０的５次方个／ml的细胞密度接种到大约5ml单个细胞悬液到２５立方厘米培养瓶中，原代培养２天后，不经胰酶消化，通过吹打收获漂浮的细胞和被分散的细胞，离心（１５００转／分，１０分钟），再用培养液将细胞沉淀重新悬浮成细胞悬液，然后接种在膜插片上，这样可以除去黏附的成纤维细胞而保留要的细胞．
猫耳朵】乳鼠心肌细胞培养
尽量除去杂质细胞：现在一般的做法是：将消化完全的细胞悬液先在大的培养瓶中培养1~2小时，然后再小心的吸出仍然悬浮的心肌细胞，再接种到6孔或24孔板上。这样做主要是尽量除去成纤维细胞。由于成纤维细胞贴壁迅速，而心肌通常在4h后才开始贴壁，这样才能尽量利用差速贴壁法除去成纤维细胞。
【sdf771214】请问成纤维细胞的帖壁时间一般是多少?我养的是内皮细胞,如何时差帖壁啊?
【victoh】不同来源的成纤维细胞在不同培养支撑介质上的贴壁时间应该是不一样的，此外也还受到其他一些因素的影响，至于上皮细胞，其本身种类就更加复杂了
上皮细胞
【warmbull】我现在正在做的培养，但发现有几瓶细胞可能是被成纤维细胞（长梭形、透明细胞）污染了，后来成纤维细胞抑制了色素上皮细胞的生长。现在又出现了这种情况，请问各位大侠，有什么办法可以除去杂细胞？还有，我养的色素上皮细胞生长增殖很缓慢，有的甚至慢慢萎缩，会是什么原因呢？
【wangtsy】胰岛的分离与纯化
取新生1-3天SD大鼠10-15只，无菌条件下剖腹取出胰腺置入无菌培养皿中，用眼科剪去除非胰腺组织，4℃Hanks液清洗三次后，用眼科剪反复剪切至<0.5mm3组织块，取浓度为1g/L的V型胶原酶溶液5-10ml与之混合,转入三角烧瓶中，于37℃恒温水浴振荡器消化30-40min，加入两倍体积4℃Hanks液终止消化，用吸管反复吹吸后过80目筛网，滤液以800rpm低速离心70s去上清液，并用4℃Hank's液低速离心清洗2次，除去单个腺泡及上皮细胞。加入含2.5mg/L碘乙酸的PRMI1640完全培养基（含10%胎牛血清、10mmol/L HEPES缓冲液、1mmol/L丙酮酸钠、100000u/L青霉素G钾、100mg/L链霉素、71.5umol/L β-巯基乙醇）中制成细胞悬液,接种于75ml玻璃培养瓶中,于37℃,5%CO2,95%空气条件下培养5h后，用无血清培养基低速离心清洗3次,以除去成纤维细胞。然后用正常完全培养基培养24h，转瓶弃去贴壁细胞，用无血清培养液低速离心洗涤两次，沉淀物即为纯化胰岛。再用PRMI1640完全培养基养吧，可长成胰岛单层细胞。
【cl1202】我在SD大鼠胃粘膜壁细胞原代培养的文献中看到的：成纤维细胞大量生长是壁细胞分离培养失败的常见原因。培养基中加入血清会刺激成纤维细胞而抑制壁细胞生长，对壁细胞可能还有一定的毒性作用。为了减少成纤维细胞的生长，先加入含有胎牛血清（100ml/L）的培养液，时差贴壁30-45分钟，除去成纤维细胞，然后再换用无血清的培养液进行培养。不知道你有没有用？试试吧。
【pigpig】曾经看过一篇论著，具体名字记不清了，里面从分子和蛋白水平论证了视网膜色素上皮细胞传代4代以后基本没有RPE原有性质特征，只具有成纤维细胞的特征。
【qkk1229】同意N代后就是成纤维细胞的模样，很多细胞体外培养到后来，都长的象成纤维细胞，不知道为什么，有人知道吗？
【jamesxia】去除成纤维细胞
【windboy77】乳鼠心肌细胞属于原代生长细胞，培养过程较为繁琐。文献上有多种浓度胰酶消化方法，我们在试验中摸索到0.06％浓度的胰酶对细胞损害较小，比起一些文献记载的0.15％浓度有一定的优越性，但这个浓度消化所需时间较长，所以我们又采取多次反复低浓度消化的方法，每次消化一些后，用吸管抽取出上清液，离心所得即为心肌细胞。利用心肌细胞和成纤维细胞贴壁时间的不同,采用差速贴壁1 h,除去成纤维细胞，达到纯化的目的。成纤维细胞胞体呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。很好和心肌细胞鉴别。
【gfeng8078】你是怎么样达到0.1mmol/L的浓度呀，由于有培养液的存在，加了Brdu进去，自然就稀释了？我想把Brdu溶解于DMEM中然后一起抽滤，可是有报道说这对Brdu的药效有影响
【jiangbin1230】请问用组织块贴壁法能培养出肠的成纤维细胞吗？我试过很多次了，一个皿就只有零散的一二十个成纤维细胞，都是柱状上皮细胞，是否由于正常组织太少不能培养出啊？能帮帮忙吗？
成纤维型细胞：在培养中的细胞凡形态与成纤维细胞类似时，皆可称之为成纤维细胞。本型细胞由形态与体内成纤维细胞的形态相似而得名，细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长，细胞中央有卵园形核，胞质向外伸出2-3厘米个长短不同的突起，除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间质起源的组织细胞常呈本类形态生长。
培养细胞的纯化
2.剪切：在超净台上，将血管置于培养皿中,用眼科镊小心剥离外膜面的结缔组织,并从根部剪去所有肋间动脉。无血清培养基冲洗数遍,去除残血后,将动脉转移至另一含少量培基的无菌培养皿中，用刀片将主动脉两末端切去,剩下的主动脉切成宽1～1.5ｍｍ的环。
【ccyy30】这种方法是否就是差速贴壁法，膜插片指的是多聚赖氨酸包被培养板吗
星形胶质细胞
【gaowei98755】我养过星形胶质细胞，我感觉想避免成纤维细胞的污染，需要注意两方面：1，取材时一定要将脑膜、血管等结构彻底除去，宁可少留些脑组织，也要将杂质（权且这样说，即其他结缔组织）去除干净。2，差速贴壁法，可以将细胞先差速贴壁20~30分钟，将成纤维细胞去除，然后再将细胞悬液接种到其他瓶中，培养。这两种方法可以联合使用，也可以只用第一种方法即可
胰岛细胞
【genobody】大鼠胰岛细胞原代培养
一周龄Wistar大鼠，断颈处死，于75%乙醇浸泡15分钟，无菌取出胰脏，于冰冷无菌D-Hanks液中漂洗，用眼科剪仔细清除脂肪、包膜、血管等胰外组织，转入青霉素小瓶中，加入少量无菌D-Hanks液，用眼科剪剪成0.1-1.0mm3大小的碎片，用滴管轻轻吸出上层细小脂肪碎块和油滴，再用无菌D-Hanks液反复清洗8~10次，加入10倍体积无菌消化酶液[胰蛋白酶-胶原酶消化液：0.05g胰蛋白酶(Sigma)，0.025gⅤ型胶原酶(Sigma，663U/mg)，0.05g葡萄糖，溶于100 mL无Ca2+、Mg2+的0.01mol/LPBS（pH值为7.4）溶液，用0.22μm微孔滤膜滤菌]，38℃±1℃消化，消化过程中不断震荡，10分钟后吸出上面酶液弃去，用无菌D-Hanks液将组织块清洗2~3次，加入新鲜酶液继续消化，重复上述步骤。此时组织块边缘模糊，再将组织块浸入消化酶液中，38℃±1℃消化10分钟，将消化酶液与组织块分开，组织块重新加入新鲜消化酶液进行消化；而原消化酶液1500rpm离心10分钟，取沉淀即为消化下的细胞，重新用无菌D-Hanks悬浮，离心，重复1~2次，再用培养基洗2~3次，用培养基悬浮即得细胞悬液；将消化过的组织块重复消化5~6次至组织块消化完全，重复以上操作，合并几次所得细胞悬液，计数，调整细胞浓度为2×105个细胞/mL，将细胞悬液接种于24孔塑料培养板中，每孔1mL，置于37℃，5%CO2，饱和湿度培养箱中培养。由于成纤维细胞贴壁要比胰岛细胞迅速，接种15小时后，轻轻振荡培养板，将上面未贴壁的细胞接入新的培养板中，可除去部分成纤维细胞。将新培养板中细胞培养48小时后，换新鲜配置的含有2.5ng/mL的碘乙酸的培养基培养5小时，可除去绝大部分成纤维细胞，而胰岛细胞不受伤害，换不含碘乙酸的培养基洗2次，并换不含碘乙酸的培养基在37℃，5%CO2，饱和湿度培养箱中培养，每隔3天换培养液，获得单层胰岛细胞，
（4）克隆法
采用细胞克隆法将细胞分成单个细胞，使之分别生长成克隆，选择出所需要的克隆。
（5）培养及限定方法
某些细胞在生长过程中必须存在或必须去除某种物质，否则无法生长，可以利用这种技术来纯化细胞。
（6）流式分选
brdu
【sxtyzyq2】除了Brdu能用于抑制成纤维细胞的生长，便宜易买到的
【snany】阿糖孢苷效果不是特别理想
【我是小米2】培养细胞的纯化：
1、自然纯化
即利用某一种类细胞的增殖优势，而排挤其他细胞生长，靠自然的增值潜力最后留下生长优势细胞，去除其他细胞。有些恶性肿瘤细胞可以通过此方法，自然纯化建立细胞系。
2、人工纯化ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
（1）酶消化法
在消化培养细胞时，常是成纤维细胞先脱壁，而上皮细胞要消化相当长的时间才脱壁，特别是在原代培养和培养早期这种差别尤为明显，因而可以利用这种差异采用多次差别消化方法将上皮细胞和成纤维细胞分开。
【叶知秋】上皮细胞传代次数多后，其形态就类似成纤维细胞，你也可以爬片作细胞鉴定，了解有无污染情况。生长缓慢除提高血清浓度外，还可以增加换液次数，及时分瓶传代。
【yhdy2001】你可以试着用高糖培养基，这样细胞增殖快，目前国外和国内较大的细胞研究所普遍采用高糖培养基；另外，做原代时取材很关键，尽量避免筋膜等组织的污染
内皮细胞
【benn】看到园子里有好多同仁培养大鼠主动脉内皮细胞,我也在做内皮细胞培养,现在看到一种新的大鼠主动脉内皮细胞的培养方法,正在摸索中,说出来与大家讨论.
材料与方法：
材料:
1.培养皿、培养瓶、烧瓶、试管，玻璃针等。
2.眼科剪、眼科镊、手术刀片。
3.5%CO2孵箱、PH计。
4.恒温水浴箱。
5.RPMi1640培养基，D-Hank’s缓冲液、胎牛血清，内皮生长因子（ECGF），青霉素，链霉素,戊巴比妥钠等。
【sxtyzyq2】买sigma公司的brdu然后把它配成终浓度为1 mmol/l然后1ml培养液中加入5微升就可抑制成纤维细胞
【gfeng8078】我是养心肌原代，也需要抑制成纤维细胞，请问各位大侠，5-brdu用多大的浓度？
【cheerfulness】养心肌原代最初24h培养液中加入终浓度为0.1mmol/L的brdu
心肌细胞
【gmwang1991】心肌细胞本来就是不容易贴壁的细胞，在除去心肌细胞中混杂的成纤维细胞和内皮细胞就是利用成纤维细胞和内皮细胞贴壁快而心肌细胞贴壁慢的原理进行换皿法来纯化心肌细胞的。换皿后最好48小时内对你所培养的心肌细胞不进行任何处理，包括观察，这样应该没有问题了。如果还是不能够贴壁的话，你可以考虑一下用塑料瓶，或者对培养用的玻璃瓶进行如下处理：在培养前进行鼠尾胶原包被或者硝酸蚀刻或者纤粘连蛋白包被，在这方面有许多文献报道的，你只需要注意看都会有解决办法的。
（2）机械划除法
原代培养成功后，上皮细胞和成纤维细胞所数都同时出现，混杂生长。这种混杂生长常常分区成片，每种细胞都以小片或区域性分布的方式生长在瓶壁上。因此可以采用机械的方法去除不需要的细胞。
（3）反复贴壁法
成纤维细胞与上皮细胞相比，其贴壁过程快，大部分细胞常能在短时间内大约10－30min完成附着过程，而上皮细胞大部分在短时间内不能附着或附着不稳定，稍加振荡即浮起，这样可以利用此差别来纯化细胞。