成纤维细胞原代培养
人牙龈成纤维细胞原代培养
人牙龈成纤维细胞原代培养
人牙龈成纤维细胞原代培养是指从人牙龈组织中分离出的成纤维细胞在体外的培养过程。
具体步骤如下：
1. 采集人牙龈组织样本，通常通过牙龈刮片或手术切取进行采集。
2. 将采集到的组织样本放入含有抗生素和抗真菌药物的培养基中，以避免污染。
3. 组织样本经过消化酶的处理，将细胞从组织中分离出来。
4. 将分离出的细胞转移到含有营养物质和生长因子的培养基中。
5. 在适当的温度、湿度和二氧化碳条件下，将细胞培养在细胞培养箱中。
6. 观察和检测细胞的生长状态，通常通过显微镜观察细胞形态、细胞数量和细胞活力等指标。
7. 经过一段时间的培养，当细胞达到足够数量时，可以进行细胞传代，即将细胞从原培养瓶中转移到新的培养瓶中，以保证细胞的正常生长和建立永久细胞库。
人牙龈成纤维细胞原代培养可以用于研究人牙龈组织的生理和病理过程，以及在临床牙周疾病和牙体牙髓疾病的治疗中的应用。
小鼠胚胎成纤维细胞原代培养实验具体步骤及方法
小鼠胚胎成纤维细胞原代培养实验具体方法及步骤将小鼠的胚胎成纤维细胞（MEF）从机体中取出，经胰酶、螯合剂（常用EDTA）处理，分散成单细胞，置MEF生长培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。
一、实验材料准备1. 动物孕期14至16天的孕鼠(小鼠)。
2. 试剂无Ca2+和Mg2+的PBS(D-PBS)、0.05%胰酶、0.53 mmol/L EDTA溶液、MEF生长培养基(高糖DMEM加10%FBS)。
3. 器械眼科直剪3把、眼科直镊3把、眼科弯镊2把、玻璃平皿3套、200目尼龙滤网、50 ml 和15 ml离心管和手术刀片。
以上物品均需要高压灭菌消毒处理。
二、具体操作1. 处死孕鼠，全身置于75%酒精里浸泡，然后在超净台中用剪刀和镊子将孕鼠皮肤剪开，用另外一组剪刀、镊子剪开腹部肌层，露出子宫，最后用第三组剪刀和镊子将子宫小心取出放在盛有D-PBS的玻璃平皿中，冲洗去血。
2. 用两把弯镊子将胚胎外的胞膜小心去除，然后夹掉头和内脏，将其余胚胎转移到一个装有30 ml D-PBS的50 ml离心管中，轻轻颠倒两次，倒掉D-PBS，再重复此步骤一次，注意要留少许D-PBS，然后将胚胎转移到另一装有D-PBS的平皿中，并用手术刀片将其细细切碎。
3. 用200 ul的移液枪反复、快速地吹打平皿中的液体，转移至15 ml离心管中，于4℃1500 rpm离心5分钟，倒掉上清，以10 ml胰酶重悬沉淀，放在37℃水浴中消化30分钟，且每隔五分钟轻轻晃动，使之充分消化。
4. 将上层细胞悬液倒入一个装有10 ml MEF生长培养基的50 ml离心管中，用200目的尼龙网过滤后，以1 500 rpm离心5分钟收集细胞，再用30 ml MEF生长培养基洗涤两次。
5. 细胞沉淀用15 ml MEF生长培养基重悬后进行细胞计数(一般8只14天的胎鼠可获得2-3x107细胞)。
6. 3x106细胞悬浮于15 ml MEF生长培养基中，接种到200 ml培养瓶中。
心脏成纤维细胞原代细胞培养
乳鼠心肌成纤维细胞分离与培养一、实验动物1~3日龄C57小鼠乳鼠10只。
二、试剂及配制高糖DMEM( gibco)、Ⅰ型胶原酶（MP）、0.25%胰蛋白酶(solarbo公司), 胎牛血清（gibco 160000-044）、青霉素-链霉素混合液（solarbo）。
培养液: DMEM培养基：FBS：双抗 100：10：1（45ml：5ml：0.5ml）酶消化液:将胰蛋白酶用PBS缓冲液(pH 7.2 ～ 7.4)稀释, 配成0.1%胰蛋白酶消化液;将Ⅰ型胶原酶溶于PBS缓冲液(pH 7.2 ～ 7.4)中, 配成0.1%的胶原酶消化液。
0.1%胰蛋白酶及01% Ⅰ型胶原酶以2∶1混合, 现配现用。
三、实验仪器超净工作台、CO2培养箱、光学倒置显微镜、离心机……四、组织消化和分离细胞1、将乳鼠于75%乙醇缸中浸泡5ｓ, 转移至超净台。
用大头针将其固定在无菌的泡沫板上, 用聚维酮碘消毒胸、腹部皮肤。
2、取2把弯镊子撕开皮肤, 充分撕拉开, 再用乙醇棉签消毒。
用眼科虹膜剪在剑突处正中线稍偏左向上开胸后用剪子压住胸骨右缘, 使心脏自然跳出, 用弯镊子勾住心脏根部, 取出心脏, 置于盛预冷PBS液的培养皿中。
3、将鼠心脏全部取出后, 剪去心房、剔除心脏上结缔组织、脂肪及血管, 预冷ＰＢＳ液清洗3次, 去除血污。
4、将心脏剪成约1mm ×1mm×1mm的组织块, 刮入加有搅拌子的锥形瓶中, 酶消化液冲洗剪刀及培养皿, 转移至锥形瓶中。
5、加入孵育过的酶消化液为心肌组织的5倍, 37 ℃水浴, 打开磁力搅拌器, 60r/min搅拌10min, 吸管轻轻吹打组织块1min分散细胞, 自然沉降2min后遗弃上清液。
6、再次加入消化酶液8～15ml消化8min。
五、培养细胞1、吸取上清液入离心管, 加入预冷培养液2ml, 吹打均匀后, 1 200r/min离心4min, 弃上清, 细胞沉淀加预冷的培养液吹打后成细胞悬液用封口膜封口放于冰中备用。
成年小鼠心肌成纤维细胞的分离和原代培养
成年小鼠心肌成纤维细胞的分离和原代培养物品准备：6-8周成年小鼠、眼科剪、眼科镊、75%酒精、PBS缓冲液、细胞培养皿、细胞培养瓶、15ml细胞离心管、恒温水平摇床、低速水平离心机、倒置显微镜、DMEM/F12细胞培养基、胎牛血清、胶原酶II、胰蛋白酶等。
操作步骤：（1）取出2只成年小鼠心脏，并将它们置于含有冰冷的PBS的培养皿中。
（2）将心脏置于无菌细胞培养皿中，并在无菌条件下进行操作。
使用剪刀将心脏切成10块，使用解剖刀将它们缩小至1mm的尺寸。
（3）将组织小块移到盛有PBS的无菌细胞培养皿中，清洗后弃去PBS。
（4）加入2ml消化缓冲液并在37℃恒速水平摇床下消化组织5分钟。
注意：摇床速度应调整至80r，以使所有组织片流动并且不会坐在底部，但不应太强以至不能破坏细胞。
消化酶（胶原酶II: 1mg/ml，胰酶: 0.75mg/ml）（5）将混合物放置1分钟，使组织沉淀并丢弃含有碎片和血细胞的上清液。
（6）加入2ml消化缓冲液并在37℃恒速水平摇床下消化组织30分钟。
（7）将混合物放置１分钟使组织沉淀到底部，并用移液管收集上清液。
不要收集倾向于漂浮的组织碎片。
（8）将上清放入含有2ml成纤维细胞培养基的15ml细胞离心管中。
（9）800r，离心5min。
（10）将细胞重悬于3-4ml培养基中。
（11）重复步骤6-10，直到所有组织溶解（通常7-10次）。
（12）将细胞悬液平铺到细胞培养皿瓶中，并在37℃下在具有5%二氧化碳的细胞培养箱中培养２小时。
（13）２ｈ后显微镜下观察细胞汇合。
此时成纤维细胞类似于小圆点。
（14）收集并丢弃上清液。
用2.5ml温热的PBS洗涤３次，并用10ml 新鲜的成纤维细胞培养基补充。
在37℃和5%二氧化碳的细胞培养箱中培养。
原代成纤维细胞培养基配方
原代成纤维细胞培养基配方1.引言1.1 概述成纤维细胞是一类常见的细胞，广泛存在于人体各个组织中，包括皮肤、血管、肌肉和内脏等。
在细胞培养技术的发展过程中，原代成纤维细胞培养基的配方变得越来越重要。
原代成纤维细胞培养基是一种提供养分和适宜环境的培养液，可以维持原代成纤维细胞的生长和增殖。
原代成纤维细胞培养基的配方包括多种关键成分，如培养基基础成分、生长因子、附加物等。
不同的组分可以提供细胞所需的营养和信号物质，使细胞能够在体外环境下继续生长和繁殖。
原代成纤维细胞培养基配方的研究对于细胞生物学、组织工程和再生医学等领域具有重要意义。
通过优化培养基的配方，可以提高原代成纤维细胞的增殖速度和存活率，同时改善其功能和特性，为细胞研究和临床应用提供更好的工具和基础。
然而，目前关于原代成纤维细胞培养基的配方研究还比较有限。
不同实验室和研究者之间存在着很大的差异，配方的选择和调整仍然依赖经验和试错。
因此，进一步的研究和探索仍然是十分必要和迫切的。
本文将深入探讨原代成纤维细胞培养基配方的概念和重要性。
我们将详细介绍培养基的组成、各种成分的作用机制，并总结现有研究的进展和局限性。
最后，我们将展望未来的研究方向，希望通过进一步的研究和探索，为原代成纤维细胞培养基的配方优化和应用提供更好的指导和支持。
1.2 文章结构文章结构部分的内容可以包括以下内容：文章结构部分的主要目的是为读者提供对整篇文章的摘要和框架。
通过描述文章的组织结构，读者可以更好地理解文章的内容和逻辑顺序。
首先，本文将介绍原代成纤维细胞培养基的概念和重要性。
这一部分将讨论成纤维细胞在生物医学和生命科学研究中的重要作用，以及为什么培养基对于细胞培养的成功和细胞功能的研究是至关重要的。
其次，本文将详细介绍原代成纤维细胞培养基的组成。
这一部分将讨论培养基中各种组分的作用和功能，如营养物质、生长因子、酶和血清的添加等。
读者将了解到培养基中各种组分的重要性和对细胞生长和功能的影响。
乳鼠心肌细胞和心脏成纤维细胞的原代培养
１ ３ 实验 仪 器 超 净 工 作 台 （ 海 浦 东 物 理 光 学 ． 上
仪器 厂 ） Ｃ 培养 箱 （ 国 Ｓ Ｅ ＬＬ Ｂ公 司 ） 普 、Ｏ 美 Ｈ Ｌ Ａ 、
通光 学显微 镜 （ 日本 Ｏ ｙ ｕ ） 离心 机 （ 大利 Ａ Ｃ ｌ ｍｐ ｓ 、 意 Ｌ 公 司） 。 等
胎 牛血清 为接 种培养 液 ， 加入 １ ％新 生 牛 血清 为 交 ０
换 培养液 。酶 消化液 ： 将胰 蛋 白酶溶 于 Ｐ Ｓ缓 冲液 Ｂ （ Ｈ ７ ２～ ． ） ， ｐ ． ７ ４ 中 配成 ０ １ ． ％胰 蛋 白酶 消化 液 ； 将
Ｉ 型胶原 酶 溶 于 Ｐ Ｓ缓 冲 液 （ Ｈ ７２～７４ 中 ， Ｂ ｐ ． ． ） 配 成 ０ ０ ％ 的 胶 原 酶 消 化 液 。０ １ 胰 蛋 白 酶 及 ．８ ．％
１４ 方 法 ．
维细胞 培养 常存 在 污染 、 消化 不 全 和 纯度 不 够 等 现 象 。为此 ， 们 参 照 Ｓｍ ｓｎ等 的 培养 方 法 并 作 我 ｉｐｏ
了改进， 摸索 出一种简便 、 可靠 ， 且同时能培养出心 肌细 胞和心 脏成 纤维 细 胞 的方法 ， 心肌 细 胞 和 心 为 脏 成纤 维 细胞 的 体外 研究 提供 了 更 有 效Байду номын сангаас的技 术 手 段 ， 作报道 。 现
０ ０ ％ Ｉ型胶原 酶 以 ２ １ ．８ ： 混合 ， 配现用 。 现 １ ２ 实验 动物 １～ Ｆ龄 Ｓ ． ３ ｔ Ｄ大 鼠 １ ２ ０～ ５只 ， 由 本 院实验 动物 中心提 供 。
［ 收稿 日期 ］２ ０ －６３ ０９０ －０ ［ 作者单位 ］１蚌埠 医学院 药理学教 研室 ， ． 安徽 蚌埠 ２ ３ ３ ２ 蚌 ３０ ０；． 埠医学 院第一附属医院 心血管 内科 ， 安徽 蚌埠 ２ ３０ ３ ０４ ［ 作者简介 ］张乃菊 （９ １一） 女 ， 士研究生． １８ ， 硕 ［ 通讯作者 ］祝晓光 ， 研究生导师 ， 教授．
原代心肌细胞-原代心成纤维细胞培养方法
原代心肌细胞-原代心成纤维细胞培养方法实验准备：昆明乳鼠25~30只；生物安全柜；巴氏吸管2支；培养皿2个；原代器械盒；15ml 离心管；50ml离心管各一支；胰酶；PBS；1%双抗；封口膜；酒精灯；Dhanks；实验主要分为两大步骤进行：第一天晚上1、培养皿内加入预冷的PBS+1%双抗。
2、取乳鼠酒精喷全身取心脏放到提前准备的培养皿中无需剪碎稍抖动清洗。
3、所有心脏取完，用巴氏吸管将培养皿中的心脏吸到15ml离心管中，稍等沉降，吸去液体。
4、加入Dhanks冲洗心脏，吸出弃去，将心脏上沾有的血尽量冲洗干净。
5、加入3mlDhanks和5ml胰酶。
封口膜封好，放到饭盒里，四度摇床8-12小时。
第二天上午1、配置二型胶原酶（16.8mg二型胶原酶+21mL DMEM,配好后放到水浴锅预热，微孔滤膜过滤，现用现配）2、8-12小时后，向装有心脏的15ml离心管中加入5ml DMEM完全培养基中和胰酶。
之后小心吸去液体，加入7ml提前准备好的二型胶原酶。
放到37度摇床摇10min转速160r，摇10min后将上清吸到新的50ml离心管中。
这个过程重复3次，基本上心脏全部溶解，只有少量组织。
（每次可以少加二型胶原酶4-5ml多消化几次）3、将50ml离心管中3次收得的上清滤网过滤，离心1000r5min，弃上清，沉淀加入DMEM完全培养基，逐层吹起，加入到细胞培养瓶中。
5只鼠铺一个培养瓶。
4、1.5-2小时后差速，将培养瓶中的培养液转移到六孔板里。
心肌细胞10只鼠一个6孔板即可。
注：用心肌细胞的取6孔板中细胞培养48小时；用成纤维细胞的将培养瓶中差速的瓶用1000ul的枪冲洗30次得到的成纤维细胞相对较纯。
鸡胚成纤维细胞的原代培养
鸡胚成纤维细胞的原代培养171850044生拔钱诗晨一、背景知识1.1原代培养与传代培养1.1.1原代培养是指直接从生物体取材（细胞、组织或器官）进行的第一次培养（中途不分割培养物、不更换培养物的生长器皿）。
1.1.2传代细胞培养分割细胞培养物进行的再配养注：细胞培养的代不是指细胞分裂次数，而是指培养的次数1.2细胞体外培养要求的条件✓无菌✓适宜温度：哺乳动物细胞36.5℃ 0.5℃，植物细胞原生质体25℃左右✓生理渗透压✓适宜酸碱度：7.2-7.4✓气体：95%空气+5%二氧化碳✓培养基：提供水、各种有机营养（糖、氨基酸、维生素等）及无机盐、生长调节因子等1.3培养细胞生长类型悬浮型：培养时不黏附于支持物之上。
而呈现悬浮生长的细胞。
贴壁型：培养时需要黏附于一定固相支持物表面才能很好生长的细胞。
又称黏附依赖型细胞（分如下四类）✧成纤维细胞：胞体呈梭形或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。
✧上皮型：细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。
✧游走型：呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。
此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。
在一定条件下，如培养基化学性质变动等，它们也可能成纤维细胞形态。
✧多形型：是一些形态上不规则的细胞。
细胞一般分胞体和胞突两部分，胞体呈不规则多边形，胞突呈细长丝状。
如神经元和神经胶质细胞1.4原代细胞培养的一般办法1.4.1植块培养法直接将组织块接入培养皿底部，待组织块贴牢在底部后再加入培养基培养的方法1.4.2离散细胞培养法用酶消化组织，使细胞之间连接破坏，将组织离散成单细胞悬液进行培养的方法注：原代培养中的植块培养法与组织培养不是一回事；植物组织培养又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织、器官或细胞、原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。
肺成纤维细胞原代培养基本步骤
肺成纤维细胞原代培养基本步骤一、引言肺成纤维细胞是肺组织中的主要细胞类型之一，它们在肺部的结构和功能维持中起着关键作用。
原代培养是研究肺成纤维细胞生物学特性的重要手段之一。
本文将介绍肺成纤维细胞原代培养的基本步骤。
二、实验材料1. 无菌工具：无菌操作台、无菌吸管、无菌离心管等2. 细胞培养基：DMEM/F12（含10% FBS）、Penicillin/Streptomycin3. 消化液：Trypsin/EDTA4. 细胞收获液：PBS（含1% P/S）三、实验步骤1. 准备培养皿和培养液将DMEM/F12培养液加入到6孔板中，每孔加入2ml。
然后将板放入37℃恒温箱中预热。
2. 收集组织样本从小鼠或人体组织中收集需要的肺组织样本，并迅速转移到含有PBS （含1% P/S）的离心管中。
3. 组织消化将组织样本切碎成小块，然后加入2ml的Trypsin/EDTA消化液，放置于37℃恒温箱中消化30分钟。
4. 细胞分离将消化后的组织样本转移到无菌离心管中，用DMEM/F12培养液洗涤2次。
然后加入2ml的DMEM/F12培养液，在37℃恒温箱中振荡5分钟，使细胞分散均匀。
5. 细胞计数和接种用细胞计数板计数细胞数量，并将细胞接种到预热好的6孔板中。
每孔接种1×10^4个细胞。
6. 培养和观察将6孔板放入37℃恒温箱中培养，每天更换一次DMEM/F12培养液。
观察细胞生长情况，并在需要时进行下一步实验操作。
四、实验注意事项1. 手术器械、培养皿和培养液必须严格无菌。
2. 组织样本必须迅速转移至含有PBS（含1% P/S）的离心管中。
3. 消化时间不能过长，否则会对细胞产生不良影响。
4. 细胞接种密度要适当，过高或过低都会影响细胞生长。
5. 培养液必须每天更换一次，以保证细胞正常生长。
五、总结肺成纤维细胞原代培养是研究肺部生物学特性的重要手段。
本文介绍了肺成纤维细胞原代培养的基本步骤，包括准备培养皿和培养液、收集组织样本、组织消化、细胞分离、细胞计数和接种以及培养和观察等步骤。
小鼠成纤维细胞原代培养
实验-小鼠成纤维细胞的原代培养一、实验目的1.掌握哺乳动物细胞原代培养与传代培养中的取材、消化及无菌操作等基本实验技术与操作过程。
2.熟悉在倒置相差显微镜下观察培养细胞的形态与生长状况的方法。
3.了解细胞原代培养与传代培养的原理与方法。
二、实验原理自17世纪下半叶Robert Hooke提出“细胞”概念直至20世纪中叶,细胞培养(Cell culture)才逐渐发展起来。
现代生命科学以及相关领域的研究前提就是细胞的维持与增殖,因此,细胞培养不仅就是细胞生物学的密不可分的组成部分,而且已经成为生物化学、生物物理学、遗传学、免疫学、肿瘤学、生理学、分子生物学与神经科学、甚至临床医学的重要内容。
细胞培养也就是细胞生物学延伸至相关学科的一条主要途径。
如今,细胞培养已经成为生命科学与医学研究最常用的基础技术之一。
细胞培养就是模拟机体内生理条件,将细胞从机体中取出,在人工条件下,使其生存、生长、繁殖与传代,进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。
细胞培养的直接目的就是维持或扩增细胞数量。
依据取材于动物组织或培养细胞,细胞培养分为原代培养与传代培养。
1.原代培养(primary culture)就是从供体取得组织或细胞后在体外进行首次培养直至成功地进行首次传代之前的培养。
但实际上通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。
原代培养就是建立细胞系的第一步,其最基本的方法有两种:组织块培养法与消化培养法。
组织块培养法就是指直接从机体取下组织与器官,通过组织块直接长出单层细胞,该培养法就是最常用的原代培养方法,其将刚刚离体的、生长活力旺盛的组织剪成小块接种在培养瓶中作为实验材料,一天后细胞可从贴壁的组织块四周游出并生长。
组织块培养法操作过程简便、易行,培养的细胞较易存活,适用于一些来源有限、数量较少的组织的原代培养。
消化培养法利用酶或机械方法将组织分散成单个细胞后,在不加任何粘附剂的情况下,直接移植在培养瓶壁上,加入培养基立即进行培养的方法。
人皮肤成纤维细胞原代培养及生物学特性_王晓华
人皮肤成纤维细胞原代培养及生物学特性王晓华，王扬，蒋涛，付立业，姜又红（中国医科大学附属第一医院肿瘤研究所，沈阳110001）摘要：目的探索和建立人皮肤成纤维细胞原代培养的方法，为皮肤成纤维细胞在临床医学中的应用提供可靠的科学依据。
方法胰蛋白酶消化法分离培养人皮肤成纤维细胞；细胞生长曲线及MTT 法测定细胞增殖能力；流式细胞仪测定细胞生长周期及细胞增殖指数；倒置显微镜下观察成纤维细胞生长状态；HE 染色观察细胞爬片下的形态及着色；免疫组织化学染色观察成纤维细胞中间丝波形蛋白；电子显微镜下观察成纤维细胞超微结构。
结果体外用胰蛋白酶消化法建立了人皮肤成纤维细胞；传5代内细胞及传5代内冻存复苏后人皮肤成纤维细胞增殖能力均很强；倒置镜下观察、HE 染色、波形蛋白免疫组化染色及电镜下观察鉴定培养细胞的形态及生物学特性符合成纤维细胞。
结论本研究确立了体外人皮肤成纤维细胞原代培养。
关键词：人；皮肤；原代培养；成纤维细胞；细胞增殖指数；细胞形态学中图分类号：R318.08文献标志码：A文章编号：0258-4646（2010）12-1041-04Primary Culture and Biological Characteristics of Human Skin Fibroblasts 随着年龄的增长，皮肤会出现松弛、干燥粗糙、弹性下降、皱纹增多等老化现象，这些现象都与成纤维细胞数量减少以及分泌合成功能下降或异常有关［1］。
人皮肤成纤维细胞是皮肤真皮网织层中最重要的细胞，是皮肤衰老和细胞受损后的主要修复细胞之一［2］。
它不但能够促进表皮细胞的迁移、增殖和分化，还能分泌大量的胶原蛋白、弹性纤维蛋白及多种细胞修复因子，具有强大的自我更新能力［3］，从而修复老化的皮肤。
成纤维细胞是维持皮肤弹性和韧性的重要细胞［4］，因其特有的生物学特性，在抗皮肤衰老中起着重要的作用。
本研究拟通过皮肤成纤维细胞的分离和体外培养，观察、总结体外培养的成纤维细胞生物学特性，在细胞水平上对皮肤成纤维细胞的形态及生物学特性进行研究，以获得在体外稳定生长的皮肤成纤维细胞，为成纤维细胞在医学美容除皱术中的应用提供可靠的科学依据［5］。
大鼠肺成纤维细胞原代提取及培养实验具体步骤及方法
大鼠肺成纤维细胞原代提取及培养实验具体步骤及方法将大鼠的肺成纤维细胞从机体中取出，经胰酶、螯合剂（常用EDTA）处理，分散成单细胞，置合适的生长培养基培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。
一、实验材料准备1. 动物出生后1-4天的Wistar乳鼠1只。
2. 试剂PBS、培养液(Hyclone的低糖DMEM，含Hyclone的10%新生牛血清、100 U/ml 青链霉素、1%明胶PBS、0.25%胰酶(含EDTA，GIBCO)，碘酒和酒精绵球。
3. 器械眼科直剪2把、眼科弯剪2把、眼科直镊2把、眼科弯镊2把、玻璃平皿3套，25 cm2塑料培养瓶(Costar)。
二、具体操作1. 明胶包被培养瓶过夜(准备2-3个)，取出明胶，用2 ml培养液冲洗培养瓶一遍，置于超净台中。
2. 解剖取肺：将乳鼠在酒精中浸泡后取出，转移至超净台上的玻璃培养皿中，用碘酒消毒胸部皮肤，再用酒精棉球脱碘。
左手捏紧乳鼠颈背部皮肤以充分展露胸部，右手以眼科直剪剪开皮肤，充分撕拉开，再用酒精棉球消毒，继而以另一把眼科弯剪沿胸骨柄左下缘向上剪开肋骨，然后在切口中间横剪胸骨。
用眼科镊取出肺，置于盛有PBS(含有200U/ml青链霉素)的玻璃平皿中，冲洗去血。
3. 用眼科剪将肺分成几个肺叶，用镊子去除周边的血凝块及纤维组织，用眼科剪剪去肺门处的支气管和血管，再用含有双抗的PBS冲洗1遍。
4. 用眼科弯剪将肺组织剪碎成1 mm3大小，加入含有双抗的PBS，将肺组织块吹打开，静置15 min后，更换新的PBS。
5. 用200 ul微量加样器(最好是超净台中专用的，临用时用酒精绵球好好擦拭枪柄)取200 ul加样枪头一个，剪去尖，在酒精灯上用火焰烧弯。
用枪头吸取组织块接种于培养瓶中，每瓶20-25块左右，每小块间距0.5 cm左右。
组织块放置好后，轻轻将培养瓶翻转，让瓶底朝上，向瓶内加入2 ml左右的培养液，盖好瓶盖，将培养瓶倾斜放置在温箱中，干贴壁2-4 h后，将培养瓶慢慢翻转平放，继续静置培养。
人牙龈成纤维细胞的原代培养及鉴定
对 其功 能 的调控 作用 奠定基 础 。 【 关键词 】牙龈 成 纤维 细胞 ； 细胞 培养 ； 鉴定 【 图分类 号】 ３ ９２ ８ 中 Ｒ ２ ．＋ 【 献标 识码】Ａ 文 【 章编 号】１ ７ — ２ ０ ２ １ ０ （ 卜０ ６ ０ 文 ６ ３ ７ １ （ ０ ０） １ ｃ ２ — ２
Ｔｈｅｐｒｍ ａ ｙ ｃ ｔ ｅ ａ ｄ ｉ ｅ ｔｆｃ ｔｏ Ｏ ｕｍ ａ ｇ ｎｇｖ ｌｆｂ ｏ ａ ｔ ｉ ｒ ￣ ｕｒ ｎ ｄ ｎ ｉ ａ ｉ ｎ ｆｈ ｉ ｎ ｉ ｉ ａ ｒ ｂｌｓｓ ｉ
Ｃ Ｉ ｕｎ Ｕ ｅｉ１ Ｉ ． Ｈ Ｎ ｕｐｎ Ｕ ａ；Ｓ ＮＫ ｑｎ Ｌ ｚ Ａ ＧＨ ａｉ Ｊ ， ｘ ｆ
ｆ ＯｒｌＨｏｐ ｔ ｆＳ ａ ｘ ｄｃ ｌＵｎ ｖ ｒ ｔ ｏ ａ ｓ ｉ ｌｏ ｈ ｎ ｉＭｅ ｉａ ｉｅ ｉ ， ａ ｓ ｙ ｙ ａ ０ Ｏ ｏ１ Ｃｈｎ １ ｕ ｎ ３ ０ 。 ｉａ
［ ｓｒｃ］ ｊｃｉｅ Ｔ ｏａｅａ ｄｃ ｌ ｒ ｕ ｎ ｉｇｖｌ ｂｏ ｌｓ ＨＧ ｓ ｉ ｉｏ ａ ｄｐｏｉｅｔｅｅｐ ｒ ｅ ｔ ｏ－ Ａｂ ｔａｔ Ｏｂｅｔ ： ｏｉ ｌ ｎ ｕｔ ｅｈ ｍａ ｇ ｉａ ｆ ｒｂａｔ ｖ ｓ ｔ ｕ ｎ ｉ ｓ（ Ｆ ）ｎｖｔ ， ｎ ｒｖｄ ｘ ｅｉ ｎａ ｃ ｎ ｒ ｈ ｍ ｌ
【 要】目的 ： 摘 分离 培养 人牙 龈成 纤维 细胞 ， 为进一 步研究 细胞 因子对牙 龈成 纤维 细胞 的调 控作 用提 供实 验条 件 。方
实验二_原代细胞培养
三、细胞培养的条件要求 1）细胞密度 原代细胞：4-6×105个/ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱl 传代细胞：2-3×105个/ml 2）pH范围：最适pH7.0-7.4，耐受pH6.67.8 3）培养温度
四、操作步骤
1. 取9-12日龄孵育良好的鸡胚，依次用碘酊和 酒精消毒气室部。
10.轻轻吸取上层细胞悬液于细胞培养瓶中，每 瓶约0.2-0.5ml，补加DMEM生长液至 10ml，使细胞量约为4-6×105个/ml，盖上 盖子，置于37℃恒温箱中培养。
11.细胞计数方法 取细胞悬液0.5ml+2ml 0.1%结晶紫—枸椽酸
（0.1mol/L）溶液，室温或37℃温箱中5-10min， 充分振荡后进行计数。
2. 无菌操作下用剪子去除气室部卵壳和壳膜， 穿破绒毛尿囊膜，夹住鸡胚颈部，取出鸡胚 放于灭菌平皿中。
3. 用眼科剪、镊去除鸡胚头、四肢及内脏，用 无血清的DMEM冲冼2次。
4. 将冲洗后的鸡胚用剪子充分剪碎，使其近于乳 糜状。
5. 将剪碎的组织块倒入细菌瓶中，加入5ml无血 清 DMEM，振摇几次，静置几分钟，吸弃洗 液。如此重复1次。
实验二 原代细胞培养
（以鸡胚成纤维细胞为例）
一、实验目的
了解不同原代细胞的形
态，掌握鸡胚成纤维细胞
的制备与培养方法。
A
B
A 上皮细胞 B 成纤维细胞
二、材料 1. 9-12日龄鸡胚 2. 照蛋灯与蛋座 3. 碘酊棉球与酒精棉球 4. 大剪子、眼科剪、小镊子 5. 平皿、细菌瓶、吸管、吸球、细胞瓶 6. 0.25%胰酶 7. 基础培养液：DMEM
按白细胞计数法计算4角4个大方格内的细胞总数 （N）。
血管成纤维细胞原代细胞提取培养
血管成纤维细胞分离与培养一、实验动物8-10周龄C57小鼠10只。
大鼠二、试剂及配制高糖DMEM、0.25%胰蛋白酶, 胎牛血清、青霉素-链霉素混合液。
培养液: 10%DMEM培养基：FBS：双抗 100：10：1（45ml：5ml：0.5ml）20%FBS DMEM三、实验仪器超净工作台、CO2培养箱、光学倒置显微镜、离心机四、组织分离与贴壁1、将小鼠于75%乙醇缸中浸泡5ｓ, 转移至超净台。
用大头针将其固定在无菌的泡沫板上, 用75%乙醇消毒胸、腹部皮肤。
2、取2把弯镊子撕开皮肤, 充分撕拉开, 再用乙醇棉签消毒。
用眼科虹膜剪沿剑突处正中线向上剪开胸骨, 沿正中线向下剪开腹膜，将腹部内脏拨至一旁，充分暴露主动脉，从肾动脉分支处直至心脏剪下, 取出心脏及主动脉, 置于盛预冷PBS液的培养皿中。
3、将鼠心脏主动脉全部取出后, 剪去心房心脏、剔除主动脉上脂肪，预冷ＰＢＳ液清洗3次, 去除血污。
4、纵向剖开血管腔，血管内膜面朝上铺于培养皿上，手术剔除内膜和中膜，PBS漂洗余下半透明血管外膜。
5、贴块法：将血管外膜转移至20%FBS DMEM中，剪成约1mm3的小块，吸弃多余的培养基，培养皿底面朝上置于37℃5%CO2培养箱，干涸4-6h，待组织块贴壁后，将培养皿慢慢翻转放平，滴加含有20%FBS DMEM培养基，使培养液完全浸泡组织块，置于37℃，5%CO2培养箱，每2天换培养液1次，待细胞生长达融合状态（7-10天），胰酶消化传代10%DMEM。
6.胰酶消化法：？五、细胞形态学观察和免疫荧光鉴定成纤维细胞：波形蛋白，内皮细胞：CD31,平滑肌细胞1：分离血管内中外膜比较费时，可以先在显微镜下练习，然后肉眼练习，再到超净台内练，动作尽量要熟练轻柔，避免牵拉过度。
2：剪的组织块要小，最好能小于1*1mm。
可以用刀片切。
3：贴壁距离要小，比5mm*5mm小，可以一次把培养液加到5~7ml，等估计贴牢时可以直接翻瓶。
鸡胚成纤维细胞的原代培养
鸡胚成纤维细胞的原代培养171850044生拔钱诗晨一、背景知识1.1原代培养与传代培养1.1.1原代培养是指直接从生物体取材（细胞、组织或器官）进行的第一次培养（中途不分割培养物、不更换培养物的生长器皿）。
1.1.2传代细胞培养分割细胞培养物进行的再配养注：细胞培养的代不是指细胞分裂次数，而是指培养的次数1.2细胞体外培养要求的条件✓无菌✓适宜温度：哺乳动物细胞36.5℃ 0.5℃，植物细胞原生质体25℃左右✓生理渗透压✓适宜酸碱度：7.2-7.4✓气体：95%空气+5%二氧化碳✓培养基：提供水、各种有机营养（糖、氨基酸、维生素等）及无机盐、生长调节因子等1.3培养细胞生长类型悬浮型：培养时不黏附于支持物之上。
而呈现悬浮生长的细胞。
贴壁型：培养时需要黏附于一定固相支持物表面才能很好生长的细胞。
又称黏附依赖型细胞（分如下四类）✧成纤维细胞：胞体呈梭形或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。
✧上皮型：细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。
✧游走型：呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。
此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。
在一定条件下，如培养基化学性质变动等，它们也可能成纤维细胞形态。
✧多形型：是一些形态上不规则的细胞。
细胞一般分胞体和胞突两部分，胞体呈不规则多边形，胞突呈细长丝状。
如神经元和神经胶质细胞1.4原代细胞培养的一般办法1.4.1植块培养法直接将组织块接入培养皿底部，待组织块贴牢在底部后再加入培养基培养的方法1.4.2离散细胞培养法用酶消化组织，使细胞之间连接破坏，将组织离散成单细胞悬液进行培养的方法注：原代培养中的植块培养法与组织培养不是一回事；植物组织培养又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织、器官或细胞、原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。
ra滑膜成纤维细胞原代培养
ra滑膜成纤维细胞原代培养
ra滑膜成纤维细胞原代培养的过程如下：
1.获取关节滑膜组织：从手术中获取健康的关节滑膜组织，或从患
者身上获取病变的关节滑膜组织。
2.去除滑膜组织上的脂肪和血管：将滑膜组织放入无菌的生理盐水
中，用手术刀或剪刀将其切成小块，然后用镊子或刮匙去除组织上的脂肪和血管。
3.剪碎滑膜组织：将处理过的滑膜组织放入无菌的玻璃瓶中，用剪
刀将其剪碎成小的碎片。
4.制备组织匀浆：将剪碎的滑膜组织放入研钵中，加入适量的消化
液（如胰蛋白酶、胶原酶等），用研杵搅拌至匀浆状。
5.离心分离细胞：将匀浆液倒入离心管中，以适当的转速离心，分
离出滑膜成纤维细胞。
6.洗涤和培养细胞：将分离出的滑膜成纤维细胞洗涤后接种在适当
的培养基中，放置在恒温恒湿的培养箱中进行培养。
7.观察和鉴定细胞：在培养过程中，定期观察细胞的生长情况，并
使用显微镜、免疫组化等方法对细胞进行鉴定。
8.维持细胞生长：根据细胞的生长情况，定期更换培养基，以保证
细胞的正常生长和繁殖。
原代培养中成纤维细胞的抑制
尽量除去杂质细胞：现在一般的做法是：将消化完全的细胞悬液先在大的培养瓶中培养1~2小时，然后再小心的吸出仍然悬浮的心肌细胞，再接种到6孔或24孔板上。这样做主要是尽量除去成纤维细胞。由于成纤维细胞贴壁迅速，而心肌通常在4h后才开始贴壁，这样才能尽量利用差速贴壁法除去成纤维细胞。
（2）机械划除法
原代培养成功后，上皮细胞和成纤维细胞所数都同时出现，混杂生长。这种混杂生长常常分区成片，每种细胞都以小片或区域性分布的方式生长在瓶壁上。因此可以采用机械的方法去除不需要的细胞。
（3）反复贴壁法
成纤维细胞与上皮细胞相比，其贴壁过程快，大部分细胞常能在短时间内大约10－30min完成附着过程，而上皮细胞大部分在短时间内不能附着或附着不稳定，稍加振荡即浮起，这样可以利用此差别来纯化细胞。
方法：
1.取材：4～6ｗＷｉｓｔａｒ大鼠,大剂量2%戊巴比妥钠麻醉处死，将处死后的大鼠浸入75%酒精中，放入超净台。在无菌状态下剪开胸腹腔，分离胸主动脉,用2ｍｌ注射器从主动脉弓处向胸主动脉注入D-Hank’s液,驱除残血,取主动脉弓至肾动脉一段，两端结扎剪断，放入60℃预热无菌水中2秒。然后置于准备好的RPMi1640培养基（含双抗）中。
【wangtsy】胰岛的分离与纯化
取新生1-3天SD大鼠10-15只，无菌条件下剖腹取出胰腺置入无菌培养皿中，用眼科剪去除非胰腺组织，4℃Hanks液清洗三次后，用眼科剪反复剪切至<0.5mm3组织块，取浓度为1g/L的V型胶原酶溶液5-10ml与之混合,转入三角烧瓶中，于37℃恒温水浴振荡器消化30-40min，加入两倍体积4℃Hanks液终止消化，用吸管反复吹吸后过80目筛网，滤液以800rpm低速离心70s去上清液，并用4℃Hank's液低速离心清洗2次，除去单个腺泡及上皮细胞。加入含2.5mg/L碘乙酸的PRMI1640完全培养基（含10%胎牛血清、10mmol/L HEPES缓冲液、1mmol/L丙酮酸钠、100000u/L青霉素G钾、100mg/L链霉素、71.5umol/L β-巯基乙醇）中制成细胞悬液,接种于75ml玻璃培养瓶中,于37℃,5%CO2,95%空气条件下培养5h后，用无血清培养基低速离心清洗3次,以除去成纤维细胞。然后用正常完全培养基培养24h，转瓶弃去贴壁细胞，用无血清培养液低速离心洗涤两次，沉淀物即为纯化胰岛。再用PRMI1640完全培养基养吧，可长成胰岛单层细胞。
人眼Tenon's囊成纤维细胞原代培养的研究
人眼Tenon's囊成纤维细胞原代培养的研究陈珺;李宁;廖荣丰【期刊名称】《临床眼科杂志》【年(卷),期】2016(24)1【摘要】目的探讨体外培养原代人眼Tenon's囊成纤维细胞的方法及其生长特性,为抗纤维化研究提供靶细胞模型.方法取翼状胬肉及斜视手术患者的Tenon's囊组织,用组织块法培养原代成纤维细胞.用免疫荧光方法鉴定细胞.对细胞进行传代、冻存和复苏的观察.对复苏后的细胞行MTT法检测其活力并绘制生长曲线.结果入眼Tenon's囊成纤维细胞可以在体外用组织块方法培养出来,呈典型的长梭形.免疫荧光鉴定细胞波形蛋白染色阳性.细胞多次传代后依然生长迅速,3d即可长满瓶底.复苏后细胞2～6d处生长对数期,增殖能力良好.结论人眼Tenon's囊成纤维细胞体外生长状态良好,可以液氮冻存,复苏后细胞活力较强,可以用于抗纤维化增生的基础研究.【总页数】4页(P1-4)【作者】陈珺;李宁;廖荣丰【作者单位】230022 合肥,安徽医科大学第一附属医院眼科;230022 合肥,安徽医科大学第一附属医院眼科;230022 合肥,安徽医科大学第一附属医院眼科【正文语种】中文【相关文献】1.人眼Tenon囊成纤维细胞体外培养及生长特性的比较 [J], 朱晓燕;李磊;鲜光军;李海军;谢琳2.姜黄素对人眼Tenon囊成纤维细胞抑制作用的研究 [J], 蓝育青;郑海生;张弛;周怀胜;郭慧3.原代人眼Tenon's囊成纤维细胞的生物学特性及体外培养方案优化 [J], 王丽君;李宏松;张文怡;廖丁莹;杨熹婷;王建明4.阿昔洛韦对体外培养人眼Tenon囊成纤维细胞增殖迁移的影响 [J], 吴靖怡;吴志航;李淑婷;刘瑶5.人眼Tenon氏囊成纤维细胞的体外培养 [J], 郑健樑;郭彦;张洁;吴明星因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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利用组织块可以成功地培养得到原代培养的人皮肤真皮成纤维细胞。
培养中应该注意以下事项：
①一般皮肤主要取白手术过程中切除的部分组织，方法似外科取断层皮片手术操作，但组织一般2—3cm 即可，注意取材时不要用碘酒消毒．此外，不要切取太厚，要尽量去除皮下组织，如果皮下脂肪太厚会影响组织块的贴壁，不易于日后细胞的游出．
②尽量去除表皮，如有表皮未被完全剔除，则可能造成表皮细胞竞争生长，最为常见的为角质形成细胞的污染，它可以和成纤维细胞共同生长．虽说在今后的传代培养时可通过细胞纯化方法适当去除，但这种混和生长状态会对后续实验产生影响．所以，一旦发现细胞污染，应立即停止实验，重新培养．
③在剪切组织块时要注意保持组织块湿润，可向其表面滴加几滴培养液，要始终保持其成湿润状态，这一点要特别注意而且十分重要．剪切时要掌握好时间，尽量在短时间内完成．
④组织块在最初贴壁时不是很牢固，所以开始加液不应太多，以刚刚浸没组织块为易，特别要注意，在最初几天时要减少移动培养瓶次数，避免过多晃动而造成组织块脱壁，最好在开始3 d内不换液．⑤文献报告成纤维细胞培养多在CO 培养箱内进行，培养箱内环境为CO 浓度50 ml／L，湿度95％，培养瓶为开放式．因其湿度，温度及氧气与人体内实际情况较为接近，所以适合成纤维细胞的成长．但开放式培养的同时也增加了细胞培养污染的机率，所以，可以根据
自己实验室的条件选用合适的培养方法，如半开放式和充气后密闭瓶口，其效果也十分理想．但同时要密切观察培养液的pH变化，以保持适宜的酸碱度．
⑥细胞培养失败的最常见原因是污染，其中以微生物污染最常见，污染一旦明确，多数将无法救治，应尽快弃之，以防止污染扩大，影响其他细胞．因此，应在各个阶段严格遵守无菌操作原则，把好每一关口，尽可能禁止其他污染的物品进入操作环节，以避免造成时间、人力、物力的浪费．。