鸡胚细胞的原代培养26页PPT
鸡胚原代细胞的培养
鸡胚原代细胞的培养{能力目标}·了解鸡胚的发育过程。
·掌握鸡胚原代细胞制备及培养技术。
{实验器材}(1)Hank's液、含10%~20%血清的细胞培养液、碘酊棉、酒精棉、0.25%胰酶。
(2)超净工作台或生物安全柜、细胞培养瓶、吸尔球、灭菌吸管、平皿、毛吸管、离心管、剪刀、小镊子、培养箱、倒置显微镜。
{实验内容及操作步骤}一、鸡胚的孵育受精鸡胚放在蛋托上，大头朝上，人温箱培养。
在温箱底部放上一盘水，将温度调至37.8℃即可。
二、鸡胚的发育过程(1)观察方法：将9~12日龄的鸡胚取出，放人平皿中进行观察。
(2)鸡胚的发育：要采用鸡胚进行细胞培养时，应对鸡胚的发育有一个初步了解。
鸡胚的发育是由受精卵开始的，它在通过输卵管时，已开始分裂，当产卵时已在卵黄上部形成一层细胞，名为胚盘，在适宜的条件下胚盘继续分裂生长。
在发育过程中由卵黄和卵白中获取养料和水分，由于胚体与卵黄分开的缘故，胚胎只通过卵黄带与卵黄相连。
发育的早期形成三个胚层，即外胚层、中胚层和内胚层，由此形成胚胎的各个器官和组织。
一般孵育至第3d出现尿囊，为直肠腹侧部分的膨出物，尿囊膜是由内胚层和中胚层构成的。
至第4~5d胚体为羊膜、尿囊膜及绒毛膜层包被。
羊膜系由外胚层和中胚层组成，开始时紧贴于胚体上，后来腔内逐渐充满羊水。
尿膜在生长发育的过程中，与绒毛膜相连而成绒毛尿囊膜，此膜为三层细胞组成。
外层为外胚层，内层为内胚层，中间为中胚层细胞，其中血管甚多有两条主动脉自卵黄囊延伸到此膜中，与此并行有两条主静脉，汇流成一较大的尿囊静脉。
绒毛尿囊膜系鸡胚的呼吸器官，位于壳膜之内。
此膜生长发育很快，第10d己包围了整个鸡胚，此时鸡胚己出现羽毛，呼吸道的发育在第12~15d之间出现。
'胚胎体积逐渐增大时，胚胎腔外体液亦日趋减少，孵出小鸡时已无胚胎腔外体液。
在发育早期，尿囊液及羊水的成分与生理盐水溶液相差无几，12d后羊水的蛋白含量及黏稠度增加，尿囊腔积累了肾脏的排泄物，因此，在12d或13d 后，尿囊液由于尿酸盐的存在，使原来透明的液体呈现混浊。
鸡胚细胞的原代培养
2.塑料篮子内：无菌袖套
操
1. 2. 3. 4. 5. 6.
作
照egg, 画气室线。 戴无菌袖套。点燃酒精灯，手部消毒。 台面消毒; 将egg置于蛋座（气室朝上），外表消毒。 中镊敲碎蛋壳，沿气室线剥开。 小镊撕内膜，挑出鸡胚→培养皿A中清洗。
标记气室示意图
操
• • • • • •
作
照egg, 画气室线。 戴无菌袖套。点燃酒精灯，手部消毒。 台面消毒; 将egg置于蛋座（气室朝上），外表消毒。 中镊敲碎蛋壳，沿气室线剥开。 小镊撕内膜，挑出鸡胚→培养皿A中用 Hank’s液清洗。
鉴定各种细胞产物的程序。
无血清培养液中补加物具有独特性：适用于某
种细胞株的培养液，很可能不适合另一种细胞 株的生长。即使同源组织的不同细胞株，所需 补加物也不同。
无血清培养基的目前使用情况：尚处于研究阶
段，难以推广。目前，绝大多数人工合成培养 基使用时还需添加血清
人间充质干细胞无血清培养基:上海依科赛公司 CHO无血清培养基：维森特公司 树突状细胞无血清培养基：达优公司
肺
肝
腿部 肌肉
肾脏
摘自 《细胞培养基本知识》-Invitrogen
注 意
清理台面,用品洗净,交回。酒பைடு நூலகம்灯和酒精棉球瓶要补 加酒精。 实验报告：这次的原代培养与细胞传代和冻存的实验 一起写一份细胞报告。 重点：要对实验结果进行分析和讨论。 实验考核：本次实验的实验结果记入一次实验课成绩 考核内容。无菌实验操作记入实验考核。
鸡胚细胞的原代培养
摘自 《细胞培养基本知识》-Invitrogen
细胞培养的用途
照片来自 《动物细胞培养-基本技术指南》
提
纲
1.培养基的类型及配制 2.原代培养的过程 3.原代培养的注意事项 4. 本次实验操作要点 5.实践操作
《原代细胞培养实验》PPT课件
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实验内容：
❖ 动物的选择：
选择大约一半足孕时间的胚胎，10－13 天龄胚胎含有最大数量的未分化的间质细胞， 成纤维细胞可从这些细胞衍生获得。
每组小鼠胚胎2-5个
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实验材料：
❖ 每组的超净台中有以下物品：
❖ 1. 50ml 配制好的RPMI1640培养液1瓶；8ml小牛 血清（FCS) 1瓶；100ml 0.25%胰蛋白酶 1瓶； PBS(-)1 瓶
❖ 4)在温暖的环境中或置于37 °C培养箱中轻轻摇动15分 钟。
❖ 5)让存留的组织块在重力作用下慢慢沉降，将含有悬浮 细胞的液体转移至一无菌50ml的离心管中，该管内按照 每10ml上清加入l ml小牛血清的比例加入牛血清以灭活, 胰蛋白酶。
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❖ 6)加人新鲜胰蛋白酶溶液(见前述步骤)于含有残留未消化组 织块的原来的50ml离心筒中，重复步骤4和5。
3在无菌状态下将绞碎的胚胎转移于一50ml的无菌离加入40ml025的无菌胰蛋白酶用搅拌棒轻轻搅动4在温暖的环境中或置于37c培养箱中轻轻摇动15分5让存留的组织块在重力作用下慢慢沉降将含有悬浮细胞的液体转移至一无菌50ml的离心管中该管内按照每10ml上清加入lml小牛血清的比例加入牛血清以灭活胰蛋白酶
❖ 2. 100ml灭菌烧杯2个；
❖ 3、50ml离心筒2个
❖ 4、灭菌培养皿1个，细胞培养瓶1个
❖ 4、1ml ，200μl移液器各1支；枪头盒2个；无菌 玻璃搅拌棒1个
❖ 5、细胞计数板1块；
❖ 6、灭好菌的镊子1把，剪刀1把；
❖ 7、酒精灯1台；
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试验操作步骤：
❖ 1)胚胎的分离。适用哺乳动物(仓鼠、小鼠和大鼠)
细胞原代培养PPT课件
3.过滤
• 用400目不锈钢筛网过滤 • 收集滤液于离心管 4.离心 • 平衡、离心5min，1000～1500 rpm • 去上清，加PBS，混匀，离心（同上） • 重复上一步 5.接种 • 去上清，加3～5ml培养基，混匀，接种于培养瓶 • 加培养基3～5mm深，盖紧盖，观察细胞密度 6.培养
针头）
有机试剂过滤除菌，常用0.22µm • 超净工作台
紫外灯照射30min以上 • 培养室
紫外灯照射2～3h/天
操作步骤
1.取材 • 75％酒精浸泡乳鼠2min，取肝脏于平皿中 • PBS溶液洗涤3次 • 去除液体后，剪碎成1～2mm3小块 2.消化 • 加5～8倍组织量的胰蛋白酶溶液 • 转移到离心管内，加盖 • 37℃水浴15min，每5min摇晃1次 • 终止消化：加1ml含血清的培养基DMEM
• 超净工作台 紫外消毒，鼓风，保持干净、整洁
• 高压锅 用电，带压力表，自动恒压，掌握时间
橡胶、塑料、药品——15’，金属——20’ • 培养瓶
玻璃瓶和塑料瓶，洗涤要干净，临时消毒
• 培养基 a.天然培养基：血清、胚胎浸出液、水解乳蛋白等 b.合成培养基：DMEM、RPMI1640、199培养基等 c.无血清培养基：Ham F12和DMEM混合的基础培 养基、自行设计与配制的培养基（加其他成分）
a.组织块法：直接将组织块接种于培养瓶， 24小时就有细胞向四周游出。 简便、易行，适合于来源有限、数量较少 的组织做原代细胞培养
b.消化法
• 用酶消化、分解妨碍细胞生长的间质（基 质、纤维等），形成单个细胞或细胞团
• 对上皮、肝、肾、胚胎等间质少、较软组 织选择胰蛋白酶
• 对骨、前列腺、癌组织等纤维多、较硬的 组织可用胶原酶
鸡胚成纤维细胞制备PPT课件
用4层脱脂纱布将吹打后的细胞过滤到平皿中，收集滤液。
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实验步骤
（四）细胞形态观察 检查时注意培养液的颜色变化，变黄但不混浊表示有细胞
生长，变红表示细胞未生长或生长不佳。37℃培养24-48h后， 于倒置显微镜下观察，细胞可以长成单层，细胞透亮，呈纤维 状，细胞膜清晰。
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实验步骤
五、注意事项
1、整个过程严格无菌操作
将剪碎的组织块放入锥形瓶中，加入适量的胰酶。包紧瓶 口，37℃水域消化30min，每隔5min轻轻摇动1次。当组织块 变得蓬松透明时，吸弃消化液，用PBS洗两遍，中止消化。如 再继续消化，可破坏细胞膜而不易贴壁生长，如果消化不够， 则细胞不易分散。
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实验步骤
（2）分散细胞 将消化好的细胞悬液从水浴锅中取出，弃去上层液体，加
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实验步骤
（3）胚体匀浆 用灭菌剪将胚体剪碎至1mm3小碎块。加入PBS（淹住
组织碎块即可），轻摇，静置1-2min，待组织块下沉，吸去 上层悬液。重复2-3次（以除去其中的红细胞），至上悬液不 混浊为止，移入灭菌的锥形瓶中，吸去PBS。
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实验步骤
2、分散细胞 （1）酶消化
模板鸡的胚胎发育.ppt
第五胚龄照蛋
第五胚龄解剖
最新.
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• 第六天：尿囊增长迅速，一天之内增长了约4倍，尿囊血管系统迅速发育，已
经覆盖羊膜与部分卵黄，但较卵黄囊血管细；卵黄囊血管分布在卵黄面积达 2/3以上。胚体已初具翼和腿的外型，已眼睛黑色素更多，照蛋可见头部与躯
最新.
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• 第十二天：图中尿囊在蛋白端尚有一小孔未合拢，对于12天的胚胎发育似乎
嫌慢。由于个体差异，这种情形并不罕见，鸡胚短羽已遍与爪已角质化。蛋
白呈淡黄褐色，粘稠，浆羊膜道形成。
第十二胚龄照蛋
第十二胚龄解剖
最新.
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• 第十三天：将羊膜道是输送蛋白至浆羊膜腔的细长通道。粘稠的蛋白由于尿
囊的包围和收缩，像挤牙膏一样不断进入将羊膜腔，与羊水混合，这种含有 蛋白的羊水，称为蛋白羊水，胎儿开始大量吞食蛋白羊水。
第七胚龄解剖
最新.
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• 第八天： 尿囊较第7天扩大了一倍，几乎包围了卵黄囊。从第4天到第8天是
尿囊发育的第一阶段，胚胎由卵黄囊呼吸转化为尿囊呼吸。胎儿外形发育趋 于完善，上喙白色，破壳齿明显可见，胸腹腔尚未封闭，心、肝、胃都暴露
于体腔外。羊水与尿囊液迅速增多。
第八胚龄照蛋
第八胚龄解剖
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• 第九天：尿囊沿内膜迅速向下端发展，包围了胎儿和卵黄，并包围部分蛋分
孵化技术- 鸡孵化过程精蛋
•
种蛋中通常被称为“卵黄”的部分，实际上只是一个细胞，即雌性生殖
细胞或卵子。卵黄绝大部分是营养物质，细胞核和大部分细胞质集中为一个 不规则的小白点，浮于卵黄上面和卵黄膜的下面，如图中箭头所示。这种蛋
鸡胚成纤维细胞的原代培养
鸡胚成纤维细胞的原代培养171850044生拔钱诗晨一、背景知识1.1原代培养与传代培养1.1.1原代培养是指直接从生物体取材（细胞、组织或器官）进行的第一次培养（中途不分割培养物、不更换培养物的生长器皿）。
1.1.2传代细胞培养分割细胞培养物进行的再配养注：细胞培养的代不是指细胞分裂次数，而是指培养的次数1.2细胞体外培养要求的条件✓无菌✓适宜温度：哺乳动物细胞36.5℃ 0.5℃，植物细胞原生质体25℃左右✓生理渗透压✓适宜酸碱度：7.2-7.4✓气体：95%空气+5%二氧化碳✓培养基：提供水、各种有机营养（糖、氨基酸、维生素等）及无机盐、生长调节因子等1.3培养细胞生长类型悬浮型：培养时不黏附于支持物之上。
而呈现悬浮生长的细胞。
贴壁型：培养时需要黏附于一定固相支持物表面才能很好生长的细胞。
又称黏附依赖型细胞（分如下四类）✧成纤维细胞：胞体呈梭形或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。
✧上皮型：细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。
✧游走型：呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。
此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。
在一定条件下，如培养基化学性质变动等，它们也可能成纤维细胞形态。
✧多形型：是一些形态上不规则的细胞。
细胞一般分胞体和胞突两部分，胞体呈不规则多边形，胞突呈细长丝状。
如神经元和神经胶质细胞1.4原代细胞培养的一般办法1.4.1植块培养法直接将组织块接入培养皿底部，待组织块贴牢在底部后再加入培养基培养的方法1.4.2离散细胞培养法用酶消化组织，使细胞之间连接破坏，将组织离散成单细胞悬液进行培养的方法注：原代培养中的植块培养法与组织培养不是一回事；植物组织培养又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织、器官或细胞、原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。
鸡胚原代细胞培养
鸡胚原代细胞培养[实验材料]9～10日龄鸡胚，Hank”s液50mL,0．5％水解乳蛋白液或MEM培养液20mL （内含犊牛血清1mL，双抗0．2mL，pH7．2)，O．25％胰蛋白酶5mL、7％NaHC031mL，手术剪，镊子，灭菌的培养皿，50mL三角瓶，滴管若干，链霉素小空瓶若干(加入细胞悬液培养用)，高压灭菌塞子若干，培养盘，蛋座,95％酒精，水浴锅。
[实验内容及操作程序]1．配液制备细胞前先在Hnak”s液中加青、链霉素，使其含量为青霉素100IU/mL，链霉素100μg/mL，用7％NaHC03调整pH至7．2~7．4,将胰蛋白酶调整pH7．6（玫瑰红色).置37℃水浴锅中预热备用。
2. 取胚及剪碎将胚蛋气室端向上直立于蛋座上，用碘酊消毒气室,以镊子击破卵壳并弃之，撕破卵膜揭之，继撕破绒尿膜、羊膜，取出胚胎于灭菌平皿中.剪去头部、翅爪及内脏，用Hank”s液（简称H液）洗去体表血液，移人灭菌三角瓶中，用灭菌剪刀剪碎鸡胚，使成为约1mm3大小的碎块,加5mL H液轻摇，静止1～2min，使其组织块下沉。
吸去上层悬液，依同法再洗2次，至上悬液不混浊为止，吸干H液留组织。
3．消化自水浴锅内取出预热的胰酶,按组织块量约3～5倍加入三角瓶中，1个鸡胚约需5mL胰酶，三角瓶上加塞,以免CO2挥发及污染。
37℃水浴约20min 左右，每隔5min轻轻摇动1次，由于胰酶作用，使细胞与细胞之间的氨基和羧基游离，待液体变混而稍稠，此是再轻摇可见组织块悬浮在液体内而不易下沉时，则需中止消化，如再继续消化下去可破坏细胞膜而不易贴壁生长，如果消化不够，则细胞不易分散。
4．洗涤取出三角瓶后静置1min，让组织块下沉后，吸去胰酶液,用10mL Hank”s液反复轻洗3次，以洗去胰酶，吸干上清液，留组织块。
5．吹打加2mL含血清的0．5％水解乳蛋白营养液或:MEM培养液,以粗口吸管反复吹吸数次，使细胞分散，此时可见营养液混浊即为细胞悬液。
实验三、鸡胚细胞的原代培养lz
操作
1. 照egg, 画气室线。 egg消毒,台面消毒; 2. 戴无菌袖套。点燃酒精灯，手部消毒。 3. 将egg置于蛋座（气室朝上），外表再次消毒。
4. 中镊敲碎蛋壳，沿气室线剥开。 5. 小镊撕内膜，挑出鸡胚→ A清洗,剪去头,肝,
腿,翅等。
标记气室示意图
含鸡胚鸡蛋示意图
本次实验内容
• 鸡胚是最小的不必考虑供应问题的动物 • 安全要求低
用品器材
1.超净工作台内： 污物缸1个、酒精喷壶1个、酒精灯2个、 酒精棉球1瓶、大镊子1把、打火机1个、 吸耳球2个、 1640培养基1瓶（方瓶） 、 Hank’s液 1瓶（圆瓶）；蛋座
2.塑料篮子内： 吸管1筒， 饭盒1只（内有胶塞、剪刀、镊子、培
不同的细胞系所需要的培养基是不同的。
（一）天然培养基： 类型：有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。 优点：营养成分丰富，培养效果好 缺点：1.来源受限。
2.成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果 的分析。
3.易发生支原体污染
（二）合 成 培 养 基
概念：是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用 人工方法模拟合成的。目前使用的合成培养基有 TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。
11. 加入3~4ml培养基,终止消化。用吸管充分吹 打7~8次;
12. 将细胞悬液用纱布过滤,进入20ml烧杯(凹面!) 用培养基清洗纱布2次,每次3~4ml;
13. 分别取2ml和4ml细胞悬液接种至两只培养瓶 中,补加培养液至总体积5ml;
14. 培养瓶加塞, 侧面标记。 37 ℃培养. 15. 15日（星期天）下午3:00来观察细胞,并进行
实验八、鸡胚细胞的原代培养-上课用
用品器材
1. 超净工作台内：
污物缸1个、酒精灯2个、酒精棉球2瓶、酒精喷壶1 瓶、大镊子2把、打火机1个、1mL移液器2把，1mL 枪头2盒、PBS 50mL(50mL离心管) 、 DMEM 15mL1 管(50mL离心管，2组共用)；
2. 眼科手术剪及镊子各1把，烧杯1个，带有纱布的 50mL锥形瓶1个。培养皿1个，一次性平皿2个，吸管 3根，吸耳球1个。
位置上降解蛋白，使细胞间结合处蛋白降解， 这时细胞由于自身内部细胞骨架的张力作用而 成为球形，从而使细胞分开。在pH为8.0、温 度为37℃时，胰酶溶液的作用能力最强。
注意：胰酶本身就是消化蛋白的，而细胞膜 又富含各种膜蛋白，消化过度会对细胞造成损 伤。
本次实验内容
原代培养的过程
取材——培养材料的制备 ——消化过滤——加培养
➢ 优点: 标准化生产，组分和含量相对固定，成本低 。 ➢ 缺点细胞生存，要想使细 胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基(如血 清)。
抗生素的使用
➢抗生素的作用：在培养液配制后，培养液 内常加适量抗生素，以抑制可能存在的细 菌的生长。
鸡胚成纤维细胞具有相对容易获得、 增殖能力强、适应性强、良好的耐受性、 性状比较稳定等特点,使得其被广泛地应 用于分子和细胞生物学研究的许多方面。
提纲
1.关于原代培养的概念 2.培养基的类型及配制 3.原代培养的过程 4.原代培养的注意事项 5.本次实验操作要点 6 .实践操作.
原代培养的概念
原代培养也称初代培养，严格的说即从体 内取出组织接种培养到第一次传代阶段，但实 际上，通常把第一代至第十代以内的培养细胞 统称为原代细胞培养。原代培养的细胞叫做细 胞株。一般持续1-4周。此期细胞呈活跃的移动， 可见细胞分裂，但不旺盛。原代培养细胞与体 内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。
【医学实验】禽流感病毒的鸡胚培养法 PPT课件
C. 加入蛋白酶消化液，密封于37℃消化 ； D. 消化结束后，吸去含酶溶液，加入蛋白酶抑制剂或者含有血清
的培养基，终止蛋白酶的活性； E. 用吸管吹打消化液，使单个细胞游离； F. 过滤离心收集单个细胞，以少量的培养液重新悬浮细胞； G. 用计数板计算细胞密度，调节细胞密度，接种。
在全生命期中此期的持续时间最长 细胞增殖旺盛，大多能维持二倍体核型 为保持二倍体细胞性质，细胞应在原代培养期或传代期早期 冻存。反复传代就有可能导致细胞失掉二倍体性质或发生转 化
衰退期： 一般情况下当传代10～50次左右，细胞增殖逐渐缓慢，以至
完全停止，细胞进入第三期衰退期。
细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖，最后衰退凋亡。
取材注意事项
1. 取材要准确 2. 因“材”制宜进行处理 3. 保持湿润 4. 使用锋利的刀剪，防止细胞损伤 5. 动作快，耗时越少越好，必要时可以使用低温（4℃） 6. 取材应注意组织类型、分化程度、供体年龄等。取材时应尽量
选用易培养的组织进行培养 7. 原代细胞取材时要同时留好组织学标本和电镜标本。对组织的
实验材料及器械
1. 已接种流感病毒的十日龄鸡胚 2. 无菌镊子、眼科剪刀、玻璃吸管、无 菌EP管（1.5和10mL各一个） 3. 75％酒精棉球
实验方法与步骤
1. 收获时间根据不同的病毒而异，流感病毒一 般培养36～48小时即可进行收获。收获前一 天晚上，将鸡胚于4℃冰箱过夜（如果急于 收获亦可于－20℃放置1小时左右），将鸡 胚冻死，使红血球凝固，这样可避免在收获 时流出的血细胞，同尿液或羊水里的病毒发 生凝集，造成病毒滴度的下降。
病毒的鸡胚培养法
1911年 Rous首先将鸡胚应用于Rous肉瘤病 毒的培养
鸡胚成纤维细胞的原代培养
鸡胚成纤维细胞的原代培养171850044生拔钱诗晨一、背景知识1.1原代培养与传代培养1.1.1原代培养是指直接从生物体取材（细胞、组织或器官）进行的第一次培养（中途不分割培养物、不更换培养物的生长器皿）。
1.1.2传代细胞培养分割细胞培养物进行的再配养注：细胞培养的代不是指细胞分裂次数，而是指培养的次数1.2细胞体外培养要求的条件✓无菌✓适宜温度：哺乳动物细胞36.5℃ 0.5℃，植物细胞原生质体25℃左右✓生理渗透压✓适宜酸碱度：7.2-7.4✓气体：95%空气+5%二氧化碳✓培养基：提供水、各种有机营养（糖、氨基酸、维生素等）及无机盐、生长调节因子等1.3培养细胞生长类型悬浮型：培养时不黏附于支持物之上。
而呈现悬浮生长的细胞。
贴壁型：培养时需要黏附于一定固相支持物表面才能很好生长的细胞。
又称黏附依赖型细胞（分如下四类）✧成纤维细胞：胞体呈梭形或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。
✧上皮型：细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。
✧游走型：呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。
此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。
在一定条件下，如培养基化学性质变动等，它们也可能成纤维细胞形态。
✧多形型：是一些形态上不规则的细胞。
细胞一般分胞体和胞突两部分，胞体呈不规则多边形，胞突呈细长丝状。
如神经元和神经胶质细胞1.4原代细胞培养的一般办法1.4.1植块培养法直接将组织块接入培养皿底部，待组织块贴牢在底部后再加入培养基培养的方法1.4.2离散细胞培养法用酶消化组织，使细胞之间连接破坏，将组织离散成单细胞悬液进行培养的方法注：原代培养中的植块培养法与组织培养不是一回事；植物组织培养又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织、器官或细胞、原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。
鸡胚成纤维细胞制备-优秀PPT文档
实验步骤
（3）胚体匀浆 用灭菌剪将胚体剪碎至1mm3小碎块。加入PBS（淹住
组织碎块即可），轻摇，静置1-2min，待组织块下沉，吸去上 层悬液。重复2-3次（以除去其中的红细胞），至上悬液不混 浊为止，移入灭菌的锥形瓶中，吸去PBS。
实验步骤
2、分散细胞 （1）胰酶消化
将剪碎的组织块放入锥形瓶中，加入适量的胰酶。包 紧瓶口，37℃水域消化30min，每隔5min轻轻摇动1次。当组织 块变得蓬松透明时，吸弃消化液，用PBS洗两遍，中止消化。 如再继续消化，可破坏细胞膜而不易贴壁生长，如果消化不够， 则细胞不易分散。
实验步骤
（四）细胞形态观察 检查时注意培养液的颜色变化，变黄但不混浊表示有
细胞生长，变红表示细胞未生长或生长不佳。37℃培养24-48h 后，于倒置显微镜下观察，细胞可以长成单层，细胞透、整个过程严格无菌操作 2、培养液不要太多，应有足够的空间保证细胞对氧的需要 3、放入CO2培养箱培养时，将CO2浓度控制在5%。 4、吸除消化液，向瓶内注入PBS数毫升，轻轻转动培养瓶，把 残余消化液冲掉。注意冲洗细胞时，动作要轻，以免把已松动 的细胞冲掉流失，如用胰蛋白酶液单独消化，吸除胰酶液后， 可不用PBS冲洗，直接加入培养液。 5、细胞培养对玻璃器皿洗涤要求严格，彻底洗涤后用蒸馏水 冲洗，再用双蒸水冲洗，干燥 灭菌后备用。所有的溶液都要 用双蒸水配制，所用药品试剂用分析纯。
鸡胚成纤维细胞元代培养
CEF的培养是在一定条件下，在体外模拟体内生理环 境，使从体内取出的成纤维组织细胞生存、生长和传 代，并维持原有组织细胞的结构和功能特性。
实验原理
病毒能在易感的组织或单层细胞内增殖，并可产生细胞病变，因此， 细胞培养是病毒学研究的重要手段，是进行病毒性疫苗生产和病毒性 疾病诊断必不可少的工具。原代细胞培养是体外制备细胞培养物的必 经过程，从供体体内取出组织分散成单个细胞接种于培养液中为初次 培养，从初次培养到第一次传代培养为原代培养。本实验以鸡胚成纤 维细胞作为原代细胞，通过细胞培养实践操作，认识和体会原代细胞 的制备方法和影响细胞培养的主要因素，并掌握原代细胞培养的方法。