酒曲中根霉菌的分离纯化

酒曲中根霉菌的分离纯化

一、实验目的：

1、了解酒曲的多种形态、其中的主要微生物及其在米酒发酵中的作用

2、根据根霉菌生长特性设计特有的分离及形态观察方法

3、掌握倒平板的方法和分离纯化微生物的基本操作

二、实验原理：

酒曲中通常含有根霉、毛霉及酵母菌，还有一些特有的酶类，在米酒酿造中根霉菌通常起双边发酵的作用，因此根霉种类、发酵特性对于产品的特性品质具有非常重要的意义。

根霉在人工培养基或自然基物上生长时，菌丝体向空间延伸，遇光滑平面后营养菌丝体形成葡蔔枝，节间产生假根，假根处葡蔔枝上着生成群的孢子囊梗，柄顶端膨大形成孢子囊，囊内产生孢子囊孢子。进行根霉菌分离时常利用此生长和形态特性判断是否根霉菌，再挑取单个孢子囊孢子进行纯化。

马铃薯葡萄糖培养基（PDA）被广泛用于培养霉菌和酵母菌，它是半合成培养基。

三、试剂和器材：

培养基制备材料：马铃薯、葡萄糖、琼脂

溶液和试剂：无菌水、乳酸石炭酸棉染液、

仪器和其他用品；酒曲，盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶、无菌培养皿，载玻片，吸管、接种环、无菌玻璃涂棒、显微镜等

四、方法与步骤：

1.培养基的制备

培养基的配方如下：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15-20g、水1000ml、

PH自然

（1）培养基制备：将马铃薯去皮，切成块煮沸半小时，然后用纱布过滤备用。称取加入20g葡萄糖和4g琼脂与适量水放于三角烧瓶中加热溶解，待融化后不足水至1000ml并加入马铃薯充分搅匀。

（2）分装：按实验要求取适量配制的培养基分装在试管内用于纯化培养。由于是固体培养基，装量宜不超过管高的1/5，灭菌后制成斜面。

（3）加塞：培养基分装后，在试管口塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养

基内而造成污染。

（4）灭菌：将分装的培养基以0.1MPa,121℃，高压蒸汽灭菌20min。

（5）搁置斜面：将灭菌的试管培养基冷至50℃左右（以防斜面上冷凝水太多），将试管口端搁在玻璃棒或者合适高度的器具上，搁置的斜面长度以不超过试管总长度的一半为宜。

（6）无菌检查；将灭菌培养基放入37℃的温室中培养24—48小时，以检查灭菌是否彻底。

2.稀释涂布平板法

（1）倒平板：将马铃薯培养基冷至55-60℃均匀地倒入平板，倒3皿

（2）制备酒曲稀释液：称取酒曲样10g，放入盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振荡约20min，使细胞分散。用一支1ml无菌吸管吸取1ml 酒曲悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，此为10-2稀释液，一次类推制成10-3、10-4、10-5、和10-6几种稀释度的酒曲溶液。

（3）涂布：将上述培养基的平板底部用记号笔分别写上10-4、10-5和10-6三种稀释度字样，然后用无菌吸管分别由10-4、10-5和10-6管酒曲稀释液中吸取0.2ml放入平板中央，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，起方法是将菌液先沿一条直线轻轻地来回推动，使之分布均匀，然后改变方向90°沿另一垂直线来回推动，平板内边缘处课改变方向用涂棒在涂布几次，温室下静置5-10min。

（4）培养：将平板倒置于28℃温室中培养12-24h。

（5）挑菌落：将培养后长出的单个菌落挑取少许菌苔接种在斜面上，置于28℃温室培养；待菌苔长出后检查其特征是否一致，同时将细胞图片染色后用显微镜检查是否为单一的微生物细胞。若发现有杂菌，须再次进行分离和纯化。

3.平板划线分离

（1）按稀释涂布平板法倒平板，并用记号笔表明培养基名称、溶液编号和实验日期等。

（2）划线：在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取上述10-2的酒曲稀释液一环在平板上划线。两种常用的划线方法如下：

I.划平行线：用接种环按无菌操作挑取一环稀释液，先在平板培养基的一边

做第一次平行划线3-4次，再转动平板70°角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后挑取稀释液穿过第一次划线部分进行第二次划线，再用同样的方法穿过第二次划线部分进行第三次划线或者再穿过第三次划线部分进行第四次划线。划线完毕后，盖上培养皿盖，倒置于温室培养。

II.将挑取有样品的接种环在平板培养基上作连续划线。划线完毕后，盖上培养皿盖，倒置于温室培养。

（3）挑菌落：从分离的平板上单个菌落挑取少许菌苔，涂在载玻片上，在显微镜下观察细胞的个体形态，结合菌落形态特征，综合分析。如不纯，仍需平板分离法进行纯化，直至确认为纯培养为止。

4.霉菌的制片

直接制片观察法：滴一滴乳酸石炭酸棉蓝染液与载玻片上，用镊子从根霉马铃薯琼脂培养物中取丝，先放入50%乙醇中浸一下洗去脱落的孢子，然后置于染液中，用解剖针小心将菌丝分开，去掉培养基，盖上盖玻片，用低倍镜和高倍镜镜检。