病原菌分离培养总结

病原菌得分离培养方法
一、基本原理
植物病原菌得分离培养，就是植物病理实验室工作中得基本技能。

为了获得某微生物得纯培养,一般就是根据该微生物对营养、酸碱度、氧气等条件要求不同,而供给它们适宜得生活条件,即让病原菌生活在适宜得培养基上，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长,而抑制其她菌生长得环境,从而得到纯菌株.
植物病原真菌得分离方法主要有组织分离法与稀释分离法两种.最常用得方法就是组织分离法,而稀释分离法主要用于病组织上产生大量孢子得病原真菌得分离。

为了获得分离菌得纯培养,必须要进行分离菌得纯化，纯化得方法类似于分离工作中采用得稀释分离法或划线分离法。

二．病原真菌得分离培养（花生褐斑病为例)
1.分离得准备工作
（１)分离材料准备:花生褐斑病叶片：病斑圆形或近圆形暗褐色、黑褐色,淡黄色晕圈。

背面有许多黑色小点,呈同心轮纹状排列。

(2)培养基得准备：PDA培养基,加热熔化,紫外灭菌后倒板；
（３)分离工作仪器与用品:超镜工作台、培养箱、无菌培养皿、剪刀、解剖刀、镊子、接种铲(针）、７0％酒精、0。

1%升汞、酒精灯、火机、记号笔、橡皮筋套、可调式电炉等。

（升汞就是剧毒药物,在操作时应特别小心)。

2.组织分离法
（1）工作前用肥皂洗手,无菌操作前还要用７0%酒精擦拭双手;在使用无菌操作间时，呼吸要轻,不要说话。

（2）酒精灯放入中间合适位置,点燃后不要在移动,保证火焰周围无菌环境;
（3）取花生褐斑病得症状典型病叶(或其她分离材料），选择典型得单个病斑，用剪刀或解剖刀从病斑边缘(病健交界处)切取小块病组织数块。

(选择新患病得组织作为分离得材料,可以减少腐生菌混入得机会。

腐
生菌一般在发病很久而已经枯死或腐败得部分滋生,因此，一般斑点
病害应在临近健全组织得部分分离。

)
（4）表面消毒:用菌培养皿一次准备流程(75％酒精—0、1%升汞—无菌水-无菌水—无菌水）,将病组织放人7０%酒精中浸3-5s后,按无菌操作
法将病组织移人０。

1%升汞液中分别表面消毒１miｎ左右（如植物
组织柔嫩,则表面消毒时间宜短;反之则可长些），然后放入灭菌水中连
续漂洗三次,除去残留得消毒剂。

（5）用无菌操作法将病组织移至平板培养基上，每皿内放3—5块。

(在将病组织小块移放到平板表面之前,应将其在无菌吸水纸上吸去多余得
水，以大大减少病组织附近出现细菌污染).
（6）将培养皿倒置放人25 ℃左右恒温箱内培养。

一般３－4d后观察待分离菌生长结果;若病组织小块上均长出较为一致得菌落,则多半为要分
离得病原菌。

（7）除根据菌落得一致性初步确定长出得菌落就是否目标菌外,还要在显微镜下检查，并且根据保湿培养得结果进一步确定;
（8）在无菌条件下,用打孔菌落边缘挑取小块移入培养基上,在25℃左右恒温箱内培养,数日后，观察菌落生长情况，如无杂菌生长,即得该分
离病菌纯菌种，便可保存。

三．病原细菌得分离培养(萝卜黑腐病为例）
1、分离得准备工作
(1)分离材料准备：萝卜黑腐病俗称黑心、烂心,该病就是由细菌引起得病害.主要危害叶与根。

幼苗期发病子叶呈水浸状,根髓变黑腐烂。

叶片发病,叶缘多处产生黄色斑,后变”V”字形向内发展，叶脉变黑呈网纹状,逐渐整叶变黄干枯．病菌沿叶脉与维管束向短缩茎与根部发展，最后使全株叶片变黄枯死．萝卜肉质根受浸染后,透过日光可瞧到暗灰色病变；横切萝卜可瞧到维管束呈放射线状、黑褐色;重者呈干缩空洞，维管束溢出菌脓,这一点与缺硼引起得生理性变黑不同。

(2)培养基得准备:PDA,后划线纯化NB;
(３）分离工作仪器与用品:超镜工作台、培养箱、无菌培养皿、剪刀、解剖刀、镊子、70%酒精、酒精灯、火机、记号笔、橡皮筋套、可调式电炉等。

２、黑腐病菌分离
(1）工作前用肥皂洗手,无菌操作前还要用70%酒精擦拭双手;在使用无菌操
作间时,呼吸要轻,不要说话。

(2)酒精灯放入中间合适位置，点燃后不要在移动,保证火焰周围无菌环境;
(３）取萝卜黑腐病块茎，用75 %酒精进行表面消毒；用灭菌解剖刀切去表面,并向内切取病组织，切成长条小块(２mm*３mm），用无菌操作法将病组织移至平板培养基上,每皿内放3—5块。

(在将病组织小块移放到平板表面之前,应将其在无菌吸水纸上吸去多余得水，以大大减少病组织附近出现细菌污染)。

（4)将培养皿倒置放人28 ℃左右恒温箱内培养。

一般3-4ｄ后观察待分离菌生长结果;若病组织小块上均长出较为一致得菌落，则多半为要分离得病原菌.
(５)根据菌落得一致性初步确定长出得菌落，选择长出得三种菌落(黄、红、生防）,分别在无菌条件下在ＮB培养基进行划线;在28℃左右恒温箱内培养,数经培养后出现得菌落在形态特征都趋于一致，并与典型描述得特征相一致时，即表明已获得纯培养;最好要经过连续三次单菌落得分离，才能确保纯化。

（６)观察到得菌落特征:萝卜黑腐病菌，圆形，同心环状,内环呈金黄色，外围白色菌脓,湿润，随环隆起、凹陷，半透明，边缘不整齐。

四。

资料查询其她分离培养方法
1、病原真菌
稀释分离法
（1)取灭菌培养皿三个,平放在湿纱布上，编号，并注明日期、分离材料及分离人姓名。

(２）用灭菌吸管吸取灭菌水,在每一皿中分别注入０。

５～1.0ml。

ﻫ(3)用移植环蘸一滴孢子悬浮液,与第一个培养皿中得灭菌水混合,再从第一个培养皿移三环到第二个培养皿中，混合后再移三环到第三个培养皿中.ﻫ（４)将熔化开冷却到4５~50Ｃ得培养基,分别倒在三个培养皿中（为防止细菌污染,也可以向每个培养皿中事先加入１—2滴25%乳酸)，摇匀，凝固,要使培养基与稀释得菌液充分混匀。

ﻫ提示:倒平板时得培养基温度一定要掌握好，过热易将病原菌烫死而使分离失败,过冷则倒入培养皿中后难以形成平板，而成为起伏不平得表面,不利于分离.为大体估计培养基温度，可将盛培养基得器皿靠在人手背上，如果手背感到烫但尚可以忍耐，则大体为45~50C。

ﻫ(５)将培养皿翻转后置恒温箱(25℃)中培养,数日后观察菌落生长情况.ﻫ（6）挑菌.将培养后长出较为整齐一
致得单个菌落分别挑取，接种到斜面培养基上,置25℃左右培养。

待菌长出后,检查菌就是否单纯,若有其她菌混杂,就要再一次进行分离纯化，直到获得纯株培养。

2、病原细菌
病原细菌得分离方法以稀释分离法与划线分离法为最常用。

在进行分离之前,首先应对病组织材料进行细菌学初步诊断,即经过镜检确认有喷菌现象以后，才对该病组织作分离工作.稀释分离法就是最经典得标准分离法,方法同上述真菌分离。

ﻫ除去上述稀释分离法以外,较为方便得就是划线分离法:ﻫ(１)预先把熔化好得肉膏蛋白胨培养基倒在培养皿中，凝成平板后,翻转放在30Ｃ恒温箱中2-4ｈ,使表面无水滴凝结。

也可凝成平板后直接使用。

ﻫ（２)将病组织先用0。

1％升汞表面消毒０。

５--2ｍiｎ,再用无菌水换洗3次后,放在灭菌培养皿中得灭菌水中,用灭菌玻棒研碎，并让组织碎块在水中浸泡２0—60mｉｎ,让细菌释放到灭菌水中。

(3)用灭菌得接种铒(接种环)蘸取浸泡液在干燥得培养基平板表面划线,尽量不要把平板表面划破。

划过第一批线后得接种环应放在火焰上烧灼.冷却后直接在第一批划线得末端向另一方向划线。

灭菌后再划第三次线.
提示：划过第一批线后接种铒放在火焰上烧过这一步骤非常重要,这样做可以使第一批线与第二批线上得细菌数量相差很大。

(4)用玻璃铅笔在培养皿上写上分离材料、日期与分离者姓名后，翻转培养皿，放在2６~28C恒温箱中培养。

1—3ｄ后观察有无细菌生长，在哪些地方有单菌落生长出来?其中得优势单菌落应为待分离菌形成得。

（５）仔细挑取病原菌得单菌落，并移植到斜面培养基上。

同时，再把单菌落用灭菌水稀释成悬浮液作第二次划线分离,经培养后出现得菌落在形态特征都趋于一致,并与典型描述得特征相一致时，即表明已获得纯培养。

最好要经过连续三次单菌落得分离,才能确保纯化。

五。

常用得几种典型得病原菌分离方法
1。

斑点病原菌得分离。

从病斑部分切取每边３—5mｍ得小块组织,在70%酒精中浸数秒钟后,移人0．１%得升汞水溶液中处理3-５rain,以灭菌水冲洗3次，移置培养皿得培养基中,然后培养。

2.维管束组织内病原菌得分离.从根茎维管束组织分离病菌,可先将寄主病部表面用7０%酒精擦拭消毒,将表皮组织用灭菌得解剖刀削去,然后切取其中小块变色得维管束组织,用升汞或漂白粉液消毒后,用灭菌水冲洗几次，移置培养基面上。

ﻫ
3.根腐病病原菌得分离．根腐或基腐病得分离,由材料得大小决定。

材料小得可仿照斑点病得分离法,材料大得则可以用维管束组织内病原得分离法．4．肉质组织中病原菌得分离。

多肉得根、茎及果实等，可以采用维管束组织内病菌分离法除去表面组织,切取小块病组织分离。

如有杂菌感染可采用“直接接种＂法,待出现症状后,用此法再行分离。

ﻫ5。

种子内病原菌分离．将整个种子或者种子得一部分进行表面消毒（升汞或漂白粉),用灭菌水洗涤后,移置培养基上.
６．孢子分离法。

能产生大量孢子得病菌如青霉素、链格孢等,则可配制成孢子悬浮液以稀释法或划线法分离之。

7．土壤带菌分离法.为了研究一些真菌在土壤中存活与分布得情形,从有病得土壤中分离它们就是必要得。

分离方法就是将土壤取出少许,配制成悬浮液，然后用稀释法或划线法分离。