(优质课件)非小细胞肺癌基因检测
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13
肿瘤组织标本的采集及病理评估
肿瘤组织标本
• 组织标本来源 •手术标本 •支气管下活检 •经皮穿刺活检
• 标本处理及贮存 •新鲜冻存：液氮或-80C •FFPE
组织切片
• H&E 染色片用于病理评估 • 白片用于提取DNA • 建议最少切片数：
--手术标本，5 µm X4 --小活检标本，5 µm X8
测序仪毛细管电泳
数据分析
16
ARMS法操作流程及数据解读
组织标本
DNA
ARMS反应
实时定量 PCR
数据分析
标本 ＃1
（突变阳性）
突变信号 (FAM)
突变信号:
+
内参信号:
+
标本 ＃2
（突变阴性）
内参信号 (HEX)
+
内参信号 (HEX)
17
测序法与ARMS法比较
敏感度 FFPE标本成功率 检测流程 数据分析要求 假阳性机会(交叉污染) 假阴性机会 仪器成本 商用试剂盒 试剂成本
细胞学标本：可用 原发灶与复发灶：只要能获得足够的癌细胞，均可；但对于复发
的患者，再次活检不仅可确诊，还可以获得分子标志物的进一步 信息。
10
标本因素对EGFR突变检测的影响
--肿瘤组织特点--
遗传异质性
正常细胞混杂
对检测方法敏感度有较高要求
11
标本因素对EGFR突变检测的影响
-来自百度文库组织标本种类--
2、基因突变是指DNA发生碱基序列的改变：须选择有针对性的检测手段，针对非 DNA的检测手段如：RT-PCR（检测RNA表达），免疫组化（检测蛋白表达）以及 针对非碱基序列的检测手段如：FISH（检测DNA的扩增、缺失、断裂、融合）等， 均不适用。
3
EGFR基因突变检测概念
EGFR突变检测指肿瘤组织中编码EGFR基因的DNA突变状态
9
标本问题
石蜡组织：尽可能送检一年内的石蜡标本。 石蜡切片：含肿瘤细胞越多越好（50%以上）；组织部位面积 约6mm x 6mm以上； 包埋组织：组织块不小于0.5×0.5×0.5（cm）。
新鲜组织：比石蜡等处理过的旧组织，DNA保存得更完整，对PCR 实验更有利，但一定要经病理学确认。 含有肿瘤组织50%以上；重量≥10ｍg（约米粒大小以上），经 PBS或生理盐水冲洗干净。 取癌组织的中心位置组织块（避开坏死区域），固定于10%中 性福尔马林溶液中，尽快送病理科。
2
EGFR突变检测中需要明确的几个基本概念
1、EGFR突变为体细胞突变：发生于肿瘤细胞中，正常细胞（癌旁或白细胞等）不 含突变。要尽可能取到足量的肿瘤细胞进行检测，这是保证检测结果可靠的根本前提。
体细胞突变 发生在非种系组织中
不具有遗传性 不会遗传给子代
种系突变 发生于精子或卵子中
可以遗传子代 子代所有细胞均带突变
冰冻新鲜组织
--外科手术标本 --小活检标本
固定包埋组织
--外科手术标本 --小活检标本
DNA质与量
完整，量多 完整，量少
片段化，量多 片段化，量少
适用方法
广泛 受限
受限 极度受限
对检测方法有相应要求，组织标本及DNA质控尤其重要
12
图4. EGFR基因检测使用的临床样本及其操作。A.被切成10微米的石蜡包埋标本。 B.在支气管镜下将刷检样本放在生理盐水中洗净（悬浮），可以就这样冷冻保存， C.进一步将该生理盐水液离心，沉淀溶解于AL缓冲液，此状态可以室温保存。
测序法 20-30%
低 复杂慢长
高 多 多 高 无 低
ARMS 1% 高
简单快速 低 少 少 低 有 略高
18
小结：
了解你的标本
--新鲜/冰冻组织>FFPE组织 --手术标本>小活检标本
选择合适的方法
--ARMS是目前较敏感快速方法，且容易开展 --测序是传统的方法，但敏感度有限，过程复杂，不易普及
4
NSCLC中EGFR酪氨酸激酶区突变种类
Nature Review 2007, 7:169 5
6
EGFR 突变检测流程
标本采集及病理评估
DNA 抽提及质控 EGFR突变检测 ARMS 测序法 其它方法
检测报告
7
EGFR突变检测中的相关角色
患者
临床医生
肿瘤科医生 放疗科医生 呼吸科医生
病理学评估
• 非小细胞性肺癌诊断及类型 • 肿瘤细胞比例 • 肿瘤细胞总数 • 标识肿瘤丰富的区域富集肿瘤
细胞
14
检测方法
目前 EGFR 基因突变的检测方法很多 DNA 直接测序法应用广泛，可检测已知的突变和未知的突变，但对标
本的肿瘤细胞含量要求较高，一般要求标本中肿瘤细胞的比例在 50% 以上，至少不低于 30%。基于实时荧光定量 PCR 基础上的方法（如 ARMS 法）较直接测序法更加敏感，可检测样品中 1.0%~0.1% 的突变 基因，更适合用于肿瘤细胞含量较少的小标本检测。
做好组织标本及DNA质控是关键 非肿瘤组织标本的有效利用
报告结果给临床医生
内镜医师
胸外科医师 收集肺癌组织标本
病理科医生 准备样本
实验室人员 实验操作及结果分析
8
用于EGFR突变检测的标本
• 肿瘤组织—目前最可靠的标本；
• 其它样本： 外周血（血浆、血清） 细胞学 （胸水、痰液细胞学） 支气管刮取物
仍需进一步研究确定 这些样本在临床实践 及诊断中的应用
ARMS 方法操作简单，是目前临床上较常用的方法之一，但只能检测已
知的突变，且标本需进行预处理，检测费用较高。
15
直接测序法流程及数据分析
组织标本
DNA
PCR**
电泳质控
纯化
**PCR是关键： --特异性 --产物长度 --必要时巢式 --建议通用测序引物
测序反应 纯化
EGFR deletion EGFR L858R
非小细胞肺癌基因检测
1
前言
随着分子医学进展和靶向药物的不断涌现，晚期非小细胞肺
癌（NSCLC）的治疗已进入到个体化治疗的时代。
目前临床应用的个体化靶向治疗主要针对EGFR突变型和
ALK融合基因型肺癌,这两种基因变异型肺癌均具有明确的 分子靶点、靶点检测技术及上市的靶向药物，临床疗效得到 明显提高。
检测
并不是：
X EGFR基因DNA拷贝数的检测（FISH法）
EGFR蛋白表达量的检测（IHC法）。
EGFR检测 基因突变
拷贝数
蛋白表达 RNA表达
检测物质 DNA
DNA
蛋白质 RNA
部位 细胞核
细胞核
细胞膜 细胞核
方法
测序法、ARMS 法等
荧光原位杂交法 （FISH）
免疫组化法（IHC）
RT-PCR
肿瘤组织标本的采集及病理评估
肿瘤组织标本
• 组织标本来源 •手术标本 •支气管下活检 •经皮穿刺活检
• 标本处理及贮存 •新鲜冻存：液氮或-80C •FFPE
组织切片
• H&E 染色片用于病理评估 • 白片用于提取DNA • 建议最少切片数：
--手术标本，5 µm X4 --小活检标本，5 µm X8
测序仪毛细管电泳
数据分析
16
ARMS法操作流程及数据解读
组织标本
DNA
ARMS反应
实时定量 PCR
数据分析
标本 ＃1
（突变阳性）
突变信号 (FAM)
突变信号:
+
内参信号:
+
标本 ＃2
（突变阴性）
内参信号 (HEX)
+
内参信号 (HEX)
17
测序法与ARMS法比较
敏感度 FFPE标本成功率 检测流程 数据分析要求 假阳性机会(交叉污染) 假阴性机会 仪器成本 商用试剂盒 试剂成本
细胞学标本：可用 原发灶与复发灶：只要能获得足够的癌细胞，均可；但对于复发
的患者，再次活检不仅可确诊，还可以获得分子标志物的进一步 信息。
10
标本因素对EGFR突变检测的影响
--肿瘤组织特点--
遗传异质性
正常细胞混杂
对检测方法敏感度有较高要求
11
标本因素对EGFR突变检测的影响
-来自百度文库组织标本种类--
2、基因突变是指DNA发生碱基序列的改变：须选择有针对性的检测手段，针对非 DNA的检测手段如：RT-PCR（检测RNA表达），免疫组化（检测蛋白表达）以及 针对非碱基序列的检测手段如：FISH（检测DNA的扩增、缺失、断裂、融合）等， 均不适用。
3
EGFR基因突变检测概念
EGFR突变检测指肿瘤组织中编码EGFR基因的DNA突变状态
9
标本问题
石蜡组织：尽可能送检一年内的石蜡标本。 石蜡切片：含肿瘤细胞越多越好（50%以上）；组织部位面积 约6mm x 6mm以上； 包埋组织：组织块不小于0.5×0.5×0.5（cm）。
新鲜组织：比石蜡等处理过的旧组织，DNA保存得更完整，对PCR 实验更有利，但一定要经病理学确认。 含有肿瘤组织50%以上；重量≥10ｍg（约米粒大小以上），经 PBS或生理盐水冲洗干净。 取癌组织的中心位置组织块（避开坏死区域），固定于10%中 性福尔马林溶液中，尽快送病理科。
2
EGFR突变检测中需要明确的几个基本概念
1、EGFR突变为体细胞突变：发生于肿瘤细胞中，正常细胞（癌旁或白细胞等）不 含突变。要尽可能取到足量的肿瘤细胞进行检测，这是保证检测结果可靠的根本前提。
体细胞突变 发生在非种系组织中
不具有遗传性 不会遗传给子代
种系突变 发生于精子或卵子中
可以遗传子代 子代所有细胞均带突变
冰冻新鲜组织
--外科手术标本 --小活检标本
固定包埋组织
--外科手术标本 --小活检标本
DNA质与量
完整，量多 完整，量少
片段化，量多 片段化，量少
适用方法
广泛 受限
受限 极度受限
对检测方法有相应要求，组织标本及DNA质控尤其重要
12
图4. EGFR基因检测使用的临床样本及其操作。A.被切成10微米的石蜡包埋标本。 B.在支气管镜下将刷检样本放在生理盐水中洗净（悬浮），可以就这样冷冻保存， C.进一步将该生理盐水液离心，沉淀溶解于AL缓冲液，此状态可以室温保存。
测序法 20-30%
低 复杂慢长
高 多 多 高 无 低
ARMS 1% 高
简单快速 低 少 少 低 有 略高
18
小结：
了解你的标本
--新鲜/冰冻组织>FFPE组织 --手术标本>小活检标本
选择合适的方法
--ARMS是目前较敏感快速方法，且容易开展 --测序是传统的方法，但敏感度有限，过程复杂，不易普及
4
NSCLC中EGFR酪氨酸激酶区突变种类
Nature Review 2007, 7:169 5
6
EGFR 突变检测流程
标本采集及病理评估
DNA 抽提及质控 EGFR突变检测 ARMS 测序法 其它方法
检测报告
7
EGFR突变检测中的相关角色
患者
临床医生
肿瘤科医生 放疗科医生 呼吸科医生
病理学评估
• 非小细胞性肺癌诊断及类型 • 肿瘤细胞比例 • 肿瘤细胞总数 • 标识肿瘤丰富的区域富集肿瘤
细胞
14
检测方法
目前 EGFR 基因突变的检测方法很多 DNA 直接测序法应用广泛，可检测已知的突变和未知的突变，但对标
本的肿瘤细胞含量要求较高，一般要求标本中肿瘤细胞的比例在 50% 以上，至少不低于 30%。基于实时荧光定量 PCR 基础上的方法（如 ARMS 法）较直接测序法更加敏感，可检测样品中 1.0%~0.1% 的突变 基因，更适合用于肿瘤细胞含量较少的小标本检测。
做好组织标本及DNA质控是关键 非肿瘤组织标本的有效利用
报告结果给临床医生
内镜医师
胸外科医师 收集肺癌组织标本
病理科医生 准备样本
实验室人员 实验操作及结果分析
8
用于EGFR突变检测的标本
• 肿瘤组织—目前最可靠的标本；
• 其它样本： 外周血（血浆、血清） 细胞学 （胸水、痰液细胞学） 支气管刮取物
仍需进一步研究确定 这些样本在临床实践 及诊断中的应用
ARMS 方法操作简单，是目前临床上较常用的方法之一，但只能检测已
知的突变，且标本需进行预处理，检测费用较高。
15
直接测序法流程及数据分析
组织标本
DNA
PCR**
电泳质控
纯化
**PCR是关键： --特异性 --产物长度 --必要时巢式 --建议通用测序引物
测序反应 纯化
EGFR deletion EGFR L858R
非小细胞肺癌基因检测
1
前言
随着分子医学进展和靶向药物的不断涌现，晚期非小细胞肺
癌（NSCLC）的治疗已进入到个体化治疗的时代。
目前临床应用的个体化靶向治疗主要针对EGFR突变型和
ALK融合基因型肺癌,这两种基因变异型肺癌均具有明确的 分子靶点、靶点检测技术及上市的靶向药物，临床疗效得到 明显提高。
检测
并不是：
X EGFR基因DNA拷贝数的检测（FISH法）
EGFR蛋白表达量的检测（IHC法）。
EGFR检测 基因突变
拷贝数
蛋白表达 RNA表达
检测物质 DNA
DNA
蛋白质 RNA
部位 细胞核
细胞核
细胞膜 细胞核
方法
测序法、ARMS 法等
荧光原位杂交法 （FISH）
免疫组化法（IHC）
RT-PCR