蛋白免疫印迹半定量分析在药理学研究中的影响因素
蛋白质免疫印迹的原理和方法
蛋白质免疫印迹的原理和方法说实话蛋白质免疫印迹这事，我一开始也是瞎摸索。
先来说说原理吧。
我理解这个蛋白质免疫印迹呢，就有点像在一群小珠子（代表各种蛋白质）里找特定形状（特定蛋白质）的珠子。
我们利用抗原和抗体特异性结合这个特性。
样本里那些蛋白质就是小珠子，我们有能识别特定蛋白质（也就是特定抗原）的抗体，这就像拿个特制的小夹子去夹我们要找的那种形状的珠子。
一旦夹住了（结合了），我们就能检测到特定蛋白质的存在啦。
再讲讲方法吧。
我刚开始的时候那真是一头雾水。
首先是跑胶，这就好像是一场运动会的长跑赛道。
蛋白质样品就像一个个小运动员，根据它们大小的不同，在电场这个“发令枪”下达之后，跑得快（分子量小的）的在前面，跑得慢（分子量大的）在后面。
接下来是转膜，这一步我可犯了不少错。
我就想啊，这就好比让那些小运动员从跑道“飞”到旁边的大纸上（膜）。
我第一次转膜的时候，电流大小没设置好，那结果惨不忍睹啊。
后来才知道，就像小孩过马路要有大人领着，合适的电流就像那个领路人，能确保蛋白质顺利转运到膜上。
然后就是封闭这一步。
我感觉这时候就像在敌人（非特异性结合的东西）来之前，筑起一道墙（封闭液）。
我当时试过不同的封闭液，结果发现不同的样本和抗体可能适合不同的封闭液，这得摸索，可不能一股脑乱试。
之后就是加一抗，这一步可得小心。
一抗就是我们找特定蛋白质的关键工具。
我记得有一次，一抗的浓度我没调好，要么检测不到信号，要么整个膜黑乎乎一片，就像涂鸦画乱了一样。
后来多试几次才弄明白合适的浓度范围。
再然后加二抗，二抗就像个二传手，它能和一抗结合，还带着一种能被检测到的信号标记。
在曝光的时候，这个标记就像手电筒一样，把我们要找的蛋白质照亮，这样我们就能看到它们的存在啦。
不过二抗也得注意保存和使用，我有次二抗被污染了，整个结果就不对了。
总之啊，做蛋白质免疫印迹，每一步都要谨慎。
就像走钢丝一样，稍有不慎就可能掉下去摔得很惨，但是只要多摸索，积累经验，最终肯定能成功。
蛋白质免疫印迹技术
将蛋白质免疫印迹技术与基因测序技术相结合，有助于解析基因表达与蛋白质功能之间的关联，为精准医学和个性化 治疗提供有力支持。
与单细胞测序技术结合
通过将蛋白质免疫印迹技术与单细胞测序技术相结合，可以在单细胞水平上研究蛋白质的表达和功能， 揭示细胞异质性和疾病发生发展机制。
THANKS FOR WATCHING
改进方向
优化样品处理方法 简化样品制备过程，提高处理效 率，降低对实验技能的要求。
提高检测灵敏度和特异性 通过改进技术和方法，提高蛋白 质免疫印迹技术的检测灵敏度和 特异性，进一步减少背景干扰和 假阳性结果。
缩短实验周期 通过改进技术和方法，减少实验 步骤和时间，提高实验效率。
降低成本 寻找更经济实惠的抗体、显影剂 和其他试剂，降低实验成本。
研发自动化、智能化的蛋白质免 疫印迹系统，简化操作流程，减 少人为误差，提高实验效率和准 确性。
定量分析能力
发展蛋白质免疫印迹技术的定量 分析能力，实现蛋白质表达水平 的准确测量，为深入研究生物过 程和疾病机制提供有力支持。
应用领域的拓展
临床诊断
将蛋白质免疫印迹技术应用于临床诊断，为疾病诊断、病情监测和 预后评估提供可靠的蛋白质标志物检测手段。
转膜
选择合适的转移膜
根据实验需求，选择适当的转移 膜，如硝酸纤维素膜或聚偏二氟
乙烯膜。
预处理转移膜
将转移膜在缓冲液中浸泡，使其充 分湿润。
转膜
将凝胶上的蛋白质条带转移到预处 理的转移膜上，完成转膜过程。
抗体孵育与显色
01
一抗孵育
将特异性抗体与转印到膜上的蛋 白质进行孵育，使抗体与目标蛋 白质结合。
原理
基于抗原-抗体反应的特异性，通过将蛋白质样品电泳分离后转印至固相支持物 上，再与特异性抗体进行反应，通过显色反应检测目标蛋白质的存在、表达量 及修饰状态等信息。
药物分析中的分子印迹技术研究
药物分析中的分子印迹技术研究随着现代科学技术的发展，药物研究和分析成为了医药领域中的重要研究方向之一。
药物的分析需要准确、灵敏的方法来确定其成分和性质，其中分子印迹技术作为一种重要的分析方法逐渐受到了广泛的关注和应用。
本文将介绍药物分析中的分子印迹技术的原理、应用以及未来的发展前景。
一、分子印迹技术的原理分子印迹技术是一种基于分子的选择性识别的方法，其原理是通过将目标分子与功能单体在特定的环境中发生共价或非共价的相互作用，从而形成一种特异性的“印记”。
这些“印记”可以通过洗脱目标分子来得到纯净的目标分子。
在分子印迹技术中，功能单体是关键的组成部分。
功能单体通过与目标分子之间的相互作用而改变其分布和构型，形成一种高度特异性的配位环境。
随着功能单体与目标分子的相互作用的发生，这种配位环境将被固定在聚合物中，形成具有特异性的识别位点。
二、分子印迹技术在药物分析中的应用1. 药物分析中的定量测定分子印迹技术可以用于药物分析中药物的定量测定。
通过选择具有高亲和力的功能单体和适当的聚合物，可以提高对目标分子的选择性，从而实现对药物的定量测定。
这种方法不仅具有高灵敏度，还具有较低的检测限和较好的重现性。
2. 药物分析中的药物检测分子印迹技术还可以用于药物的检测。
通过将功能单体与目标分子相互作用形成的识别位点固定在传感器上，可以实现对药物的快速、准确的检测。
这种方法具有高选择性和高灵敏度，对于复杂样品中的药物检测具有一定的优势。
3. 药物分析中的样品预处理在药物分析中，样品预处理是一个重要的环节。
分子印迹技术可以通过聚合物对目标分子的选择性吸附和分离，实现对样品的预处理。
这种方法可以减少样品中的干扰物质，提高分析的准确性和灵敏度。
三、分子印迹技术的未来发展前景分子印迹技术在药物分析领域具有广阔的应用前景。
随着科学技术的不断进步，分子印迹技术将不断得到改进和完善。
未来的发展方向主要包括以下几个方面：1. 新型功能单体的研究开发新型功能单体是分子印迹技术发展的重要方向之一。
蛋白质考题及答案解析
蛋白质结构与功能试题一、问答题：1.影响蛋白质二级结构改变的因素有哪些？参考答案：温度；pH；邻近氨基酸残基的二级结构倾向；肽链中远程肽段的影响；肽段是处于分子表面还是被包埋在分子内部2.如下图所示。
多聚谷氨酸poly (Glu) 是由多个L-Glu聚合形成的多肽链，在pH为3的溶液中能形成a-螺旋构象，当pH升高到7时，则由a-螺旋变为无规卷曲，旋光率陡然下降。
同样，多聚赖氨酸poly (Lys) 在pH为10的溶液中具有a-螺旋结构，当pH降低至7时，旋光率也发生陡然下降，由a-螺旋结构变为无规卷曲。
请解释pH对poly (Glu) 和poly (Lys) 构象变化的影响。
答案要点：pH=3接近Glu g-COOH的p K R (4.07)，侧链基团为质子化不带电荷状态，可形成a-螺旋结构。
其余情况按此思路分析。
Lys e-NH2 p K R 为10.54。
3.胶原蛋白的结构特点（原胶原分子的一级结构和高级结构）1)在体内，胶原蛋白以胶原纤维的形式存在，胶原纤维的基本结构单位是原胶原分子2)每个原胶原分子由三条左手螺旋的a链（a-肽链）组成右手超螺旋结构，每条a链约含1000个氨基酸残基3)a链间靠H-键和范得华力维系，胶原纤维可以通过分子内和分子间的进一步交联增强稳定性4)a链一级结构序列96%遵守(Gly-X-Y)n。
x多为脯氨酸Pro；y多为羟基脯氨酸Hyp或羟基赖氨酸Hly5)胶原蛋白是糖蛋白，少量糖与5-羟赖氨酸(Hyl)残基的碳羟基共价连接6)具有较好的弹性和抗张强度4.形成结构域的意义是什么？参考答案：1)各结构域分别折叠，其动力学上更有利2)结构域自身紧密装配，结构域之间的柔性连接使每个结构域间可以作较大幅度的相对运动3)多个结构域形成的间隙部位往往是蛋白质的功能部位，结构域的相互作用有利于蛋白质分子产生别构效应5.简述三种浓缩蛋白质溶液的方法及原理1)超滤法：将蛋白质样品装入适当的超滤管中，经一定时间离心，溶剂穿过超滤管滤膜流出而使蛋白质溶液得以浓缩2)硫酸铵沉淀法：通过盐析作用使蛋白质在高浓度中性盐中析出而浓缩。
剖析蛋白免疫印迹半定量在药理学研究中的影响
剖析蛋白免疫印迹半定量在药理学研究中的影响蛋白免疫印迹( Western blot) 是当前蛋白分析的一种常规技术，它结合了电泳的高分辨率和酶免疫测定的高敏感性和特异性，用于检测样品中特异蛋白存在与否、细胞中特异蛋白的半定量分析和蛋白质分子相互作用的研究。
在药理学研究中，使用蛋白免疫印迹分析通常都是为了半定量检测某种目的蛋白的相对表达量，常采用灰度分析软件检测目的蛋白及内参条带的表达强度，以分析药物等处理因素对目的蛋白的影响。
但由于该检测方法步骤较繁琐，实验变量较多，结果不稳定等特性，使得应用该法测定组织中的目的蛋白浓度时常常会遇到困难，需花费大量的人力物力财力和时间去摸索实验条件。
虽然各种教科书和网络上都有讨论如何做好蛋白免疫印迹分析，并提出各种注意事项，但作为药理学工作者，仅有这些常识仍不能很好完成药理学评价，甚至做出相反的实验结果。
本实验从实验实践分析出发，讨论蛋白免疫印迹半定量分析在药理学研究中的影响因素及处理方法，为广大药理学工作者提供参考。
1 实验材料1. 1 细胞丙型肝炎病毒( HCV) 感染的人肝传代细胞系Huh7. 5 细胞，用0. 05%-EDTA 胰酶消化传代，用含10%灭活胎牛血清及每毫升100 单位青霉素和100 单位链霉素的DMEM 培养基正常传代和富集培养。
1. 2 主要生化试剂DMEM、胎牛血清( 美国GiBco 公司) ; 细胞总蛋白提取试剂CytobusterTM Protein Extraction Reagent( 美国Novagen 公司) ; 蛋白酶抑制剂Complete proteaseinhibitor cocktail tables( 德国Roche Applied Science公司) ; Penicillin-Streptomycin 双抗、PBS、0. 05%-EDTA 胰酶均( 中科迈晨科技有限公司) ;5 × Loading Buffer ( Lane Marker Sample Buffers ) 、PageRulerTM Prestained Protein ladder、PierceTM BCAProtein Assay Kit( Thermo Scientific 公司; 30% 丙烯酰胺溶液、1. 5 mol·L - 1 Tris-Cl ( pH 8. 8) 、1 mol·L - 1 Tris-Cl ( pH 6. 8) 、10%SDS 溶液、TEMED、过硫酸铵、三羟基氨基甲烷Tris 碱、甘氨酸、十二烷基硫酸钠SDS( 北京普利莱基因技术有限公司) ; 聚山梨酯20( 西陇化工股份有限公司) 。
蛋白质免疫印迹技术
2
特异性
该技术能够高度特异性地识别并检测目标蛋白,即使在复杂的生物样品中也不会产生交叉反应。
3
检测限
得益于优化的实验步骤和灵敏的检测方法,免疫印迹技术的检测限可达到皮克摩尔级别,能够灵敏检测极微量的目标蛋白。
4
重复性
该技术具有良好的实验重复性,可以准确定量并复制实验结果,为蛋白质研究提供可靠的数据支持。
蛋白质定量分析
可以利用Western blot结果对特定蛋白的相对含量进行定量分析,为进一步的生物学研究提供数据支持。
结果可视化展示
Western blot采用化学发光检测,可以清晰地显示蛋白条带,结合分子量标准进行数据分析和解读。
实验数据处理
数据分析
实验结果的数据处理通常包括绘制图表、统计分析和计算参数。数据分析可以揭示实验结果的趋势和特点,为后续的实验设计和结果解释提供依据。
技术改进方向
提高灵敏度
通过优化实验条件和试剂配方,不断提高免疫印迹技术的检测敏感度,以更准确地识别低丰度蛋白。
增强特异性
开发高特异性的抗体,减少非特异性结合,提升识别目标蛋白的准确性。
自动化集成
将实验流程进行自动化处理,实现样品预处理、电泳、转膜、免疫反应等步骤的高度整合,提高操作效率。
数据分析优化
2
结果解释和分析
对实验结果进行深入分析,阐述结果的意义和影响,讨论可能的影响因素。提出合理的解释和推论。
3
图表展示质量
使用恰当的图表、图像等辅助手段,直观、生动地展示实验结果。确保图表制作规范,便于理解和分析。
4
结论和建议
根据实验结果提出明确的结论,并提出后续研究或应用的建议,为后续工作提供参考。
实验设备
肺癌肿瘤标志物及其检测方法的研究进展
肺癌肿瘤标志物及其检测方法的研究进展张唯伟;兰文军【摘要】详细描述了CEA、Cyfra21-1、NSE等肺癌肿瘤标志物及其检测方法的研究成果。
肿瘤标志物的检测方式主要有放射免疫分析、酶联免疫分析、化学发光免疫分析、蛋白质免疫印迹、微球悬浮阵列技术以及聚合酶链反应。
以上几种检测方法对肺癌诊断研究有重要的应用价值。
【期刊名称】《齐鲁工业大学学报：自然科学版》【年(卷),期】2018(032)002【总页数】5页(P54-58)【关键词】肺癌;肿瘤标志物;检测方法;研究进展【作者】张唯伟;兰文军【作者单位】齐鲁工业大学（山东省科学院）生物工程学院,济南250353;齐鲁工业大学（山东省科学院）生物工程学院,济南250353;【正文语种】中文【中图分类】Q812据全球癌症统计报告,肺癌尤其是非小细胞肺癌(NSCLC)在癌症患者中最为常见。
非小细胞肺癌(NSCLC)占据肺癌患者的85%,还有少部分肺癌患者是小细胞肺癌(SCLC),其中约一半的患者在限制性疾病和延长性疾病中被确诊。
血清肿瘤标志物被认为是肺癌诊断的有效手段,越来越多的证据表明肿瘤标记物可以提供非小细胞肺癌患者的预后信息。
肿瘤标志物是由肿瘤相关基因异常表达而产生的特异性大分子物质,这些物质分布在组织、体液和血液中。
血清肿瘤标志物作为诊断工具,具有创伤小、检测迅速等优点,被广泛应用于恶性肿瘤诊断[1]。
1 肺癌肿瘤标志物肿瘤标志物主要有五种应用：筛选、监测疾病的进展、预后指标、检测复发、诊断工具[2]。
肺癌肿瘤标志物主要分为核酸类、蛋白类、外泌体三大类。
癌胚抗原(CEA)、细胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、CA-125、鳞状细胞癌抗原(SCC),都是临床研究常用的蛋白类肺癌肿瘤标志物,均已表现出了重要的诊断价值和潜在的预后指标,也有助于系统治疗的监控。
然而,在对肺癌患者进行诊断时只检测一种蛋白类肿瘤标志物很难得到最佳结果,其灵敏度较低且特异性较差。
大黄糖络丸通过AMPK
◇基础研究◇摘要目的：探究大黄糖络丸（DHT ）基于腺苷酸活化蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白/unc-51样激酶1（AMPK/mTOR/ULK1）信号通路对糖尿病肾病（diabetic nephropathy ，DN ）小鼠的干预作用。
方法：40只造模成功的C57BL/KSJ-db/db （以下简称db/db ）小鼠随机分为模型组，达格列净组（1.5mg ·kg -1·d -1），DHT 高、中、低剂量组（3.6、1.8、0.9g ·kg -1·d -1），每组8只；另取10只C57BL/KSJ-db/dm （以下简称db/m ）小鼠为正常组，正常组和模型组给予生理盐水，治疗组小鼠分别给予相应药物，连续给药10周，1次/d 。
于给药0、4、8、10周固定时间，禁食不禁水12h ，取尾静脉血检测空腹血糖（FBG ）；于给药0、5、10周末收集尿液检测尿中白蛋白、肌酐含量，计算尿白蛋白肌酐比值（ACR ）；给药10周后，检测各组小鼠24h 尿总蛋白，血肌酐（Scr ），尿素氮（BUN ）含量；蛋白免疫印迹法检测肾脏组织p-AMPK 、p-mTOR 及p-ULK1蛋白的表达水平，以及自噬关键分子酵母Atg6同系物1（Beclin-1）、微管相关蛋白1轻链3（LC3）、P62蛋白的表达水平；免疫组化法检测肾脏组织足细胞裂孔膜蛋白（Nephrin 、Podocin ）的表达水平；采用光学显微镜和透射电镜观察肾脏组织病理形态学变化。
结果：与模型组比较，达格列净组和DHT 组小鼠FBG 、ACR 、24h 尿总蛋白均降低，Scr 、BUN 无统计学差异；肾组织中p-AMPK 、p-ULK1表达水平升高，p-mTOR 表达水平降低及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1表达水平升高，P62表达水平降低（P <0.01，P <0.05）；肾小球的足细胞裂孔膜蛋白Neph-rin 、Podocin 表达水平升高（P <0.01，P <0.05）；肾脏病理损害减轻；透射电镜显示自噬小体、自噬溶酶体数量增加。
蛋白质印迹法westernblot应用介绍
定量Western Blot技术
定量Western Blot技术能够准确定量蛋白质的表达水平，为比较不同样品之间的蛋白质表达差异提供 了可靠的工具。
该技术采用了同位素标记、荧光染料标记等方法，通过与标准品进行比较，计算出蛋白质的相对表达量。
该技术的应用范围广泛，包括药物靶点筛选、疾病标志物 发现、蛋白质相互作用研究等领域。
Western Blot与其他蛋白质分析技术的联用
Western Blot可以与其他蛋白质分析技术联用，如质 谱技术、免疫共沉淀等，以获得更全面的蛋白质信息。
通过将Western Blot与质谱技术联用，可以获得蛋白 质的氨基酸序列和修饰信息，有助于深入了解蛋白质
缺点
操作繁琐、耗时长、成本较高、对实验条件和操作技能要求较高。
02 Western Blot在科研中 的应用
验证抗体特异性
抗体特异性验证
通过Western Blot，可以验证抗体的 特异性，确保抗体只针对目标蛋白进 行反应，而不与其他非目标蛋白发生 交叉反应。
抗体稀释度测试
通过Western Blot，可以测试抗体的最 佳稀释度，以获得最佳的检测效果。
定量Western Blot技术的应用范围广泛，包括生物标志物发现、药物作用机制研究、疾病发病机制研究 等领域。
蛋白质组学与Western Blot的结合应用
蛋白质组学与Western Blot的结合应用能够实现大规模蛋 白质组学研究与特异性蛋白质检测的有机结合。
通过将Western Blot技术与蛋白质组学技术相结合，可以 同时获得蛋白质的特异性和丰度信息，为深入了解蛋白质 的功能和作用机制提供有力支持。
文献综述 免疫印迹法
免疫印迹法近年发展综述摘要：简述了免疫印迹法的原理和方法，并对近年来的应用作了简要概括，使读者能对免疫印迹法的近年发展有一定的认识，并对其未来的发展作展望。
关键词:免疫印迹法小分子蛋白间接疫荧光法 HIV抗体糖尿病前言：蛋白免疫印迹法自发明以来，发展迅猛，本文对其近年来的发展作了简要概述。
正文：1原理蛋白免疫印迹技术(Westernblot)由美国斯坦福大学的乔治·斯塔克发明，其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的蛋白样品进行着色，再通过分析着色的位置和深度获得目的蛋白在样品中的表达情况信息[1-3]。
蛋白免疫印迹技术集凝胶电泳、蛋白转印和免疫学标记等三部分于一体，在现代生物医学中广泛应用[4,5]。
2方法简述该项技术通过聚丙酰胺凝胶电泳分离目的蛋白质标本，并将其转移到固相载体（例如硝酸纤维素膜，聚偏二氟乙烯膜等）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变，以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与相对应的单克隆或者多克隆抗体起免疫反应，再与酶标记的二抗起反应，经过底物显色检测电泳分离的特异性目的蛋白成分与含量[6-8]。
3应用蛋白免疫印迹法自发明以来被广泛应用于现代生物学研究中的蛋白质定性和半定量分析[9]。
3.1免疫印迹法、酶联免疫法及放射免疫法对胰岛自身抗体检测的比较采用免疫印迹法测定81例糖尿病患者胰岛自身抗体,将结果与酶联免疫法测定的GAD-A、ICA,放射免疫法测定IAA结果进行比较。
结论是放射免疫法检测IAA、酶联免疫法检测ICA阳性率均高于免疫印迹法,免疫印迹法检测GAD-A阳性率则高于放射免疫法[10]。
3.2检测小分子蛋白的实验条件优化研究探讨免疫印迹法不同参数对小分子蛋白检测效果的影响，从而优化并获得最佳实验条件。
方法：比较不同转膜电压和时间、转移缓冲液甲醇含量、不同化学发光剂对小分子蛋白的检测效果。
结论是选用高电压、短时间组合，选择含20%甲醇转移缓冲液和飞克级化学发光剂信号均有助于小分子蛋白免疫印迹检测[11]。
免疫印迹技术实验报告
免疫印迹技术实验报告一、引言免疫印迹技术（Western Blotting）是一种用于检测特定蛋白质的定性和定量分析方法。
它基于免疫学原理，通过将待测蛋白质进行电泳分离，并利用抗体与目标蛋白质特异性结合的原理，最终实现对目标蛋白质的检测和定量分析。
本实验旨在通过免疫印迹技术检测目标蛋白质在不同样本中的表达水平，并观察其变化情况，以深入了解该蛋白质的功能和作用机制。
二、实验步骤1. 样本制备首先，我们需要准备样本。
样本可以是细胞或组织。
在实验中，我们选择了A 细胞和B细胞作为样本，分别进行后续实验。
2. 蛋白质提取将A细胞和B细胞分别加入适量的细胞裂解缓冲液，通过离心等操作将细胞裂解并获取蛋白质提取物。
3. SDS-PAGE电泳分离将蛋白质提取物加入SDS-PAGE凝胶中，进行电泳分离。
电泳时间和电压根据实验需要来确定。
4. 转膜将电泳分离后的蛋白质从凝胶中转移到聚丙烯酰胺膜上。
转膜可以通过湿法或半湿法等方法实现。
5. 阻断将转膜后的聚丙烯酰胺膜放入阻断液中，在室温下进行阻断。
阻断的目的是防止非特异性结合。
6. 一抗处理将目标蛋白质的一抗加入到含有阻断液的培养皿中，将转膜的聚丙烯酰胺膜放置在一抗液中，进行一抗处理。
一抗的选择根据目标蛋白质的特异性来确定。
7. 洗涤将转膜的聚丙烯酰胺膜从一抗液中取出，进行洗涤。
洗涤的目的是去除非特异性结合的抗体。
8. 二抗处理将与目标蛋白质一抗结合的二抗加入到含有阻断液的培养皿中，将转膜的聚丙烯酰胺膜放置在二抗液中，进行二抗处理。
9. 洗涤将转膜的聚丙烯酰胺膜从二抗液中取出，再次进行洗涤，确保清洗干净。
10. 显色将合适的显色剂加入到含有阻断液的培养皿中，将转膜的聚丙烯酰胺膜放置在显色剂中，进行显色反应。
显色剂的选择根据实验需要和目标蛋白质的特性来确定。
11. 照相观察显色结果，并使用相机拍摄转膜的聚丙烯酰胺膜，记录实验结果。
三、结果与讨论根据实验步骤，我们成功地使用免疫印迹技术检测了A细胞和B细胞中目标蛋白质的表达情况。
全自动蛋白印迹定量分析系统的使用及常见问题分析
全自动蛋白印迹定量分析系统的使用及常见问题分析全自动蛋白印迹定量分析系统是一种先进的生物技术仪器，主要用于定量分析蛋白质的表达水平和定位研究蛋白质在细胞或组织中的表达情况。
下面将介绍该系统的使用方法以及常见问题的分析及解决方法。
一、使用方法1、取样和制备首先，需要根据实验设计和目的，精确取样并且制备样品。
对于细胞或组织样品，需要对其进行粉碎或裂解，然后加入蛋白质抽取液，经过离心等步骤获得蛋白质样品。
2、电泳将制备好的样品加入凝胶体系，进行电泳操作，根据所需定量目的选择不同的凝胶类型和电泳条件。
3、转膜电泳后将凝胶转移到膜上，该步骤非常重要，因为转膜的质量直接影响到印迹的结果。
4、封闭膜用不含胶原蛋白的蛋白质缓冲液封闭膜和凝胶，避免非特异性结合和测量的抗体。
5、孵化将孵化过的抗体加入，与特定的蛋白结合，洗掉无特异性结合的抗体等杂质。
6、检测将检测方法加入，如辐射探测、荧光标记等法，检测并记录结果。
二、常见问题分析及解决方法1、蛋白分子量模糊分子量模糊的原因可能包括凝胶浓度选择不正确，电泳过程中电流变化不稳定等，建议重新选择凝胶浓度和重新调整电流，以使凝胶胶柱在整个电泳过程中保持均匀的电流。
2、印迹不清晰印迹不清晰的原因可能包括转膜和封闭孵化等步骤操作不当，建议加强对这些环节的操作控制，对转膜的过程进行优化，封闭孵化抗体的时间不能过长或过短等。
3、印迹信号弱或不存在信号弱或不存在的原因可能包括蛋白抽取过程中，溶液丢失或开裂等损害，建议重新制备样品，精细操作，避免不必要的损害，保证样品的完整性。
总结来看，全自动蛋白印迹定量分析系统可以满足定量分析蛋白质表达该有的要求，但其使用需要仔细操作，依据仪器的特点和实验设计，选择合适的浓度、时间、温度等。
对于一些意外情况，需要及时排查和解决，尽量避免影响样本的质量和测试结果的准确性。
药物分析中的蛋白质磷酸化分析技术研究
药物分析中的蛋白质磷酸化分析技术研究1. 引言蛋白质磷酸化是一种重要的细胞信号传导方式，参与调控细胞的生理和病理过程。
药物研究中，了解蛋白质是否被磷酸化，以及磷酸化的程度，对于理解药物靶点、药效机制以及发现新的治疗靶点具有重要意义。
本文将介绍药物分析中的蛋白质磷酸化分析技术的研究进展及应用。
2. 蛋白质磷酸化的分析方法2.1 免疫印迹法免疫印迹法是最早用于检测蛋白质磷酸化的方法之一。
该方法利用特异性的抗体与目标蛋白质结合，再通过酶标记的二抗进行信号放大，最终通过底物的发光或显色反应来检测蛋白质磷酸化水平。
免疫印迹法具有灵敏度高、操作简便等优点，且可同时检测多个靶点。
2.2 质谱法质谱法是一种高分辨率的蛋白质分析技术，也被广泛应用于蛋白质磷酸化的研究。
代表性的方法有质谱光谱法和质谱成像法。
质谱光谱法通过质谱仪器分析磷酸化产生的质谱图谱，从而鉴定和定量蛋白质磷酸化水平。
质谱成像法则可以将荧光探针和质谱技术结合，实现对蛋白质磷酸化的直观可视化。
2.3 磷酸化位点特异性酶切法磷酸化位点特异性酶切法利用特定的蛋白酶识别和切割蛋白质的磷酸化位点，从而将磷酸化和非磷酸化的蛋白质区分开来。
通过质谱法或免疫印迹法等技术进一步分析切割后蛋白质的磷酸化水平，用于研究磷酸化的生物学功能和相应靶向药物的发现。
3. 蛋白质磷酸化的应用3.1 药物靶点鉴定蛋白质磷酸化分析可用于帮助药物研究人员鉴定药物的作用靶点。
通过分析药物处理后的蛋白质磷酸化模式，可以确定药物是否与特定的蛋白质发生相互作用，并进一步研究该蛋白质在疾病发生发展中的作用机制。
3.2 药效机制研究药物的疗效与其作用靶点及所调控的信号通路密切相关。
蛋白质磷酸化分析可以帮助研究人员深入了解药物对靶点蛋白质的调控机制，揭示药物与细胞信号传导之间的相互作用关系，从而为药效机制的研究提供重要的信息。
3.3 新药物靶点发现通过对疾病相关信号通路上关键蛋白质的磷酸化分析，可以发现新的治疗靶点。
蛋白免疫印迹技术研究概述
蛋白免疫印迹技术研究概述摘要：蛋白免疫印迹技术是一种简单的、高效的蛋白免疫检测技术，特别是对蛋白含量低的样品，效果更佳。
这种技术的优点是在一个生物样品中使用特定的抗体检测多种蛋白质。
蛋白免疫印迹技术已经得到的很大的发展，现在已经出现多种转移方法。
至今，蛋白免疫印迹技术已经应用于科研和诊断检测结果检测、在免疫组化中鉴定特定的抗体等领域。
关键字：蛋白印记；转印；标记The Overview of Research of Western BlottingAbstract:Despite its overall simplicity,protein blotting or western blotting has be- en proven to be a powerful procedure for the immunodetection of proteins,especially those that are of low abundance.The usefulness of this procedure stems from its abilit- y to provide simultaneous resolution of multiple immunogenic antigens within a sam- ple for detection by specific antibodies.Protein blotting has evolved greatly since its inception and researchers have a variety of ways and means to carry out this transfe- r.This procedure is used to provide confirmation of results both in research and diagnostic testing.Specificity of antibodies used for immunohistochemistry is of critical importance.Key words:western blotting;Transfer printing; mark1引言蛋白质印迹技术[1]（western blotting）中文一般称为，是继DNA印迹（southern blotting）和RNA（northern blotting）之后发展起来的，集电泳、转印和免疫标记为一体的一项蛋白质分离检测技术。
Wesern-bloing蛋白免疫印迹实验ppt课件
④ 用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，
槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。）
27
清洗玻 璃板
配 胶
上样
电泳
停止电 泳
①测完蛋白含量后，计算含50mg蛋白的溶液体积即为上样量。适量蛋 白加入4：15*Loading Buffer于离心管，100℃水中煮5min使蛋白 变性。放置冰上3min，离心15min，13000rpm，4℃。
2.结果分析
3.注意事项
四
实验室常见问题解答
20
蛋白样品制 备 蛋白含量测
定
21
在六孔板中，按照一 个孔添加150μL的比 例添加适量RIPA裂解 液，用枪吹打均匀以 充分接触细胞。
样品放置冰上 30min（中间混 匀5-6次）直至 裂解完全。
充分裂解后，1000014000g离心3-5分钟， 取上清，即可进行后续 的PAGE、Western和免 疫沉淀等操作
②加足够的1*电泳缓冲液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃 板。）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样 器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气
泡也可能使样品溢出。）
28
清洗玻 璃板
配 胶
上样
电泳
停止电 泳
浓缩胶80V电压跑20 分钟，可多跑几分钟； 分离胶180V电压跑 至底端。
疾病早期诊断
例：诸延慧，容瓘等.酶联免疫印迹术(EITB)在小鼠日本血吸虫感染早期 诊断中的应用[J]. 中国人兽共患病杂志,1993,9(3):26-29.
5
检测样品中特异性蛋白质是否
蛋白质印迹分析(WesternBlotAnalysis)
蛋白质印迹分析(Western Blot Analysis)【实验目的】了解蛋白质印迹法的基本原理及其操作和应用。
【实验原理】蛋白质印迹法又称为免疫印迹法，这是一种可以检测固定在固相载体上蛋白质的免疫化学技术方法。
待测蛋白既可以是粗提物也可以经过一定的分离和纯化,另外这项技术的应用需要利用待测蛋白的单克隆或多克隆抗体进行识别。
如图所示，可溶性抗原，也就是待测蛋白首先要根据其性质，如分子量，分子大小，电荷以及其等电点等采用不同的电泳方法进行分离；通过电流将凝胶中的蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上；利用抗体（一抗）与抗原发生特异性结合的原理，以抗体作为探针钓取目的蛋白。
值得注意的是在加入一抗前应首先加入非特异性蛋白，如牛血清白蛋白对膜进行“封阻”而防止抗体与膜的非特异性结合。
经电泳分离后的蛋白往往需再利用电泳方法将蛋白质转移到固相载体上,我们把这个过程称为电泳印迹。
常用的两种电转移方法分别为: 1.半干法: 凝胶和固相载体被夹在用缓冲溶液浸湿的滤纸之间,通电时间为10分钟~30分钟。
2.湿法：凝胶和固相载体夹心浸放在转移缓冲溶液中，转移时间可从45分钟延长到过夜进行。
由于湿法的使用弹性更大并且没有明显浪费更多的时间和原料，因此我们在这里只描述湿法的基本操作过程。
对于目的蛋白的识别需要采用能够识别一抗的第二抗体。
该抗体往往是购买的成品，已经被结合或标记了特定的试剂，如辣根过氧化物酶。
这种标记是利用辣根过氧化物酶所催化的一个比色反应，该反应的产物有特定的颜色且固定在固相载体上，容易鉴别。
因此可通过对二抗的识别而识别一抗，进而判断出目标蛋白所在的位置。
其他的识别系统包括碱性磷酸酶系统和125I标记系统。
【实验操作】⒈.蛋白质的分离根据目的蛋白的性质，利用电泳方法将其进行分离。
为提高电转移的效率，通常采用SDS/PAGE技术。
分离实验结束后，首先将样品墙的上边缘用小刀去除，然后在胶板的右上角切一个小口以便定位，小心放入转移缓冲溶液中待用。
全自动蛋白印迹定量分析系统的使用及常见问题分析
全自动蛋白印迹定量分析系统的使用及常见问题分析全自动蛋白印迹定量分析系统是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断领域的先进技术。
它能够快速、准确地分析样品中的蛋白质含量，并且能够自动化地进行实验操作，大大提高了实验效率和准确度。
本文将介绍全自动蛋白印迹定量分析系统的使用方法以及常见问题的分析。
一、全自动蛋白印迹定量分析系统的使用方法1. 样品处理在使用全自动蛋白印迹定量分析系统进行实验之前，首先需要对样品进行处理。
通常情况下，样品需要经过蛋白抽提、浓缩和纯化等步骤，以确保样品中的蛋白质能够被准确地检测和分析。
2. 试剂配置在进行实验之前，需要准备好所需的试剂，并按照实验步骤进行适当的配置。
通常情况下，全自动蛋白印迹定量分析系统需要使用蛋白质标记试剂、洗涤缓冲液、显色底物等试剂，这些试剂的配置需要按照系统操作手册进行准确的配比和操作。
3. 样品加载将处理好的样品加载到全自动蛋白印迹定量分析系统的样品槽中，根据系统操作手册的指导进行操作。
通常情况下，系统会根据样品的特性，自动选择合适的分析方法和参数。
4. 实验操作启动全自动蛋白印迹定量分析系统，根据系统提示进行实验操作。
系统会自动进行样品的处理、标记、洗涤、显色等步骤，用户只需根据系统提示进行简单的操作即可。
5. 数据分析实验完成后，全自动蛋白印迹定量分析系统会自动生成实验数据，并进行数据分析。
用户可以通过系统提供的分析软件进行数据的处理和分析，得到样品中蛋白质含量的准确定量结果。
二、常见问题分析在使用全自动蛋白印迹定量分析系统的过程中，可能会遇到一些常见问题，下面对这些常见问题进行分析和解决方案的介绍。
1. 实验结果不准确实验结果不准确可能是由于样品处理或者试剂配置过程中出现了问题，或者是由于系统操作过程中出现了故障。
解决这一问题的方法是，首先检查样品处理和试剂配置的步骤，确保每一步都按照操作手册的要求进行操作。
检查系统操作过程中是否有异常情况发生，如系统报错或者系统参数设置错误等，及时进行调整和纠正。
蛋白免疫印迹
蛋白免疫印迹(Western Blot)技术指南一、蛋白免疫印迹(Western Blot)技术概览蛋白免疫印迹(Western Blot，以下简称WB)是利用特定抗体能够专一结合其抗原“蛋白质”的原理来对样品进行着色，通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达或修饰水平的免疫检测技术。
一般我们使用WB都是为了半定量检测某种目的蛋白的相对表达量，通常要以表达相对稳定的蛋白作为内部对照（内参），然后采用“灰度分析软件”检测目的蛋白及内参条带的表达强度，每组目的蛋白分别以内参作为对照进行比对和相对定量，以使实验结果更加准确。
同时，同一批样品至少进行技术重复三次，然后方可进行统计学分析。
WB灵敏度可达ng级，用ECL显色法理论上可达pg级。
二、蛋白免疫印迹(WB)实验所需仪器、材料及试剂（一）主要实验仪器制冰机、超声破碎仪、低温冷冻离心机、蛋白电泳/转膜仪、多功能酶标仪、LI-COR Odyssey成像系统（二）主要实验试剂与材料15ml离心管、玻璃组织研磨器、EP管、冰浴、蛋白抽提试剂(改进型RIPA配方，Bioss 产品货号C05-01001)、蛋白酶抑制剂混合物(protease inhibitor cocktail)、BCA蛋白定量试剂盒(Bioss产品货号C05-02001)、30%丙烯酰胺-N,N-亚甲基双丙烯酰胺混合液(29:1)(Bioss产品货号C05-03004)、10%过硫酸铵(APS)(Bioss产品货号C05-03009)、四甲基乙二胺(TEMED)(Bioss产品货号C05-03008)、4×蛋白上样缓冲液(Bioss产品货号C05-03015)、蛋白Marker(Bioss产品货号C05-090006)、电泳缓冲液(Bioss产品货号C05-03010)、转膜缓冲液(Bioss产品货号C05-05003)、考马斯亮蓝染色液(Bioss产品货号C05-04001)、TBST缓冲液(pH7.4)(Bioss产品货号C5049)、PVDF膜(Bioss产品货号C55008)或NC膜(0.22µm)(Bioss产品货号C05-05002)、丽春红染色液(Bioss产品货号C05-04002)、脱脂奶粉(Bioss产品货号C5059)、牛血清白蛋白(BSA)、目的蛋白一抗、WB一抗稀释液(Bioss产品货号C05-07001)、HRP标记二抗(bs-0295G-HRP或bs-0296G-HRP)或荧光标记二抗(Bioss内部操作流程选用荧光二抗，Bioss产品货号bs-40295G-IRDye8或bs-40296G-IRDye8)、WB二抗稀释液(Bioss产品货号C05-07002)、ECL发光液(Bioss产品货号C05-07004)、膜再生液(Bioss产品货号C05-03041)Western Blot操作流程图三、蛋白免疫印迹(WB)实验标准操作流程和技术要点（一）蛋白提取●组织样品蛋白提取方法1.用灭菌（预冷）的工具分离新鲜目的组织50mg-100mg，并用生理盐水或PBS洗涤干净，用洁净的剪刀将组织剪碎至合适大小。
分子印迹技术在分子药理学中的应用
分子印迹技术在分子药理学中的应用随着科学技术的不断进步，人们对于药物研发和治疗方案的要求也越来越高。
传统的药理学尤其是药物筛选方法已经无法满足现代医药科学的需求。
分子印迹技术（Molecular Imprinting Technology）因其高效、精确、快速的特点，被越来越多的学者和企业用于分子药理学研究中。
本文将从分子印迹技术的原理入手，继而从其在药物筛选、制备及应用等方面阐述其在分子药理学领域中的应用。
一、分子印迹技术概述分子印迹技术是一种通过特定模板分子诱导交联聚合反应，将模板分子的信息嵌入交联聚合物中，形成与之相适应的“分子印迹物”（Molecularly Imprinted Polymer，MIP）的技术。
该技术可以利用模板分子与其结合的特异性，对其他分子进行选择性识别和分离。
分子印迹技术在分离、分析和检测方面具有广泛应用，如生物医学、环境检测、食品安全等领域。
二、药物筛选药物分子的大小、形状、电荷等特性对于其与生物分子的互作用有着很大的影响。
分子印迹技术可以根据药物分子的特点，选择合适的模板分子，在交联聚合物中形成与之结合的选择性受体。
利用这种技术可以筛选出对目标药物分子具有高亲和力的分子印迹材料，该材料可以用于药物的纯化和分离。
例如，在一些抗癌药物筛选中，分子印迹技术能够通过对药物分子的特征进行分析，设计出与之结合的分子印迹材料。
Yang等人以顺铂为模板，利用分子印迹技术成功地制备出了一种新型材料，该材料对于顺铂的亲和力明显高于其他药物分子。
这种分子印迹材料不仅具有良好的选择性和特异性，而且能够极大地提高分离纯化效率，为顺铂药物的生产提供了理论和技术支持。
三、药物制备分子印迹技术不仅可以用于药物的筛选和分离，还可以为药物的制备提供新的思路和方法。
该技术可以制备出与药物分子对应高度特异的分子印迹材料，通过将药物分子嵌入材料，迅速识别并捕获相应的药物分子。
例如，在一些抗感染药物的制备中，分子印迹技术可通过制备药物的分子印记材料，捕获对应的抗菌活性分子。
全自动蛋白印迹定量分析系统的使用及常见问题分析
全自动蛋白印迹定量分析系统的使用及常见问题分析【摘要】全自动蛋白印迹定量分析系统是一种高效、精准的蛋白质分析工具，广泛应用于生物医药领域。
本文首先介绍了该系统的基本原理和特点，然后详细阐述了系统的使用方法，常见问题及解决方法，系统维护和保养，数据分析和结果解读，以及系统的优缺点分析。
在文章展望了全自动蛋白印迹定量分析系统的未来发展，并进行了总结。
通过本文的介绍和分析，读者可以更全面地了解全自动蛋白印迹定量分析系统的使用及常见问题，为其在实践中的应用提供指导和帮助。
【关键词】全自动蛋白印迹定量分析系统，使用方法，常见问题，解决方法，系统维护，数据分析，结果解读，系统优缺点，未来发展，总结1. 引言1.1 全自动蛋白印迹定量分析系统简介全自动蛋白印迹定量分析系统是一种利用蛋白印迹技术实现对样品中目标蛋白的定量分析的仪器设备。
这种系统主要用于生物医学、生命科学等领域的研究和实验中，能够快速、准确地定量分析样品中的蛋白质含量。
全自动蛋白印迹定量分析系统具有自动化程度高、操作简便、数据准确性高等优点，广泛应用于蛋白质研究、生物医药、疾病诊断等领域。
该系统通过结合蛋白印迹技术和定量分析技术，能够实现对样品中蛋白质的特异性检测和定量分析。
其工作原理是利用蛋白质与特定膜上的蛋白结合，形成特异的蛋白-抗体复合物，再通过荧光信号或化学发光信号进行检测和分析，从而实现对样品中蛋白质的定量测定。
全自动蛋白印迹定量分析系统在科研实验室、临床诊断中具有重要的应用价值，为科研人员和临床医生提供了一个快速、准确地分析蛋白质的工具，有助于推动生命科学领域的研究和发展。
2. 正文2.1 全自动蛋白印迹定量分析系统的使用方法1. 样品准备：首先将待测样品进行处理，如离心、稀释等操作，确保样品的质量符合要求。
2. 试剂准备：根据实验所需，准备好各种试剂和溶液，包括洗涤缓冲液、稀释液、显影底物等。
3. 样品处理：将处理好的样品加入微孔板中，同时加入探针蛋白，充分混合并孵育一定时间。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
基金项目：国家自然科学基金委优秀青年科学基金资助项目（81322050）；教育部新世纪优秀人才项目（NCET-12-0072）；北京市科技新星项目（2010B072）作者简介：姜晨晨，女，硕士研究生研究方向：抗病毒药物药理学*通讯作者：彭宗根，男，研究员，博士生导师研究方向：抗病毒药物分子药理学Tel ：（010）63166129E-mail ：pumcpzg@蛋白免疫印迹半定量分析在药理学研究中的影响因素姜晨晨1，程军军2，黄梦昊1，吴舟一1，李健蕊1，李文静1，彭宗根1*（1.中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所，北京100050；2．中国医学科学院北京协和医学院药物研究所，北京100050）摘要：目的探讨蛋白免疫印迹半定量分析的影响因素，为在蛋白水平上研究药物的药理作用提供指导。
方法提取丙型肝炎病毒（HCV ）感染的Huh7.5细胞内总蛋白，蛋白定量后，以丙型肝炎病毒编码的核心蛋白为目的蛋白，以管家基因编码的蛋白Tubulin 或Gapdh 为内参对照，分析蛋白上样量、抗体浓度及孵育时间、发光液浓度等可变因素对蛋白免疫印迹半定量分析结果的影响。
结果蛋白免疫印迹半定量结果中目的蛋白相对强度与蛋白总上样量之间只在一定上样量范围内有线性关系，超出线性范围会导致相对蛋白强度变化幅度减少，甚至无变化；上样体积、内参的选择不影响实验结果；在条带质量较好的前提下，一抗浓度及其孵育时间和发光液浓度也不改变实验结果；但是半定量有一定的缺陷，实验结果有一定的误差，应在15%以内。
结论影响蛋白免疫印迹半定量结果的主要因素为目的蛋白的上样量；在能获得条带质量较好的前提下，改变上样体积和抗体孵育时间、适当稀释抗体和发光液浓度有利于实验进展而不影响实验结果。
关键词：蛋白免疫印迹；半定量；影响因素；蛋白浓度doi ：10.11669/cpj.2015.09.006中图分类号：Ｒ965文献标志码：A文章编号：1001－2494（2015）09－0758－05Impact Factors on Ｒesults of Semi-Quantitative Western Blot in Pharmacological ＲesearchJIANG Chen-chen 1，CHENG Jun-jun 2，HUANG Meng-hao 1，WU Zhou-yi 1，LI Jian-rui 1，LI Wen-jing 1，PENG Zong-gen 1*（1．Institute of Medicinal Biotechnology ，Chinese Academy of Medical Sciences ＆Peking Union Medical College ，Beijing100050，China ；2．Institute of Materia Medica ，Chinese Academy of Medical Sciences ＆Peking Union Medical College ，Beijing 100050，China ）ABSTＲACT ：OBJECTIVETo investigate the impact factors of the semi-quantitative Western blot （WB ），offering a guidance on re-search of pharmacological effects of drugs at the level of proteins.METHODSTotal proteins were extracted from the Huh7.5cellsinfected with hepatitis C virus and quantified with BCA kit ，HCV Core protein was chose as target protein ，and protein Tubulin or Gap-dh ，which was encoded by housekeeping gene ，as the internal control.By controlling the experimental factors ，such as loading sample amount ，concentration and the incubation time of first antibodies ，and dilutions of chemiluminescent fluid as well ，we analyzed those factors how to impact the semi-quantitative results.ＲESULTSThe semi-quantitative results showed that there is a linear relationshipbetween relative intensity of target protein and the amount of total protein at must protein concentration range ，beyond which ，the range-ability of relative intensity of target protein reduced ，even no changes.However ，sample volume loaded ，or protein selected as internal reference has little influence on the result of semi-quantitative WB.In the context of obtaining high-quality band ，concentration and in-cubation time of antibodies or dilution of chemiluminescent fluid also has no influence on it.Yet ，the semi-quantitative WB has certain defects and our results show that the permissible error of semi-quantitative result should be controlled within 15%.CONCLUSION The key impact factor on the result of semi-quantitative WB is the target protein amount of loading.On the premise of obtaining clear and high-quality bands ，appropriately selecting loading volume of samples ，concentration and incubation time of first antibodies ，and dilutions of chemiluminescent fluid is conducive to accomplish experiments without affecting the final results of semi-quantitative WB.KEY WOＲDS ：Western blot ；semi-quantitative ；impact factor ；protein concentration蛋白免疫印迹（Western blot ）是当前蛋白分析的一种常规技术，它结合了电泳的高分辨率和酶免疫测定的高敏感性和特异性，用于检测样品中特异蛋白存在与否、细胞中特异蛋白的半定量分析和蛋白质分子相互作用的研究［1］。
在药理学研究中，使用蛋白免疫印迹分析通常都是为了半定量检测某种目的蛋白的相对表达量，常采用灰度分析软件检测目的蛋白及内参条带的表达强度，以分析药物等处理因素对目的蛋白的影响［2］。
但由于该检测方法步骤较繁琐，实验变量较多，结果不稳定等特性，使得应用该法测定组织中的目的蛋白浓度时常常会遇到困难，需花费大量的人力物力财力和时间去摸索实验条件［3］。
虽然各种教科书和网络上都有讨论如何做好蛋白免疫印迹分析，并提出各种注意事项，但作为药理学工作者，仅有这些常识仍不能很好完成药理学评价，甚至做出相反的实验结果。
本实验从实验实践分析出发，讨论蛋白免疫印迹半定量分析在药理学研究中的影响因素及处理方法，为广大药理学工作者提供参考。
1实验材料1.1细胞丙型肝炎病毒（HCV）感染的人肝传代细胞系Huh7.5细胞［4］，用0.05%-EDTA胰酶消化传代，用含10%灭活胎牛血清及每毫升100单位青霉素和100单位链霉素的DMEM培养基正常传代和富集培养。
1.2主要生化试剂DMEM、胎牛血清（美国GiBco公司）；细胞总蛋白提取试剂Cytobuster TM Protein ExtractionＲeagent （美国Novagen公司）；蛋白酶抑制剂Complete prote-ase inhibitor cocktail tables（德国Ｒoche Applied Sci-ence公司）；Penicillin-Streptomycin双抗、PBS、0.05%-EDTA胰酶均（中科迈晨科技有限公司）；5ˑLoading Buffer（Lane Marker Sample Buffers）、PageＲuler TM Prestained Protein ladder、Pierce TM BCA Protein Assay Kit（Thermo Scientific公司；30%丙烯酰胺溶液、1.5mol·L－1Tris-Cl（pH8.8）、1mol·L－1Tris-Cl（pH6.8）、10%SDS溶液、TEMED、过硫酸铵、三羟基氨基甲烷Tris碱、甘氨酸、十二烷基硫酸钠SDS（北京普利莱基因技术有限公司）；聚山梨酯20（西陇化工股份有限公司）。
无水乙醇、浓盐酸、NaCl、甲醇、异丙醇等均为分析纯；PVDF膜和化学发光液Immobilon TM Western Chemiluminescent HＲP Substrate（美国Millipore公司）。
1.3抗体抗HCV Core蛋白小鼠单抗（C7-50，ab2740）（英国Abcam公司）；小鼠抗Gapdh和小鼠抗Tubu-lin单抗（中杉金桥生物技术公司）；抗小鼠IgG HＲP-linked（Cell Signaling公司）。