细胞生物学实验手册
细胞生物学实验报告[1]
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细胞生物学实验报告细胞生物学实验报告细胞生物学实验报告细胞生物学实验报告动物细胞融合【实验目的】⒈了解动物细胞融合的常用方法。
⒉学习化学融合的基本操作过程。
⒊观察动物细胞融合过程中细胞的行为和变化。
【实验原理】细胞融合是指在自发或者诱导条件下，两个或两个以上细胞合并为双核或者多核细胞的过程。
目前人们已经发现有很多方法可以诱导细胞融合，包括病毒诱导融合、化学诱导融合和电激诱导融合。
⒈病毒诱导融合仙台病毒、牛痘病毒、新城鸡瘟病毒和疱疹病毒等可以介导细胞的融合。
这类病毒的被膜中含有融合蛋白，可介导病毒和宿主细胞融合，同时也可介导细胞与细胞的融合。
用紫外线灭活后，这些病毒即可诱导细胞发生融合。
⒉化学诱导融合很多化学试剂能够诱导细胞融合，如聚乙二醇(PEG)、二甲基亚砜、山梨醇、甘油、溶血性卵磷脂、磷脂酰丝氨酸等。
这些物质能够改变细胞膜脂质分子的排列，在去除这些物质之后，细胞膜趋向于恢复原有的有序结构。
在恢复过程中相接触的细胞由于接口处脂质双分子层的相互亲和与表面张力，细胞膜融合，胞质流通，发生融合。
化学诱导方法，操作方便，诱导融合的概率比较高，效果稳定，适用于动、植物细胞，但对细胞具有一定的毒性。
PEG是被广泛使用的化学融合剂。
⒊电激诱导融合包括电诱导、激光诱导等。
其中，电诱导是先使细胞在电场中极化成为偶极子，沿电力线排布成串，再利用高强度、短时程的电脉冲击破细胞膜，细胞膜的脂质分子发生重排，由于表面张力的作用，两细胞发生融合。
电诱导方法具有融合过程易控制、融合概率高、无毒性、作用机制明确、可重复性高等优点。
【实验用品】⒈材料鸡血红细胞。
⒉试剂50%PEG、Hank’s溶液(pH7.4)、Alsever’s细胞保存液、0.85%氯化钠溶液。
⒊器材正置显微镜、离心机、离心管、载玻片、盖玻片、滴管、注射器等。
【实验步骤】⒈鸡血红细胞的制备和保存用无菌注射器先吸入Alsevers溶液1ml，再从鸡翼下静脉取血0.5~1ml，取出后放入刻度离心管中，再加入2~3mlAlsevers溶液，使总量为4~5ml，混匀并封口，置于4℃冰箱内。
医学细胞生物学实验
细胞凋亡诱导与检测
细胞凋亡检测
细胞凋亡诱导
自噬诱导
通过饥饿、药物刺激等手段诱导细胞自噬，以研究自噬的生物学意义和作用机制。
自噬检测
采用荧光染色、电镜观察、蛋白质印迹等方法检测自噬体的形成、数量和相关蛋白的表达。
自噬诱导与检测
03
02
01
实验原理
实验设计
根据实验目的和原理，设计具体的实验方案和操作流程。
实验操作
按照实验方案进行实验操作，包括细胞培养、显微观察、分子生物学检测等步骤。
数据收集与分析
收集实验数据，进行统计分析，得出实验结果。
结果汇报与讨论
将实验结果以书面形式汇报，并进行讨论和总结。
实验步骤
02
细胞培养
CHAPTER
利用免疫荧光染色、荧光共振能量转移等技术，可以检测和定位细胞内特定信号分子的分布和动态变化，进而揭示其在信号转导中的作用机制。
详细描述
总结词
信号转导抑制剂的应用
总结词：信号转导抑制剂是一类能够干扰细胞信号转导过程的化合物，具有潜在的治疗作用。
07
细胞凋亡与自噬研究
CHAPTER
通过使用化学物质、射线、病毒等手段诱导细胞凋亡，以研究其发生机制和生物学意义。
电子显微镜
利用电子束代替可见光，观察细胞超微结构。
显微镜观察
通过显微镜或细胞计数板，统计细胞数量。
细胞计数
利用染色剂或荧光染料，检测细胞活性，如MTT法、染色排除法等。
细胞活力检测
细胞计数与活力检测
利用染色剂对细胞进行染色，以便观察细胞形态和结构。
染色技术
细胞生物学实验手册：细胞核与线粒体的分级分离
实验八细胞核与线粒体的分级分离【实验目的】通过细胞匀浆和离心的方法分级分离细胞的组分，以了解其原理及过程。
【实验用品】一、材料和标本小白鼠、冰块。
二、器材和仪器玻璃匀浆器、普通离心机、台式高速离心机、普通天平、光学显微镜、载玻片、盖玻片、刻度离心管、高速离心管、滴管、10ml量筒、25ml 烧杯、玻璃漏斗、解剖剪、镊子、吸水纸、纱布、螬盘、平皿、牙签。
三、试剂 0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙溶液、1％甲苯胺兰染液、0.02％詹纳斯绿B染液、0.9％NaCl溶液。
【实验内容】一、原理细胞内不同结构的比重和大小都不相同，在同一离心场内的沉降速度也不相同，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。
分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆，在均匀的悬浮介质中用差速离心法进行分离，其过程包括组织细胞匀浆、分级分离和分析三步，这种方法已成为研究亚细胞成分的化学组成、理化特性及其功能的主要手段。
匀浆(Homogenization)低温条件下，将组织放在匀浆器中，加入等渗匀浆介质(即0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙)进行破碎细胞使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆。
分级分离(Fractionation)由低速到高速离心逐渐沉降。
先用低速使较大的颗粒沉淀，再用较高的转速，将浮在上清液中的颗粒沉淀下来，从而使各种细胞结构，如细胞核、线粒体等得以分离。
由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心开始时均匀分布在整个离心管中，所以每级离心得到的第一次沈淀必然不是纯的最重的颗粒，须经反复悬浮和离心加以纯化。
分析分级分离得到的组分，可用细胞化学和生化方法进行形态和功能鉴定。
二、细胞核的分离提取(一)操作步骤。
细胞生物学实验手册：细胞器的光镜切片和电镜照片观察
实验五细胞器的光镜切片和电镜照片观察【实验目的】观察除了实验二～五以外的其它细胞器在光学显微镜和电子显微镜下的基本形态结构。
【实验内容】一、三种细胞器的光镜切片（一）高尔基复合体(Golgi Complex)用镀银法染色的豚鼠脊神经节光镜切片:神经细胞因合成运输大量的蛋白质而含有发达的内质网和高尔基复合体，在低倍镜下观察，神经节的假单极细胞体被神经束分隔成群。
神经细胞的胞体呈圆形或椭圆形。
转换高倍镜观察，细胞中央不着色的圆形区为细胞核。
在核的周围有黑褐色颗粒状或呈不规则的条索状结构即为高尔基复合体。
图5一l神经节细胞(示高尔基复合体)(二)尼氏小体(Nissl’s Body)甲苯胺兰染色的牛脊髓涂片，尼氏小体即光镜下的粗面内质网。
在低倍镜卡观察，染成蓝色的大三角形、星形细胞就是脊髓前角神经细胞，染色较深的小细胞为神经胶质细胞。
转换高倍镜观察，可见脊髓前角神经细胞的细胞质中许多蓝色颗粒或网状结构即为尼氏小体。
图5—2 脊髓前角神经细胞的尼氏小体(三)中心体(Centrosome)铁苏木素染色的马蛔虫子宫切片，在低倍镜下观察可见许多受精卵细胞，细胞的外面有卵壳，细胞与卵壳之间的腔叫卵壳腔。
在某些卵细胞内，于核附近有圆形的小粒——中心粒，它与周围致密的细胞质——中心球，组成中心体。
转换高倍镜观察，可见中心体的外围还有星状的放射细丝即星体。
染色体中心体图5—3马蛔虫受精卵细胞、分裂中期(示中心体)二、六种细胞器的电镜照片（一）高尔基复合体(Golgi Complex)人体胃粘膜细胞高尔基复合体电镜照片：细胞质中有散在的高尔基复合体，其结构要由三部分组成：扁平囊、大囊泡和小囊泡，它们共同构成紧密重叠的囊泡结构。
扁平囊约3～8层，它们平行排列，略弯曲成弓形。
凸出的一侧为形成面，可见许多小囊泡，凹入的一侧为成熟面，可见扁平囊末端呈球形膨大，在分泌细胞中膨大部分不断脱离扁平囊，形成分泌泡。
(二)内质网(Endoplasmic Reticulum)人胃壁细胞、恒河猴脊髓前角运动神经细胞粗面内质网电镜照片：粗面内质网在分泌蛋白质的细胞中较发达，在细胞核周围可见有较密集的膜层结构即为粗面内质网，它们大都呈片状排列，粗面内质网可与细胞核膜相通连。
细胞生物学实验报告
细胞生物学实验报告实验名称：细胞培养实验实验目的：1. 了解细胞培养的基本原理和过程2. 观察细胞生长和分化的现象3. 掌握细胞培养的实验技术和方法实验原理：细胞培养是一种将生物体细胞从其原始生存环境中分离出来，在体外条件下进行培养的技术。
这种技术对于研究细胞生物学、发育生物学、药物筛选等学科具有重要意义。
本实验将通过观察细胞生长和分化的现象，加深对细胞培养技术的理解。
实验材料：1. 人体皮肤细胞2. 培养基（包含血清、抗生素、氨基酸、维生素等）3. 塑料瓶（培养皿）4. 显微镜5. 记录表实验步骤：1. 取适量人体皮肤细胞，用胰蛋白酶消化，使其从组织中分离出来。
2. 将细胞接种到塑料瓶（培养皿）中，加入适当浓度的培养基。
3. 将塑料瓶（培养皿）放入恒温培养箱中，定期观察并记录细胞生长和分化的现象。
4. 在合适的时间点，使用显微镜拍照记录细胞生长和分化的过程。
5. 实验结束后，整理数据和图片，撰写实验报告。
实验结果：经过一段时间的培养，我们观察到皮肤细胞在培养基中开始贴壁，并逐渐生长。
随着时间的推移，部分细胞开始出现分裂，形成相互连接的细胞团。
一些细胞逐渐伸展成梭形或扁平形，呈现出典型的贴壁生长形态。
在某些区域，我们观察到细胞开始分化为两种不同形态的细胞群，一种呈圆形或椭圆形，另一种呈多角形。
这些现象表明细胞已经开始分化。
实验分析：根据实验结果，我们可以得出以下结论：1. 细胞确实可以在体外条件下贴壁生长并增殖。
这证明了细胞培养技术的可行性。
2. 细胞分化是一个自然的过程，在本实验中得到了证实。
这说明细胞具有自我更新和多向分化的潜能。
3. 实验过程中需要注意无菌操作和适宜的培养条件，以确保细胞的存活和正常生长。
此外，不同种类的细胞可能需要不同的培养条件，因此在实际操作中需要针对具体细胞类型进行实验。
实验结论：通过本次实验，我们了解了细胞培养的基本原理和过程，观察了细胞生长和分化的现象，并掌握了细胞培养的实验技术和方法。
医学细胞生物实验报告
实验名称：医学细胞生物学实验一、实验目的1. 了解细胞的基本结构和功能。
2. 掌握显微镜的使用方法。
3. 观察并分析细胞在不同生理状态下的形态变化。
二、实验原理细胞是生物体的基本结构和功能单位。
通过显微镜观察细胞，可以了解细胞的形态、结构和功能，从而为医学研究和临床诊断提供依据。
三、实验材料1. 实验仪器：显微镜、载玻片、盖玻片、滴管、吸水纸、纱布、显微镜专用清洁液。
2. 实验材料：洋葱鳞片叶、人体口腔上皮细胞、动物红细胞。
四、实验步骤1. 制作洋葱鳞片叶临时装片a. 用纱布将载玻片、盖玻片擦干净。
b. 用滴管在载玻片上滴一滴清水。
c. 用镊子在洋葱鳞片叶上撕下一小片表皮。
d. 将撕下的表皮放入载玻片上的水滴中，用针将其展开。
e. 用镊子夹住盖玻片，先将一边接触载玻片的水滴边，再慢慢把盖玻片放平，制成临时切片。
f. 在盖玻片的翼侧滴加稀碘液，用吸水纸从盖玻片的另一侧吸引，使染液浸润标本的全部。
2. 制作人体口腔上皮细胞临时装片a. 用生理盐水漱口，用纱布将载玻片、盖玻片擦干净。
b. 用滴管在载玻片上滴一滴生理盐水。
c. 用牙签轻轻刮取口腔上皮细胞，将细胞涂抹在载玻片上的生理盐水滴中。
d. 用盖玻片将细胞涂抹区域覆盖，制成临时切片。
e. 在盖玻片的翼侧滴加稀碘液，用吸水纸从盖玻片的另一侧吸引，使染液浸润标本的全部。
3. 制作动物红细胞临时装片a. 将动物血液滴在载玻片上，用吸水纸将血液吸干。
b. 用盖玻片将血液涂抹区域覆盖，制成临时切片。
c. 在盖玻片的翼侧滴加稀碘液，用吸水纸从盖玻片的另一侧吸引，使染液浸润标本的全部。
4. 观察并分析细胞形态a. 将临时装片放在显微镜下，调整显微镜与临时切片位置，直到可以观察到清晰的图像为止。
b. 观察洋葱鳞片叶细胞、人体口腔上皮细胞和动物红细胞的形态、结构和功能，并进行比较和分析。
五、实验结果与分析1. 洋葱鳞片叶细胞a. 细胞壁：呈不规则形状，厚薄不一，具有细胞间隙。
细胞生物学实验手册：细胞融合实验原理及步骤
实验十一细胞融合【实验目的】掌握细胞融合原理、应用PEG融合细胞的方法以及细胞融合率的计算。
【实验用品】一、材料鸡红细胞二、器材和仪器：显微镜、离心机、水浴箱、刻度离心管、试管、载玻璃片、盖玻片三、试剂 50％PEG(MW4,000)、Hanks液(pH7.4)【实验内容】一、原理细胞融合(Cell fusion)，即在自然条件下或用人工方法(生物的、物理的、化学的)使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的过程。
人工诱导的细胞融合，在六十年代作为一门新兴技术而发展起来。
由于它不仅能产生同种细胞融合，也能产生种间细胞的融合，因此细胞融合技术目前被广泛应用于细胞生物学和医学研究的各个领域。
细胞融合的诱导物种类很多．常用的主要有灭活的仙台病毒(Sendai virus)，聚乙二醇(Polyethyleneglycol，PEG)和电脉冲。
目前应用最广泛的是聚乙二醇，因为它易得、简便，且融合效果稳定。
PEG的促融机制尚不完全清楚，它可能引起细胞膜中磷脂的酰键及极性基团发生结构重排。
二、方法(1)取新鲜鸡血以0.85％生理盐水制成10％的悬液。
(2)称取0.5克PEG(MW=4,000)放入试管内，在酒精灯上融化之，迅速加入0.5ml预热的Hanks液混匀制成50％的PEG溶液。
放入37℃水浴中待用。
(3)取上述10％的鸡红细胞悬液1ml放入离心管中，再加入5ml Hanks液混匀，然后以1,000rpm离心5分钟，小心弃去上清，用指弹法将细胞团块弹散。
(4)取上述50％PEG溶液0.5ml，在1分钟内滴加到鸡红细胞悬液，边加边轻轻摇动混匀。
待PEG全部加入后静置1分钟左右。
此全部过程都要求在37℃水浴内进行。
细胞生物学实验教学指导书
细胞生物学实验教学指导书有丝分裂实验一、实验目的学习植物根尖压片方法的基本技术。
熟悉细胞有丝分裂各个时期的形态特征及染色体的变化，并学会染色体简易永久片的制片技术。
二、实验原理有丝分裂是体细胞分裂的主要方式，一般发生在植物根尖或茎尖的分生组织中。
在有丝分裂时，细胞核与细胞质有很大的变化，但以细胞核内染色体的变化最为明显，而且是有规律地进行。
各种生物染色体在数目上和形态上是相对恒定的，并随科属种的不同而具有一定的特征。
洋葱体细胞中有8对共16条染色体，在有丝分裂过程中，每个染色体能复制一份，然后分配到两个子细胞中，所以两个子细胞与母细胞所含的染色体在数目、形态和性质上都是相同的。
在细胞遗传学研究中，人们常常需要了解某一物种的染色体数目，而最有效的方法就是观察细胞有丝分裂的中期，这样能得到较为准确的结果。
三、实验材料洋葱(Aillum cepa)根尖蚕豆(Vicia faba)根尖四、实验器具和药品试剂显微镜、培养箱、恒温水浴锅、温度计、镊子、解剖针、刀片、载玻片、盖玻片、烧杯、量筒、滴瓶、切片架、切片盒、凹面玻片、青霉素瓶、大培养皿、纱布、吸水纸、铅笔、吸管。
卡诺氏固定液(甲醇或95%乙醇3份，冰醋酸1份)、改良苯酚品红染色液(见附录:实验试剂的配制)、0.002M8-羟基喹啉水溶液、0.05—0.2%秋水仙素溶液、对二氯苯饱和水溶液、1N HCl、95%乙醇、正丁醇、加拿大树胶。
五、实验方法和步骤(一)材料准备选取蚕豆(或小麦、玉米等)种子放在烧杯中，放清水浸泡过夜，使种子吸水胀大后倒出，再用清水洗几次，用多层纱布包好种子，放进20,25?培养箱内培养。
当根尖长1,3cm 时，即可以进行预处理。
(二)预处理为了有利于对有丝分裂中染色体的观察和计数，在固定之前应用理化因素进行预处理，这样可以改变细胞质的粘度，抑制或破坏纺锤丝的形成，促使染色体缩短和分散等。
一般是在分裂高峰前处理1.5小时以上。
处理的方法如下: 1(秋水仙素水溶液常用浓度为0.05,0.2%，室温下处理2,4小时。
细胞生物学实验手册：细胞组分的化学反应
实验七细胞组分的化学反应【实验目的】了解核酸、蛋白质、糖及酶的细胞化学反应原理，掌握Brachet反应及碱性蛋白、酸性蛋白、糖原和过氧化物酶的细胞化学染色方法。
【实验用品】一、材料和标本蟾蜍、小白鼠各一只、肝脏石腊切片、培养的Hela细胞。
二、器材和仪器光学显微镜、解剖器材、蜡盘、载玻片、吸水纸、染色缸、盖玻片、水浴箱。
三、试剂PBS缓冲液(pH7.2)、甲基绿一呱咯宁醋酸缓冲液、纯丙酮、l/2丙酮+1/2二甲苯、纯二甲苯、70％乙醇、5％三氯醋酸、0.1％碱性固绿、0.1％酸性固绿、0.5％硫酸铜、联苯胺混合液、1％番红、无水乙醇、过碘酸酒精液、Schiff 氏酒精液、亚硫酸水、Ehrlieh苏木精、95％乙醇、Carnoy固定液(甲醇：冰醋酸=3:1，体积比)【实验内容】细胞的组织化学方法，是研究细胞成分常用的方法之一。
它是利用化学试剂与细胞内的某些物质进行化学反应，从而在细胞局部形成有色沉淀物，再通过显微镜对组织内的生物化学成分进行定性、定位、定量研究。
一、Brachet反应一显示细胞内的DNA和RNA(一)原理细胞经甲基绿一呱咯宁混合液处理后，其中的DNA和RNA出现不同的呈色反应，一般认为这是由于带有负电荷的核酸对碱性染料呱咯宁和甲基绿具有亲和力，且这两种染料的作用有选择性，甲基绿染高聚分子的DNA呈蓝绿色，呱咯宁染低聚分子的RNA呈红色。
由此对细胞中的DNA和RNA进行定位、定性、和定量分析。
(二)方法l．接种Hela细胞于盖片上并培养24～48小时，使长成单层。
2．取出盖片，用PBS(pH7.2)轻轻冲洗盖片表面去除残渣。
3．放入Carnoy固定液中固定l小时。
4．浸入甲基绿一呱咯宁醋酸缓冲液中30分钟染色。
细胞生物学实验
细胞生物学实验
一、细胞培养
1、细胞复苏
将冻存有细胞的冻存管从－70ºC 冰箱中取出，迅速置于已预热37ºC的水浴箱中不断摇动使冻存液在1 min 内解冻。
在超净工作台内吸出细胞悬液并滴加在含6 ml DMEM 培养基的离心管中，放入离心机1 000 rpm 离心6 min, 弃上清液，向离心管中加入DMEM 培养基6 ml 吹打混匀制成细胞悬液种于培养瓶中, 放入37ºC 5%CO2培养箱中继续培养，24 h 内换液，以除去残存冻存液和未贴壁细胞。
2、细胞培养与传代
当细胞长满培养瓶底约85%～90%时弃去原培养液，用PBS 轻洗2～3 次，弃去PBS，加入适量胰蛋白酶液，在倒置显微镜下观察，若胞质回缩，细胞间不再连接成片时，吸弃胰蛋白酶液，加入DMEM 培养基终止消化，轻轻吹打直至细胞全部脱落悬浮，将细胞悬液吸出分装至2~3 个培养瓶中，再加入适量DMEM 培养基和胎牛血清，血清浓度为10%，放入培养箱中静置培养。
传代第2 天吸出原培养
液，加入新培养液。
细胞约2~3 天传代1 次。
3、细胞冻存
细胞冻存前一天更换培养基，观察细胞生长情况，使细胞处于指数生长期。
按照细胞传代的方法收集，去少量细胞悬液在倒置显微镜下进行细胞计数。
然后将细胞悬液吸入离心管，1000 rpm 离心6min，弃上清，吸取细胞冻存液，吹打混匀细胞，使细胞密度为1×107个/ml，将细胞悬液吸入冻存管中严密封口，冻存管做标记。
先将冻存管放入4ºC 冰箱30 min，接着置于-20ºC 冰箱1 h，再移入超低温冰箱中保存。
《细胞生物学》实验指导书(不太全供参考).doc
《细胞生物学》实验指导书（不太全供参考）适用专业:生物科学、生物技术实验目录实验一植物原生质体的分离与融合•••]实验二动物细胞原代培养•••3实验三细胞传代培养…彳实验四植物细胞骨架的光学显微镜观察••Y实验五细胞凋亡的诱导、观察与检测“I实验六环境因素诱变染色体改组的观察实验七红细胞膜蛋白的分离及其电泳检测 (11)实验一植物原生质体的分离与融合实验项目类型:综合性所属课程名称：《细胞生物学》实验计划学时：7学时一、实验目的1.掌握原生质体分离的原理与技术；2.了解细胞融合的基本原理及应用；3.初步掌握PEG融合法和电融合法.二、实验原理植物原生质体是去除了细胞壁的裸露的细胞.原生质体可以从培养的单细胞、愈伤组织和植物器官（叶等）获得.但一般认为从叶肉组织分离原生质体是理想的材料，其优点是材料来源方便，供应及时，而且遗传性较为一致.原生质体的分离通常采用酶解法，对细胞壁成分进行降解后获得.原生质体培养的条件和对营养的要求与组织、细胞相似.但原生质体由于除去了细胞壁,所以需要一定浓度的渗透压稳定剂来保持原生质体的稳定.常用的渗透压稳定剂包括甘露醇、山梨醇、蔗糖等. 其次，还应当考虑取材、酶的种类和纯度、酶液的渗透压、酶解时间及温度等因素对分离原生质体的影响.2个或2个以上的细胞合并成为1个细胞的现象称为细胞融合.细胞融合的主要方法有病毒法、聚乙二醇(PEG)法和电融合3种方法，其原理基本相同，都是两细胞接触点的膜分子发生重组,然后由于表面张力作用,形成一个球形细胞. 原生质体分离融合和培养的意义：1.除去了细胞壁为植物细胞之间的融合扫平了障碍，为制造新杂种开辟了道路.植物原生质体融合和培养在植物遗传工程和育种研究上具有广阔的应用前景.它是植物同源、异源多倍体获得的途径之一，它不仅能克服远缘杂交有性不亲和障碍，也可克服传统的通过有性杂交诱导多倍体植株的麻烦，最终将野生种的远缘基因导入栽培种中，原生质体融合技术可望成为作物改良的有力工具之一.2.原生质体可摄入外源DNA,细胞器、细菌或病毒颗粒,这些特性与植物全能性相结合为高等植物的遗传饰变打下基础.3.获得细胞无性系和选育突变体的优良起始材料.三、实验仪器与材料1.材料:油菜叶子、白菜花2.溶液或试剂:(1)洗涤液:甘露醇0.7mol/L,CaC12 • 2H2O3.5mmol/L,KH2PO4 0.7mmol/L(pH 5.6),高压灭菌；(2)混合酶液:1.5%纤维素酶,1%果胶酶溶于洗涤液中(pH 5.6).(3)50%PEG(4)高pH高钙稀释液：(5)20%蔗糖溶液(6)DPD培养基：3.仪器或其他用具:超净工作台、灭菌锅、显微镜、恒温培养箱、镶子、解剖刀、剪子、接种针、铝饭盒、锡箔纸、记号笔、橡皮筋、试剂瓶、三角瓶移液管、培养皿、酒精灯等.四、实验步骤(一)原生质体的制备：1.取材:取新鲜油菜叶和白菜花瓣自来水洗净，再用70%乙醇浸泡30S,0.5%次氯酸钠消毒lOmin,无菌水冲洗5次.2.酶解：材料切成1mm宽细丝，加入适量酶液，置摇床上(60〜70rpm),在25〜28°C黑暗条件下，酶解5〜7h.3.分离：用200目网过滤除去未完全消化的残渣，在lOOOrpm条件下离心5分钟,弃上清.加入3〜4ml洗涤液，相同条件下离心2-5分钟，弃上清，留1ml洗液.用滴管将混有原生质体的1ml洗液吸出，轻轻铺于20% 蔗糖溶液上(5ml离心管装3ml 20%蔗糖溶液)，在lOOOrpm条件下离心5-10分钟，由于密度梯度离心的作用，生活力强状态好的原生质体漂浮在20%的蔗糖与洗涤液之间，破碎的细胞残渣沉入管底.用200 u 1移液器轻轻将状态好的原生质体吸出（注意尽可能不要吸入下层的蔗糖溶液），放入另一干净的离心管中，加4ml洗涤液,1000rpm离心2-5分钟, 弃上清.（二）原生质体融合：1.将原生质体用DPD调节浓度为1*105个/mL.2.将原生质体混合物滴入小培养皿，静置8〜10分钟.3.然后滴入50%的PEG溶液，静置2分钟.4.依次间隔5分钟加入0.5ml、1 ml和2 ml高钙高pH洗涤液.注意在第二、三次洗液加入前,用移液器轻轻吸走部分溶液，但不能吸干，否则原生质体破碎死亡;最后用液体培养基洗1〜2次.制片，镜检.五、实验报告画出观察到的融合细胞，并计算融合率.六、思考题1.你认为要获得数量多、生活力强的原生质体，在实验中应注意那些问题？增多数量的方法:多取材且尽量切碎，增加酶浓度，提高酶解温度，延长酶解时间，操作轻柔，勿使原生质体破碎等.提高生活力的方法:取新鲜材料,采用合适的酶浓度、作用温度和时间2.举例说明原生质体融合的应用价值.实验二动物细胞原代培养实验项目类型:基础性所属课程名称：《细胞生物学》实验计划学时：4学时一、实验目的1.掌握动物细胞原代培养的基本方法和操作过程；2.熟悉原代培养细胞观察方法.二、实验原理用直接从机体获取的细胞进行的培养称为原代培养.原代培养是建立各种细胞系的第一步，该技术可以在体外进行各种类型细胞的增殖、遗传、变异、分化和脱分化、恶变与去恶变等研究.分为组织块培养法和消化法两种.三、实验仪器与材料1.材料:小鼠心、肝、脾、肾等2.溶液或试剂：(1)RPMI-1640培养基、小牛血清.(2)0.25%胰蛋白酶、(pH 5.6).(3)Hanks液3.仪器或其他用具:CO2培养箱、倒置显微镜、超净工作台、高压锅、水浴锅、解剖器械、培养瓶、微量加样器、吸管、移液管、酒精灯、酒精棉球等.四、实验步骤1.处死小鼠:将小鼠用颈椎脱臼法处死，放入75%酒精种浸泡消毒.2.取材:在超净工作台中用灭菌的解剖器械剖开小鼠腹腔，辨认并取下肝脏、脾脏和肾脏，放入灭菌的培养皿中，加入Hanks液清洗，然后加入2mL胰蛋白酶液,研磨并过滤.3.将液体转移到离心管,1200rpm离心5min收集细胞,加入适量培养液,C02培养箱培养.4.观察:逐日在倒置镜下观察细胞生长情况.五、实验报告画出细胞贴壁前和贴壁后的形态.六、思考题试述细胞原代培养成功的条件？实验三细胞传代培养实验项目类型:基础性所属课程名称：《细胞生物学》实验计划学时：3学时一、实验目的1.熟练掌握贴壁细胞传代的培养方法；2.观察传代细胞贴壁、生长、繁殖过程中细胞形态的变化.二、实验原理离体培养的细胞群体增殖达到一定密度时，细胞的生长和分裂速度就会减慢甚至停止，如不及时分离传代培养,细胞将逐渐衰老死亡.传代培养是指细胞从一个培养瓶以1:2或其它比率转移，接种到另一培养瓶的培养.贴壁培养细胞的传代通常采用胰蛋白酶消化,把细胞分散成单细胞再传代.三、实验仪器与材料1.材料:原代培养的小鼠细胞或Hela细胞2.溶液或试剂：(1)RPMI-1640培养基、小牛血清.(2)0.25%胰蛋白酶、(pH 5.6).(3)Hanks液3.仪器或其他用具:CO2培养箱、倒置显微镜、超净工作台、高压锅、水浴锅、培养瓶、微量加样器、吸管、移液管、酒精灯、酒精棉球等.四、实验步骤1.将长成单层的细胞从二氧化碳培养箱中取出,在超净工作台中倒掉瓶内的培养液，加入少许消化液.(以液面盖住细胞为宜)，静置5~10分钟.2.在倒置镜下观察被消化的细胞，如果细胞变圆,相互之间不再连接成片，这时应立即在超净台中将消化液倒掉，加入3〜5ml新鲜培养液,吹打, 制成细胞悬液.3.将细胞悬液吸出2ml左右，加到另一个培养瓶中并向每个瓶中分别加3ml 左右培养液，盖好瓶塞，送回二氧化碳培养箱中，继续进行培养.五、实验报告分别画出贴壁生长的小鼠细胞和Hela细胞,并说明二者的不同.六、思考题写出细胞传代培养成功的条件？实验四植物细胞骨架的光学显微镜观察实验项目类型:基础性所属课程名称：《细胞生物学》实验计划学时：3学时一、实验目的了解细胞骨架的结构特征及其制备技术二、实验原理细胞骨架是由蛋白质丝组成的复杂网状结构，根据其组成成分和形态结构可分为微管、微丝和中间纤维.它们对细胞形态的维持，细胞的生长、运动、分裂、分化，物质运输，能量转换，信息传递，基因表达等起到重要作用.用适当浓度的Triton X-100处理细胞时，可将细胞质膜和细胞质中的蛋白质和全部脂质溶解抽提，但细胞骨架系统的蛋白质不受破坏而被保存，经戊二醛固定，考马斯亮蓝R250染色或间接免疫荧光标记以后，可在显微镜下观察到细胞骨架结构.三、实验仪器与材料1.材料:洋葱鳞茎和口腔上皮细胞2.溶液或试剂：(1)M-缓冲液(2)6mmol/L(pH 6.8)磷酸缓冲液(3)l%Triton X-100(用M-缓冲液配制)(4)0.2%考马斯亮蓝R250(5)3%戊二醛3.仪器或其他用具:光学显微镜、50ml烧杯、玻璃滴管、容量瓶、试剂瓶、载玻片、盖玻片、镶子、小剪刀、吸水纸、擦镜纸等.四、实验步骤1.撕取洋葱鳞叶内表皮若干片,大小约lcm2,置于青霉素小瓶或小烧杯中.2.用磷酸缓冲液(PBS)浸泡片刻.3.吸去磷酸缓冲液，用1% TritonX-100处理20分钟抽提细胞骨架以外的蛋白质,从而使骨架图像更加清晰.4.吸去TritonX-100,用M-缓冲液洗3次，每次3分钟.M-缓冲液有稳定细胞骨架的作用.5.用3%戊二醛固定15-20分钟6.用PBS洗3次，每次3分钟7.考马斯亮蓝染色15分钟8.蒸馅水洗2次9.置于载玻片上，盖上盖玻片，在光学显微镜下观察.五、实验报告绘出植物细胞骨架微丝结构图.六、思考题说出各步骤的目的和一些重要试剂的在此处的作用.实验五细胞凋亡的诱导、观察与检测实验项目类型:创新设计性实验所属课程名称：《细胞生物学》实验计划学时：9学时一、实验目的1.了解细胞凋亡的概念和原理;2.掌握细胞凋亡诱导的方法;3.认识细胞凋亡的特征.二、实验原理人体内的细胞注定是要死亡的，目前人们已经知道细胞的死亡起码有两种方式，即细胞坏死与细胞凋亡.坏死是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程.表现为细胞胀大，胞膜破裂，细胞内容物外溢，核变化较慢,DNA降解不充分，引起局部严重的炎症反应.凋亡是细胞受到内、外因子刺激后发生的由基因调控的生理性死亡行为.其细胞及组织的变化与坏死明显不同.细胞凋亡的形态学变化: 首先细胞体积缩小，连接消失，与周围的细胞脱离，然后胞质密度增加, 核质浓缩，核膜核仁破碎,DNA降解,胞膜形成小泡，最终为为几个凋亡小体，无内容物外溢,因此不引起周围的炎症反应，凋亡小体可迅速被周围专职或非专职吞噬细胞吞噬.凋亡细胞DNA的有控降解是一种内源性核酸内切酶作用的结果,该酶在核小体连接部位切断染色体DNA,这种降解表现在琼脂糖凝胶电泳中就呈现特异的梯状Ladder图谱,而坏死呈弥漫的连续图谱.三、实验仪器与材料1.鸡血细胞2.溶液或试剂：生理盐水,20mmol/LCaC12顺伯，姬姆萨染色剂，Tris.HCl,SDS, EDTA,乙醇，甲醇，蛋白酶K.3.仪器或其他用具:超净工作台、灭菌锅、显微镜、恒温培养箱、镶子、解剖刀、剪子、接种针、铝饭盒、锡箔纸、记号笔、橡皮筋、试剂瓶、三角瓶移液管、培养皿、酒精灯等.四、实验步骤（一）细胞凋亡的诱导：1.采鸡血10ml,加0.85%的生理盐水混匀,1200r/min离心5min,弃上清液（重复三次），制备红细胞悬液，然后加入50ml血细胞保存液混匀放于4°C冰箱中备用.2.取4个试管，各加入鸡血细胞保存液2ml,在1号管中加入2ml生理盐水作为阴性对照,2号试管加入2ml 10ug/ml的顺伯溶液作为阳性对照;3号试管中加入2ml 20mmol/L的CaC12溶液进行胁迫处理;4号试管不加任何物质，实验时煮沸5 min使细胞坏死.（二）细胞凋亡的形态学观察：1.处理4h取样，用生理盐水稀释5倍，各取50ul细胞悬液均匀涂布于5 片载玻片上,晾干.2.用甲醇固定2min,然后在载玻片上滴加适量姬姆萨染液染色lOmin.3.用蒸馅水轻轻洗去染液，室温晾干，在光学显微镜下观察细胞形态变化.4.照相，并对试验组细胞进行凋亡计数统计.（三）DNA梯状条带的检测：1.离心收集鸡血细胞，弃上清.2.加入1ml的细胞裂解缓冲液重悬，转入1.5ml离心管中，加入蛋白酶K （500ug/ml）20 n 1,混匀.3.在65°C恒温水浴锅中水浴30min（也可转入37°C水浴12〜24h）,间歇振荡离心管数次.4.于台式离心机以12000 rpm离心5min,取上清液入另一离心管中.5.加2倍体积异丙醇，倒转混匀后，可以看见丝状物，用100ul吸头挑出, 或12,000转/分离心5分钟，弃上清,晾干.6.用50ulTE 缓冲液(pH8.0)溶解沉淀,并加入RNase A(10ug/ul)5ul,于37 °C 保温10〜15分钟.7.1.2 %琼脂糖凝胶,75 V电压，电泳45 min左右，8.紫外灯下观察并照相.(琼脂糖凝胶电泳:称取 1.2克琼脂糖加入100ml1*TBE),加热使之溶解，取一个凝胶模子，两端用胶布封好，水平放置.将制孔器(即梳子)放在模子一侧约0.5cm处，其底部距模子约1mm.待琼脂冷至约70°C时，加入10ul 0.5mg/ml EB,混匀，倒入模子，待冷却凝固后，取下梳子，撕去两端胶布,放入电泳槽中，使有加样孔的一端放在负极一端.在电泳槽中加入1*TBE至超过凝胶表面约1mm.加入DNA 电泳样:1.5ul DNA 。
(完整版)医学细胞生物学实验1
酸性蛋白的显示结果
（左图×100，右图×400）
碱性蛋白的显示结果
(左图×100，×400）
作业
实验一 光学显微镜的使用与细胞化学成分的分析
• 实验内容
• 一、显微镜的结构及使用方法
• 1、光学显微镜的主要构造
• 机械部分
• 照明部分
• 光学部分
• 2、光学显微镜的使用方法
• 对光 置片 低倍 高倍
• 低倍镜使用
•
高倍镜使用
• 3、使用光学显微镜的注意事项
复原
二、细胞化学成分的分析
1 、酸性蛋白和碱性蛋白的显示 •制作蟾蜍血涂片三张，编号。 •1#、2#血涂片→凉干→70%乙醇中固定5 分钟→冲洗→90℃的5%三氯醋酸处理15 分钟→冲净 → 1#→0.1%酸性固绿染色3分钟
2#→0.1%碱性固绿染色30分钟 →冲洗→吸干→观察
2、DNA和RNA的显示
3#血涂片→凉干→70%乙醇中固定5-10 分钟→冲洗→甲基绿一哌罗宁混合染液 染色20分钟→冲洗→吸干→观察 四、作业 （1）绘制蟾蜍红C所显示的酸性蛋白或 碱性蛋白的分布图 （2）绘制蟾蜍红C所显示的DNA和RNA 分布图
细胞生物学实验报告
1、通过对原核和真核各种形态细胞的光学显微镜观察，了解细胞的形态及其显微构造；2、学习显微测量的方法，对细胞的大小有向来观认识。
小白鼠肝细胞切片；鸡血红细胞；蚕豆叶片横切片；普通光学显微镜；目镜测微尺；镜台测微尺；载玻片；盖玻片。
(一)细胞形态观察l、动物细胞的观察〔1〕人肝细胞切片：在显微镜下子细观察肝细胞的形态构造。
〔2〕鸡血细胞涂片的观察：观察血细胞的组成；红细胞、白细胞、血小板的形态特点。
2、植物细胞的观察〔1〕取蚕豆叶片横切片的观察：注意表皮细胞和叶肉细胞的根本构造。
〔二〕细胞的大小和测量1、卸下目镜的上透镜，将目镜测微尺刻度向下装在目镜的焦平面上，再旋上目镜的上透镜。
2、将镜台测微尺刻度向上放在镜台上夹好，使测微尺分度位于视野中央。
调焦至能看清镜台测微尺的分度。
3、小心挪移镜台测微尺和转动目镜测微尺(如目镜测微尺分度含糊，可转动目镜上透镜发展调焦)，使两尺左边的向来线重合，然后由左向右找出两尺另一次重合的直线。
4、记录两条重合线间目镜测微尺和镜台测微尺的格数。
按下式计算目镜测微尺每格等于多少μm：1、目镜校正： 40倍显微镜目镜测微尺每格的微米数2、细胞大小的测量：1、血细胞按含量上下，主要含有：红细胞，白细胞，血小板。
白细胞最大，红细胞次之，血小板最小。
红细胞：主要的功能是运送氧。
白细胞：主要扮演了免疫的角色， 当病菌侵入人体时， 白细胞能穿过毛细血管壁， 集中到病菌入侵部位，将病菌包围，吞噬。
血小板：止血过程中起着重要作用。
细胞形态见以下图。
2、植物细胞普通比动物细胞大一些。
形态图见下。
3、在不同放大倍数下，测定的细胞大小根本一致，但有一些偏差。
放大倍数越大，在视野中同等实际距离下的两点视野距离更大，而更容易测量准确。
1、熟悉PAS 法原理及操作步骤；2、观察PAS 反响的染色结果，并观察多糖在组织细胞中的分布。
多糖是由多个单糖份子缩合脱水而生成的化合物。
一些不溶性的多糖构成植物和动物的 骨架， 如植物的纤维素和动物的甲壳素， 普通称为构造多糖。
细胞生物学实验手册：细胞显微摄影
实验二十三细胞显微摄影
【实验目的】
了解生物显微摄影的基本原理和装置，以及照相暗室工作的基本过程。
【实验用品】
一、材料和标本人类染色体标本，其它染色的生物标本片。
二、器材和仪器显微镜、35毫米照像机、显微照明装置、自动曝光控制器、ASAl00黑白135胶卷、洗印和放大等成套的暗室设备。
三、试剂 D一72式普通显影液、SB-1式停影剂、F一5酸性定影液
【实验内容】
一、原理
生物显微摄影(Microphotography)是利用摄影装置来拍摄显微镜视野中所观察到的物像。
在生物医学方面，主要用于对正常细胞或病变细胞的显微形态学研究记录。
二、操作步骤
(一)拍摄前准备
1．光路合轴使光轴与光束处于同一轴线上。
2．柯勒氏照明使观察的视野获碍均匀而又充分的照明；防止杂散光对照相系统产生影响；使被摄物体不受热，影象清晰。
3．物镜与目镜合理组合依标本的不同和显微摄影要求，物镜与目镜的组合有一定规范，如：拍摄人类染色体影像，采用高分辨率的100倍油镜，配合10倍目镜，可获得良好分辨的理想放大影像。
4．调整视场光阑和孔径光阑使两者与所用物镜的数值孔径(N．A．镜口率)相等，所得的分辨力最高；视场光阑一旦调好，不要再动，而孔径光阑可随物镜数值孔径的更换，做相应的调整。
一般来说，把孔径光阑的大小调成等于相应该物镜孔径像的2／3为宜，尽管丧失了少许的分辨力，却能提高影像的反差、焦点深度和清晰度。
总之，上述作法是调整显微镜至最佳状态。
(二)拍摄程序。
细胞生物学实验手册
细胞生物学实验手册授课教师：毛晓霞（一）成绩1、实验占期末总成绩30%，即30分；取七个实验的平均成绩为实验最终成绩2、分组名单：分AB两班，每班5组，每组6人3、请假：辅导员签字的假条+提前一天电话请假（二）实验要点实验一光学显微镜使用及显微摄影技术一、实验目的1、了解光学显微镜结构原理并熟练掌握其操作方法；2、掌握显微摄影技术操作流程3、了解部分细胞生物学中所使用的大型仪器设备的操作流程及用途。
二、实验原理显微镜的放大效能是由其照明系统所使用光的波长和透镜系统的数值孔径决定，缩短使用的光波长或增加数值孔径可以提高分辨率。
可见光的光波振幅较窄，因此使用较短波长的紫外光作为光源系统，可以提高分辨率。
三、实验内容1、双目显微镜的操作规范：2、NIKON80i显微摄影系统的操作流程3、胶片放大洗印技术流程4、部分大型仪器设备介绍荧光显微镜 Fluorescence microscope暗视野显微镜 dark field microscope相差显微镜微分干涉差显微镜倒置显微镜 inverse microscope显微操作仪透射电子显微镜 TEM四、作业1、双目显微镜操作流程规范五、思考题1、暗视野显微镜的定义与应用2、相差显微镜的定义与应用实验二血涂片的制备及细胞大小的测量一、实验目的：1、掌握血涂片的制备技术2、认识血液中红细胞和各类白细胞的形态3、掌握目镜测微尺的使用方法二、实验原理：将血液样品制成单层细胞的涂片标本，经瑞氏－吉姆萨染液染色后，不同白细胞中的颗粒可以呈现不同的颜色。
碱性粒细胞的颗粒呈蓝紫色，酸性粒细胞的颗粒呈7橘红色，中性粒细胞的颗粒呈粉红色。
根据细胞中颗粒的颜色、大小及多少，再结合细胞的大小及细胞核的形态，就可以将白细胞进行分类计数。
三、实验步骤（一）血涂片的制备1、消毒与取血消毒先按摩取血部位,使血流通畅;再用酒精消毒采血针和取血部位(如指尖). 取血待酒精干后,刺破皮肤,使血自然流出,勿挤.2、推片取一块边缘光滑的载片做推片.将其一端置于血滴前方,向后移动到接触血滴,使血液均匀分散在推片与载片的接触处.然后使推片与载片呈30°～40°角,向另一端平稳地推出 ,迅速在空气中摇,使之自然干燥.3、染色加瑞氏－吉姆萨A染液1－2滴，染色1分钟，再将瑞氏－吉姆萨B染液滴加于A液上面（滴加之量为A液的2－3倍），染色5－10分钟。
细胞生物学实验文档
实验小鼠巨噬细胞吞噬的观察一、实验目的：通过观察小鼠巨噬细胞吞噬红细胞的实验，了解巨噬细胞对异物吞噬的原理和功能。
了解吞噬在机体非特异免疫中的重要作用。
二、实验原理：高等动物体内的巨噬细胞、单核细胞和嗜中性粒细胞，具有吞噬的功能。
它们广泛分布在组织和血液中，在机体的非特异免疫功能中起着重要的作用。
当病原微生物或其他异物侵入机体时，能招引巨噬细胞，而巨噬细胞又具有趋化性，它通过产生活跃的变形运动，主动向病原体和异物移行聚集，首先把异物吸附在细胞表面，随之，吸附区域的细胞膜向内凹陷，伸出伪足包围异物，并吞入胞质，形成吞噬泡，继而在细胞质中的初级溶酶体与吞噬泡融合，形成吞噬溶酶体，把病原体杀死，异物消化分解。
三、实验仪器、材料和试剂（1）仪器、用具：显微镜、、解剖盘、注射器、吸管、载玻片、盖玻片。
（2）材料：小鼠（体重20g左右），鸡血。
（3）试剂：6%淀粉肉汤（含0.3%台盼蓝）。
四、方法与步骤（1）实验前24h，每天给小白鼠腹腔注射6%淀粉肉汤（含台盼蓝）1ml。
（2）实验时，再往腹腔内注射1ml1%鸡红细胞悬液，并轻柔腹部，使鸡红细胞悬液分散。
（3）20-30min后，用脊椎脱臼法处死小鼠（右手抓住鼠尾，用力向后拉，左手拇指与食指同时按住鼠头，使脊髓与脑髓间断开致死）。
（4）迅速剖开腹腔，用未装针头的注射器或吸管吸取腹腔液。
（5）取一张干净的载玻片，滴一滴腹腔液，制成血涂片，盖上盖玻片，显微镜下检查。
四、作业：绘图示出所观察到的小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的各种形态。
实验糖类的细胞化学——PAS反应——过碘酸席夫反应（PAS）显示糖原等多糖物质一、实验目的：掌握细胞中糖类物质的鉴别方法，了解糖类物质在细胞中的分布和形态。
二、实验原理：在石蜡切片中，低分子糖和单糖、双糖已在固定和脱水过程中消散，因此在石蜡切片中只含有高分子的糖和糖原、粘多糖、粘蛋白、糖蛋白等。
高聚物质有自由的醛根，所以不能直接采用醛基反应鉴定，糖中的醛基必须在某些氧化剂和水解剂的作用下才能露出。
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细胞生物学实验手册授课教师:毛晓霞(一)成绩1、实验占期末总成绩30%,即30分;取七个实验的平均成绩为实验最终成绩2、分组名单:分AB两班,每班5组,每组6人3、请假:辅导员签字的假条+提前一天电话请假(二)实验要点实验一光学显微镜使用及显微摄影技术一、实验目的1、了解光学显微镜结构原理并熟练掌握其操作方法;2、掌握显微摄影技术操作流程3、了解部分细胞生物学中所使用的大型仪器设备的操作流程及用途。
二、实验原理显微镜的放大效能就是由其照明系统所使用光的波长与透镜系统的数值孔径决定,缩短使用的光波长或增加数值孔径可以提高分辨率。
可见光的光波振幅较窄,因此使用较短波长的紫外光作为光源系统,可以提高分辨率。
三、实验内容1、双目显微镜的操作规范:2、NIKON80i显微摄影系统的操作流程3、胶片放大洗印技术流程4、部分大型仪器设备介绍荧光显微镜Fluorescence microscope暗视野显微镜dark field microscope相差显微镜微分干涉差显微镜倒置显微镜inverse microscope显微操作仪透射电子显微镜TEM四、作业1、双目显微镜操作流程规范五、思考题1、暗视野显微镜的定义与应用2、相差显微镜的定义与应用实验二血涂片的制备及细胞大小的测量一、实验目的:1、掌握血涂片的制备技术2、认识血液中红细胞与各类白细胞的形态3、掌握目镜测微尺的使用方法二、实验原理:将血液样品制成单层细胞的涂片标本,经瑞氏－吉姆萨染液染色后,不同白细胞中的颗粒可以呈现不同的颜色。
碱性粒细胞的颗粒呈蓝紫色,酸性粒细胞的颗粒呈7橘红色,中性粒细胞的颗粒呈粉红色。
根据细胞中颗粒的颜色、大小及多少,再结合细胞的大小及细胞核的形态,就可以将白细胞进行分类计数。
三、实验步骤(一)血涂片的制备1、消毒与取血消毒先按摩取血部位,使血流通畅;再用酒精消毒采血针与取血部位(如指尖)、取血待酒精干后,刺破皮肤,使血自然流出,勿挤、2、推片取一块边缘光滑的载片做推片、将其一端置于血滴前方,向后移动到接触血滴,使血液均匀分散在推片与载片的接触处、然后使推片与载片呈30°～40°角,向另一端平稳地推出,迅速在空气中摇,使之自然干燥、3、染色加瑞氏－吉姆萨A染液1－2滴,染色1分钟,再将瑞氏－吉姆萨B染液滴加于A液上面(滴加之量为A液的2－3倍),染色5－10分钟。
最后用蒸馏水把染液冲掉,用吸水纸吸干,自然干燥后,即可镜检观察4、观察、四、注意事项玻片的清洗:使用玻片时只能手持玻片边缘,切勿触及玻片表面,以保持玻片清洁,干燥,中性,无油腻、细胞染色对氢离子浓度十分敏感,在染色过程中玻片必须化学清洁,配制瑞氏染液必须用优质甲醇,稀释染液必须用缓冲液,冲洗用水应近中性, 否则各种细胞染色反应异常,致使细胞的识别困难,甚至造成错误、染色时间与染液浓度,室温高低,细胞多少有关、染液越淡,室温越低, 细胞越多,所需染色时间越长或应适当增加染液量,因此染色时间应视具体情况而定、特别就是更换新染料时必须经试染,摸索最佳染色条件、染液不可过少,以防蒸发干燥染料沉着于血片上难冲洗干净、冲洗时应用流水将染液冲去,不能先倒掉染液,以免染料沉着于血片上、测微尺的使用显微测微尺就是用来测量细胞在显微镜下长度的工具,由目镜测微尺与镜台测微尺组成,两尺配合使用、计算细胞、细胞核体积的公式:圆形V=4/3πr 3(r为半径)椭圆形V=4/3πab2(a、b为长、短半径)核质比N／D=Vn／(Vc—Vn)(Vn为核的体积,Vc就是细胞质的体积)五、作业题❖1、制备一张血涂片,观察并描述其中各类血细胞的形态特征❖2、任选20个红细胞,测量其直径,并计算出平均值六、思考题从外观来判断,一张好的血涂片有哪些特征？实验三细胞凝集反应及细胞膜的渗透性一、实验目的了解细胞膜的表面结构;了解细胞膜的渗透性及各种物质进入细胞膜的速度二、实验的原理1、细胞凝集反应细胞质膜就是由蛋白质不同程度镶嵌在脂双层中所形成的动态流动结构,蛋白质与脂类分子又与寡糖链结合为糖蛋白与糖脂分子,糖蛋白与糖脂分子伸至细胞表面的分枝状寡糖链在质膜表面形成细胞外被(又称为糖萼)。
凝集素(1ectin)就是一类含糖的(少数凝集素例外)并能与糖进行专一性结合的蛋白质,它具有凝集细胞与刺激细胞分裂的作用。
凝集素促使细胞凝集主要就是由于它能与细胞外被的糖分子相连接、在细胞间形成“桥”的结果,且加入与凝集素互补的糖分子可以抑制细胞间的凝集反应。
2、细胞膜的渗透性细胞膜(cell membrane):又称质膜、细胞表面的一层薄膜、厚度通常为7～8nm,由脂类与蛋白质组成,还有一类碳水化合物,我们知道糖类物质也属于碳水化合物的范围。
细胞膜把细胞包裹起来,使细胞能够保持相对的稳定性,维持正常的生命活动、它最重要的特性就是半透性,或称选择渗透性,对进出入细胞的物质有很强的选择透过性,它可以选择性的让某些分子进入或排出细胞。
这就是细胞膜最基本的一种功能、如果细胞丧失了这种功能,细胞就会死亡、三、作业题(1).绘制简图,表示血细胞的凝集过程;(2).图示血细胞凝集的原理。
四、思考题加入凝集素的细胞会凝聚在一起,加入何种物质能抑制细胞凝集？实验四叶绿体的分离与荧光观察一、荧光显微镜的基本结构、原理、操作方法二、荧光显微镜使用步骤光学观察1.开电源2.按预置开关、3.将ND8 ,ND32, NCB11减光片,色温片移入光路4.推入光路转换杆,使光路充满双目镜筒5.转动激发方式转换盘放空位处6.将聚光镜升到最高位7.全部开启视场光阑与视场光阑(使用1-100X聚光镜时,将顶透镜置入光路)8.将10X物镜置于光路中9.放置标本并将要观察部分置于光路中10.对标本调焦11.调节视度与瞳孔距离、12.聚光镜聚焦与对中、13.转换到所需的物镜观察标本每次转换物镜时,都要调节视场光阑与孔径光阑(视场光阑: 调到刚好外切视场 ;孔径光阑: 物镜数值孔径(N、A)的70%至80%)14.观察完毕后,关闭电源、荧光观察1.执行“光学观察”中的步骤1至11。
2.降低聚光镜或移开聚光镜并在它位置装上遮光管。
3.关闭显微镜电源开关。
4.关闭光闸与阻断落射照明光组。
5.将要使用的激发法相应荧光块移入光路。
6.完全打开落射照明装置的视场光阑与孔径光阑7.打开落射照明装置光源的电源开关照后打开光闸,对中照明灯8.将10X物镜置入光路。
9.放入标本并将要观察部分移入光路中。
10.对标本调焦。
11.将落射荧光装置的视场光阑对中心。
、12.转换到需要的物镜并观察标本。
* 用落射荧光装置的ND减光片调解亮度。
* 调节视场光阑使其刚好外切视场。
* 用孔径光阑调节图像亮度,使用孔径光阑之前,先完成它的对中。
* 使用油浸物镜时,在标本与物镜间滴入浸油。
13.回复到明场显微术* 关闭落射照明装置的光闸并阻断落射荧光光线。
* 旋转激发法转换盘将无荧光滤光块的位置移入光路* 如果没有装上聚光镜装上聚光镜,然后进行聚光镜的对中与调焦(参阅明场显微术12节)* 打开显微镜电源开关转到透射光源14.完成观察后关掉所有电源开关三、叶绿素的自发荧光与叶绿体的间接荧光原理某些物质在一定短波长的光(如紫外光)的照射下吸收光能进入激发态,从激发态回到基态时,就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光(如可见光),这种光就称为荧光。
若停止供能,荧光现象立即停止。
有些生物体内的物质受激发光照射后,可直接发出荧光(称为自发荧光),如叶绿素的火红色荧光。
有的生物材料本身不发荧光,但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光(称为间接荧光),如叶绿体吸附吖啶橙后可发橘红色荧光本实验利用荧光显微镜对发荧光的叶绿体进行观察。
吖啶橙(Acridine Orange,AO)就是一种荧光色素,其激发滤光片波长488nm。
阻断滤光片波长515nm。
它与细胞中DNA与RNA结合量存在差别,可发出不同颜色的荧光(即着色特异性),这就是由于DNA 就是个高度聚合物,吸收荧光物质的位置较少,发绿色荧光,而RNA聚合度低,能与荧光物质结合的位置多,故发红色荧光。
四、作业题1、根据荧光观察结果,绘制菜叶的结构模式图。
2、概述滤镜系统的选用原则。
五、思考题1、分离细胞组分时,为什么要加入0、35mol/L 氯化钠？实验五 DNA的Feulgen染色一、Feulgen反应的原理二、操作方法Carnoy液固定12h↓温浴至60℃的1 mol/L HCl溶液中水解8 min↓蒸馏水冲洗3次(使水解停止)↓Schiff试剂中染色30min↓用漂洗液洗3~5次(以洗去多余的非特异性色素及扩散的染料)↓蒸馏水洗3次↓压片↓镜检三、作业题1、绘图表示Feulgen反应的染色结果四、思考题1、总结Feulgen反应染色结果的影响因素。
2、在稀盐酸水解后,为什么要用亚硫酸水进行洗片？实验六石蜡切片技术一、石蜡切片操作基本过程石蜡切片的制作过程主要包括:取材,固定,脱水,透明,透蜡,包埋,切片,贴片,染色,透明,封藏等步骤。
1.取材材料的好坏直接影响到切片的质量,无论取哪一种动植物材料,以下几点就是必须注意的。
(1)植物材料选择时须尽可能不损伤植物体或所需要的部分;动物材料取用时常对动物施以麻醉,常用的麻醉剂有氯仿与乙醚,或将动物杀死后迅速取出所需要的组织。
(2)取材必须新鲜,这一点对于从事细胞生物学研究尤为重要,应该尽可能割取生活着的组织块,并随即投入固定液。
(3)切取材料时刀要锐利,避免因挤压细胞使其受到损伤。
(4)切取的材料应该小而薄,便于固定剂迅速渗入内部。
一般厚度不超过2mm,大小不超过5×5mm2。
2.固定固定剂的作用对象主要就是蛋白质,至于其她成分如脂肪与糖,在一般制作时不加考虑,如要观察这些物质,可用特殊的方法将其固定下来。
固定剂的作用表现在对材料体积的改变、硬化的程度、穿透的速度以及对染色的影响等方面。
这些作用的好坏、大小,都依所固定的材料性质而定,同样一种固定液对某一材料来说就是良好的,但对另外一些组织可能就不很适用。
良好的固定剂必须具备的特征就是:穿透组织的速度快,能将细胞中的内含物凝固成不溶解物质,不使组织膨胀或收缩以保持原形,硬化组织的程度适中,增加细胞内含物的折光度,增加媒染与染色能力,具有保存剂作用。
固定剂有简单固定剂与混合固定剂的划分。
简单固定剂即单一的固定剂,常用的有乙醇、甲醛、冰醋酸、升汞、苦味酸、铬酸、重铬酸钾与锇酸。
其中,苦味酸、升汞、铬酸既能凝固细胞清蛋白,又能凝固核蛋白;乙醇只能凝固清蛋白,而醋酸只能凝固核蛋白;甲醛、饿酸与重铬酸钾对这两种蛋白质都不凝固。
简单固定剂的局限性较大,如将其适当混合,制成复合固定剂可以取得更好的效果。