荧光原位杂交更新
荧光原位杂交技术的临床应用_概述及说明
荧光原位杂交技术的临床应用概述及说明1. 引言1.1 概述荧光原位杂交技术是一种重要的分子生物学方法，可以通过使用荧光探针与待测DNA序列特异性结合，实现对目标DNA的检测和定位。
该技术的广泛应用使其成为基因诊断、细胞生物学以及遗传学研究的关键工具。
本文将对荧光原位杂交技术进行全面概述，并讨论其在临床诊断和生命科学研究中的重要应用。
1.2 文章结构本文将按照以下结构进行介绍和讨论：首先，我们将简要介绍荧光原位杂交技术的基本原理和相关概念；接着，我们将详细阐述该技术在临床诊断中的应用，包括癌症相关染色体异常的检测与定位、遗传疾病的分子诊断与遗传咨询以及微生物检测和感染性疾病的诊断；然后，我们将探讨该技术在生命科学研究领域中的重要应用，包括基因组和染色体结构分析、基因表达调控机制研究以及细胞核内事件及细胞过程动态观察与实时监测；最后，我们将对荧光原位杂交技术进行总结和评价，并展望其未来发展趋势。
1.3 目的本文的目的是全面概述荧光原位杂交技术的临床应用，并介绍该技术在生命科学研究中的重要性。
通过阐述其基本原理和应用案例，旨在增进读者对该技术的了解，并为相关领域的研究人员提供指导和启示。
同时，我们还将对该技术的优势和局限性进行评价，以便读者更好地理解并运用荧光原位杂交技术。
2. 荧光原位杂交技术概述2.1 原位杂交技术简介荧光原位杂交技术是一种用于分析染色体、基因组和RNA等核酸序列的强有力的方法。
它基于亲和性结合原理，利用荧光标记的探针与待测样品中的靶序列进行特异性杂交，通过可见光或荧光显微镜观察探针与样品是否杂交成功，从而实现对目标序列的定位和检测。
2.2 荧光原位杂交技术的基本原理荧光原位杂交技术主要包括以下几个步骤：首先，利用DNA合成或PCR扩增方法得到所需的荧光标记探针；然后，通过氨基化反应将这些探针连接到具有亲和性活性分子（如尾牙肌动蛋白）上，形成完整的荧光标记探针；接下来，在待测样品上进行脱氧核苷酸（dNTP）逆转录DNA合成反应，并在此过程中引入树酰胺（digoxigenin）－标记或生物素－标记dUTP等标记探针；然后，对样品进行固定处理，并与探针进行杂交，使探针与样品中的互补序列结合；最后，利用可见光或荧光显微镜观察并分析杂交信号，实现对目标序列的检测和定位。
荧光原位杂交
荧光原位杂交
染色体涂染探针
人类染色体结构分析
荧光原位杂交
染色体涂染探针：染色体结构异常分
析ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
荧光原位杂交
多色复合染色体 FISH探针
多色FISH（muti-color FISH) 多色复合染色体FISH探针(multiplex
• 与之比FISH的优点 • ①操作操作简便,探针标记后稳定,一次标记后可使用二年 • ②方法敏感,能迅速得到结果 • ③在同一标本上,可同时检测几种不同探针. • ④不仅可用于分裂期细胞染色体数量或结构变化的研究,
而且还可用于间期细胞的染色体数量及基因改变的研究. 缺点：不能达到100%杂交，特别是在应用较短的cDNA 探针时效率明显下降。
单拷贝探针
FISH检测微小缺失
荧光原位杂交
单拷贝探针
FISH检测微小缺失
荧光原位杂交
染色体片段重复 Dup 19(p13.2-13.1)
荧光原位杂交
简单重复序列探针
• 简单重复序列探针(simple repetitive probes) ——异染色质着丝粒探针(heterochromatic centromer probes)
• 目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、 染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前 诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域。。
荧光原位杂交
原有的放射性同位素原位杂交技术存在着较多缺点，诸如每 次检验均 需重新标记探针，已标记的探针表现出明显的 不稳定性，需要较和时间的曝光时间和对环境的污染等。 在观察结果时，需要较多的分裂进行统计学分析。此外， 由于放射性银粒和染色体聚集的不同平面，可能引起计数 上的误 差等。
荧光原位杂交技术的研究进展
荧光原位杂交技术的研究进展何世斌;柴连琴;谭珺隽;沈尧;周萍;马云峰;李立家【摘要】荧光原位杂交(FISH)是在染色体、间期细胞核和DNA纤维上进行DNA序列定位的一种有效手段.近年来,围绕提高检测的分辨率和灵敏性,不断将免疫染色、量子点和微流控芯片等物理化学技术引入到荧光原位杂交中,促进了它的快速发展.本文主要综述了荧光原位杂交的基本原理和发展历程,重点介绍了免疫染色-荧光原位杂交(immuno-FISH)、量子点-荧光原位杂交(QD-FISH)和微流控芯片-荧光原位杂交(FISH on microchip)等多种新技术及其检测特点,如快速、灵敏、动态、多样化等.随着荧光原位杂交技术的不断完善与发展,将在细胞遗传学、表观遗传学及分子生物学等领域发挥更加重要的作用.【期刊名称】《植物科学学报》【年(卷),期】2014(032)002【总页数】6页(P199-204)【关键词】荧光原位杂交;免疫染色;量子点;微流控芯片【作者】何世斌;柴连琴;谭珺隽;沈尧;周萍;马云峰;李立家【作者单位】河南大学生命科学学院,河南开封475004;河南大学生命科学学院,河南开封475004;武汉大学生命科学学院,武汉430072;河南大学生命科学学院,河南开封475004;河南大学生命科学学院,河南开封475004;河南大学生命科学学院,河南开封475004;武汉大学生命科学学院,武汉430072【正文语种】中文【中图分类】Q343分子细胞遗传学的发展为宏观细胞学和微观分子生物学的研究架起了一座桥梁。
早期细胞遗传学的研究是建立在细胞核和染色体基本特征上的，如染色体的长短、臂比、着丝粒、端粒、核仁组织区等，荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization，FISH)的出现标志着分子细胞遗传学一个重要阶段的开始。
近年来，随着物理、化学技术的发展与进步，免疫染色、量子点和微流控芯片等不断被引入到荧光原位杂交中，促进了荧光原位杂交技术和分子细胞遗传学的发展。
荧光原位杂交(fish)
荧光原位杂交技术荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization），简称FISH。
是利用荧光标记的特异核酸探针与细胞内相应的靶DNA分子或RNA分子杂交，通过在荧光显微镜或共聚焦激光扫描仪下观察荧光信号，来确定与特异探针杂交后被染色的细胞或细胞器的形态和分布，或者是结合了荧光探针的DNA区域或RNA分子在染色体或其他细胞器中的定位。
中文名fish外文名fluorescent in situ hybridization建立时间1986年发展历程1969年，Pardue和John等两个研究小组开始采用放射性标记DNA或28S RNA发明了原位杂交技术（ISH）。
尽管当时原位杂交技术已经具有较高的特异性和灵敏度，但鉴于放射性同位素自身特性的局限，如安全性、空间分辨率低、不稳定性等问题，这项技术仅限于实验室研究方面的应用。
1986年科研工作者开始利用异硫氰酸盐荧光素来标记探针，并在荧光显微镜下进行观察分析，建立了荧光原位杂交技术（FISH）。
1989年，Delong首次使用荧光标记寡核苷酸探针检测单个微生物细胞。
由于FISH技术具有敏感度高、信号强、背景低、快速等优点，该方法在环境微生物的检测中得到了广泛的应用。
随着科技的迅速发展，FISH探针标记物越来越多，不仅从单一荧光发展到多色荧光检测，而且应用范围也进一步扩大，不仅可以用于分裂相细胞而且可以用于间期细胞检测，为FISH技术的临床应用打下了坚实的基础。
操作步骤编辑播报（1）样品的固定；（2）样品的制备和预处理；（3）预杂交；（4）探针和样品变性；（5）用不同的探针杂交以检测不同的靶序列；（6）漂洗去除未结合的探针；（7）检测杂交信号，进行结果分析·荧光信号观察：将处理好的样品置于荧光显微镜下，选择分散较好的区域来观察。
三色（或者更多）荧光激发下，观察到不同颜色的荧光图像。
通常选用20X物镜来扫描样品杂交区域，40X或100X物镜下观察样品，从一定的方向进行计数，并对计数情况进行分析。
荧光原位杂交技术的现状与未来
荧光原位杂交技术的现状与未来作者：王水兵李想来源：《大经贸·创业圈》2019年第10期【摘要】荧光原位杂交技术是近30多年不断发展起来的一种改变细胞遗传学研究方式的技术，它基于碱基互补配对原则，使用被荧光素标记的DNA探针与样本细胞核内的DNA靶序列杂交，从而获得细胞核内染色体或基因状态信息。
未来的FISH技术也将结合“芯片实验室”微流控芯片技术与自动化FISH检测设备，将极大地拓展荧光原位杂交技术的应用。
本文主要讨论了FISH技术的技术特点进行总结，以及综述了近年来的主要技术进展和应用情况。
【关键词】荧光原位杂交技术现状应用前景一、荧光原位杂交技术及标记物的选择在FISH技术未成熟之前，放射性核素探针被常用于检测染色体DNA基因是否发生突变，由于放射性核素探针法操作复杂、探针不稳定、且涉及放射性同位素，同位素标记法一直没有得到有效的进展。
随后FISH技术日益成熟，也广泛用于医学细胞诊断中，相对于前者来说，FISH具有稳定性好、操作安全、结果迅速、空间定位准确、干扰信号少，通过一张玻片可以标记多种颜色探针等优点。
在FISH技术中，荧光标记物作为一个重要的载体在医学诊断、药物筛选等领域有着广泛的应用。
人们利用荧光标记的多肽来检测目标蛋白的活性，并将其发展的活性筛选方法应用于疾病治疗靶点蛋白的药物筛选。
在科研和临床试验中，荧光染料基本涉及从紫外光、可见光、红外等整个光谱。
由于灵敏度高，操作方便的荧光染料，渐渐取代了放射性同位素作为标记物，广泛应用于荧光免疫、探针以及细胞染色等。
例如，我们常见的核酸染料，可作为背景对照，诸如我们常见的DAPI就是一种能够与DNA强力结合的荧光染料。
荧光探针标记物有荧光染料、生物素、稀土金属等类别。
其中，生物素与其他荧光标记物相比，具有安全可靠、价格低廉等优点。
二、荧光标记技术与方法荧光探针标记物技术有缺口平移标记法、PCR标记法、DNA纤维技术等多种方法。
采取的技术有多元荧光原位杂交技术、比较基因组杂交技术等技术。
荧光原位杂交技术及其在植物学中的应用现状
荧光原位杂交技术及其在植物学中的应用现状荧光原位杂交是Langer在1982由原位杂交改善而来[1]，其基本原理为：根据核苷酸碱基互补配对原则，使荧光标记的探针序列与靶DNA序列进行杂交，然后用合适的检测方法将荧光信号检出，达到基因定位的目的。
因其具有灵敏度高、特异性强、定位准确、快速有效、安全直观等特点而被应用于很多领域。
自从1985年Raybm[2]首次将原位杂交技术应用于植物染色体研究后该技术便在植物学研究中得到了广泛的应用。
1 荧光原位杂交技术的发展与改进荧光原位杂交是在放射性同位素原位杂交的基础上改进而来的，Manning等[3]在1975年最早用非放射性的生物素通过细胞色素C与RNA分子链接，开创了非放射性标记，Rudkin等1977年在放射性同位素标记的基础上发明了用间接免疫荧光法检测目的DNA的非同位素原位杂交技术，Langer等在1982年成功地实现了首例用生物素标记探针的原位杂交，自此荧光原位杂交技术真正建立并不断发展改进。
随着分子生物学技术的发展，FISH技术还衍生出了引物原位标记、间期核FISH、染色体原位抑制技术等，并且还发展出M- FISH、3D-FISH、Rx-FISH技术、CGH 以及近年来微阵列技术等这些更为完善的FISH技术。
1.1 FISH中探针的发展改进特异探针序列的正确选择是FISH技术中的一个关键，随着FISH技术发展，针对不同的研究对象和目的，探针的类型也有了许多改进，主要有以下几种：1）染色体特异重复序列探针：rDNA、端粒、着丝粒以及类似于α卫星、卫星Ⅲ等重复序列上重复元件可达106拷贝数，其杂交靶位点大于1Mb，杂交信号易于检测，常用于检测非整倍体；2）基因组探针：高等动物基因组DNA除过很小一部分的编码序列外有一些高频率的重复序列，进化上的保守性使其具有物种特异性，作为探针，可分析多倍体的起源、进化、基因组成等；3）单拷贝序列探针：针对靶片段中的单拷贝序列而选择的此类探针，通常是某个基因的DNA克隆、RFLP或RAPD标记或是用大的插入片段；4）染色体文库探针：此类探针由从基因组文库中的一条染色体或某一区域核酸片段组成，片段较小，因此被破坏的可能性小。
微生物荧光原位杂交实验技术
微生物荧光原位杂交实验技术背景微生物荧光原位杂交实验技术是在原位杂交技术的基础上发展而来的。
原位杂交技术最早应用于染色体分析，后来逐渐应用于微生物检测领域。
随着荧光标记技术的不断发展，人们开始利用荧光标记探针进行原位杂交，从而提高了检测的灵敏度和特异性。
原理微生物荧光原位杂交实验技术的原理是利用特定的荧光标记探针与细胞中的微生物进行杂交，从而将微生物定性和定量地检测出来。
该技术的基本原理是碱基互补配对原则，即探针的序列与待测微生物的序列互补，从而形成稳定的杂交双链。
利用荧光检测仪器检测荧光信号，从而实现对微生物的定量和定位分析。
实验方法样品的制备：将待测样品进行处理，使微生物细胞分离并保持活性。
探针的制备：将特定的DNA或RNA片段进行标记，形成荧光探针。
杂交反应：将样品和探针在一定条件下进行杂交反应，形成杂交双链。
洗涤和干燥：去除未结合的探针和杂质，保持杂交信号的特异性。
荧光检测：利用荧光检测仪器检测样品的荧光信号，并对数据进行处理和分析。
实验结果通过微生物荧光原位杂交实验技术，我们可以得到样品的定性和定量数据。
实验的成功率较高，特异性较强，能够清晰地检测出目标微生物的存在和数量。
该技术的灵敏度较高，可以检测出低拷贝数的微生物基因，为研究提供了有力的工具。
实验讨论微生物荧光原位杂交实验技术具有许多优势，如高特异性、高灵敏度和能够保持细胞结构的完整性等。
然而，该技术也存在一些不足之处，如探针制备过程较为繁琐、杂交反应条件要求较高以及荧光检测仪器价格昂贵等。
荧光探针的稳定性也可能影响实验结果的可靠性。
因此，在应用该技术时需要注意这些因素，并选择合适的探针和实验条件，以保证实验结果的准确性和可靠性。
结论微生物荧光原位杂交实验技术在研究领域具有广泛的应用前景。
除了在微生物检测方面的应用，该技术还可以应用于其他领域，如基因表达分析、细胞凋亡研究等。
虽然该技术存在一些不足之处，但随着技术的不断发展和优化，相信未来会有更多的应用前景等待着我们去探索和发现。
荧光原位杂交
荧光原位杂交荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization，FISH）是一种分子生物学技术，可以用来检测DNA或RNA序列的存在、位置和数量。
该技术通常使用荧光染料标记DNA或RNA的探针来识别特定的序列。
在荧光原位杂交中，常常使用单链DNA或RNA的Oligonucleotide探针。
探针的序列与待检测样品中的特定DNA或RNA序列互相互补，使得探针和样品DNA或RNA序列可以杂交在一起。
探针可以被标记成许多不同的荧光染料，如荧光素、罗丹明等，以使得检测到的探针可根据颜色进行区分。
荧光原位杂交过程包括以下步骤：1. 选择合适的探针。
选择的探针实际上就是一个人工合成的核酸分子，其长度在20-200bp不等，可以与靶序列DNA或RNA中的任意位置相互匹配，检测的种类也包括基因、病毒、染色体等。
2. 标记探针。
标记探针是指把荧光染料等标记物与探针进行化学共价修饰，使之形成标记的探针，标记的探针使用单染色荧光或双染色荧光。
3. 处理样品。
把检测样品进行前处理、处理固定等。
4. 杂交。
把标记的探针打入处理好的样品中，如细胞、组织、染色体等，探针就会与相应的靶分子发生杂交，然后把样品用适当的盐洗。
5. 检测结果。
通过荧光显微镜进行探针的显示，可以看到细胞核内亮相区域，确定靶序列的定位和相应的染色体编号，并可以通过比较实验组和对照组的信号强度，得到目标序列的数量和比例。
荧光原位杂交在基因检测、疾病诊断、癌症诊断和治疗中都有广泛应用。
在基因诊断中，荧光原位杂交可以检测微观缺失、染色体重排列和染色体数目异常等，具有高准确度、高敏感度、高特异性和可显性等特点。
在肿瘤诊断和治疗中，荧光原位杂交是一种高效而准确的技术，可以评估患者的病情、选择合适的治疗方案，预测预后。
因此，荧光原位杂交在生命科学研究和医学诊断中的应用前景非常广阔。
2024荧光原位杂交技术在血液肿瘤中的应用规范(全文)
2024荧光原位杂交技术在血液肿瘤中的应用规范（全文）荧光原位杂交（FISH）技术是基于碱基互补配对原则，利用荧光标记的核酸探针，对待测标本DNA序列进行定位、定性和定量分析的技术，是遗传学异常的主要检测手段之一。
相较于核型分析，FISH技术具有快速、灵敏度高及特异性强的优势，是血液肿瘤诊断和预后判定的重要手段。
为进一步规范FISH技术在血液肿瘤中的应用，中国抗癌协会血液病转化医学专业委员会、中国老年医学学会病理学分会及中华医学会血液学分会组织国内血液学、病理学和检验学专家，制定了FISH 在血液肿瘤中的应用规范。
1 FISH在血液肿瘤诊疗中的应用价值1.1 诊断分型遗传学改变是血液肿瘤诊断分型的主要依据。
急性白血病（AL）、慢性粒细胞白血病（CML）、伴嗜酸粒细胞增多和酪氨酸激酶基因融合的髓系/淋系肿瘤（MLN-TK）、骨髓增生异常综合征（MDS）、大B 细胞淋巴瘤、滤泡淋巴瘤（FL）、套细胞淋巴瘤（MCL）、伯基特淋巴瘤（BL）、边缘区淋巴瘤（MZL）、间变大细胞淋巴瘤（ALCL）、T幼淋巴细胞白血病（T-PLL）等均需要借助FISH检测关键的遗传学异常才能精准分型。
1.2 预后分层目前针对急性髓系白血病（AML）、急性淋巴细胞白血病（ALL）、MDS、慢性淋巴细胞白血病（CLL）、原发性骨髓纤维化（PMF）、多发性骨髓瘤（MM）等血液肿瘤，世界卫生组织（WHO）、美国国立综合癌症网络（NCCN）指南已提出了基于遗传学异常的预后分层/评分体系。
FISH检测在血液肿瘤的预后评估中发挥着不可替代的作用。
1.3 指导治疗CML患者中费城染色体（Ph染色体）或BCR：：ABL1融合基因的发现开启了酪氨酸激酶抑制剂（TKI）靶向治疗的新时代。
此外，针对PML：：RARA融合基因或其他RARA重排的全反式维甲酸和砷剂、ABL信号通路（ABL1、ABL2、PDGFRA、PDGFRB重排）的TKI药物、JAK-STAT信号通路（CRLF2、JAK1/2/3重排）的JAK抑制剂、FLT3重排的FLT3抑制剂、ALK重排的ALK抑制剂等均已正式应用于临床治疗或处于临床试验阶段。
荧光原位杂技技术和其临床应用
荧光原位杂技技术和其临床应用
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杂交前预处理
将玻片于2 × SSC 溶液中浸泡10min，然 后放入0.1MHCl 浸泡10min，再放入2 × SSC 溶液中浸泡5min，然后放入预热到37℃ 0. 01MHCl( 放入玻片前， 0. 01MHCl 中预先 加入20mg /ml 胃蛋白酶160μl) 中消化8 ～ 10min，经过2 × SSC 溶液再次浸泡5min 后， 用70%、85%、100%乙醇中梯度脱水，每次 3min，自然晾干， 56℃烤片2min。
荧光原位杂技技术和其临床应用
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FISH产前诊疗技术临床应用价值
正常情况下羊水失败率约为0.5%， 超出妊娠 24 周后培养失败率升至10%。FISH 检测成功率 年后陆续有大样本研究报道了较为一致成功率， 约为95%～98％。后伴随商品化探针上市，操作 程序规范化后失败率大大降低。传统核型分析最 少需要15 mL 羊水标本，而FISH 只需3～5 mL 羊水。
DAPI 染色和荧光镜检: 每片加DAPI 10μl，盖上盖玻片，染色15 ～ 20min，结果用 荧光显微镜观察，选择背景洁净、杂交信号清楚 形态圆形或近于圆形细胞记数，并照像。
荧光原位杂技技术和其临床应用
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临床试验中FISH 结果判别
每张羊水玻片最少计数50 个细胞，判断 标准为: 若正常细胞数≥90% 则判为正常，若 异常细胞数≥60% 则判为异常，若异常细胞数 大于15%而且小于60%，则需要重新检测并加 倍计数到100 以上。
荧光原位杂技技术和其临床应用
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标本变性
分别置于－ 20℃70%、85%、 100% 冰乙醇中各脱水各3min，自然晾干， 45 ～ 50℃烤片。
染色体荧光原位杂交技术
1.2 探针和染色体的杂交
• 染色体原位杂交：标记后的探针经变性后．加于变性的 中期染色体分裂相标本上。于37摄氏度、50％的甲酰胺 2XSSC条件下进行杂交．最适的杂交条件主要取决于探 针与靶基因的性质。对于单拷贝基因的杂交，特别是较 长的来自基因组的序列，一般在杂交之前应进行预复性 过程，标记的探针与过量的基因组DNA或Cot－1重复序 列一起孵育1小时，使探针中非特异的重复序列被封闭。 从而抑制该部分探针与染色体之间发生非特异性杂交， 上述过程又称为抑制性染色体原位杂交。经预复性之后 已标记好的变性探针(200一500bP)再与变性的染色体在 含有甲酰胺，盐和醋酸葡聚糖的杂交缓冲液中杂交过夜。 接着是柔和的洗涤，以去除未杂交或错配对的探针。
• （2）间接标记法：常用的间接法是将一些 类似于半抗原(hapten)的标记分子掺入探针 分子中。用的较多的试剂有生物素，地谷新 (digoxigenin)，二硝基苯(dinitrophenyl， DNP)，氨基乙酰茐(aminoacetylfuorene， AAF)，汞和磺酸盐(sulfonate)。就掺入方式 来说，生物素，地谷新等是以核苷酸衍生物 的形式掺入的，可用切口平移法来进行。现 在更多的人开始用随机引物法。用这两种方 法标记好的探针大小在200一500bp范围内， 是用于杂交的最佳大小。另外，也可以在已 知顺序的两个引物之间用PCR法来扩增，或 从合适的载体上通过RNA转录而来。
• 荧光标记的染色体原位杂交技术提供了一种快速而有 效的手段，将DNA片段和特定的真核生物细胞的染色 体区带联系了起来，并将这些DNA片段排序，这是研 究DNA顺序在染色体上位置的最直接的方法。最早， 人们根据Gall和Pardue在1969年的工作，于70年代， 建立起了同位素原位杂交技术，但当时只是用于DNA 顺序在多线染色体上的定位或是重复顺序在中期染色 体上的定位。1981，Gerhard和Harper等首先证明有 可能将从个体基因中得到的单拷贝顺序(SCP，single copy probe)通过同位素原位杂交技术定位到中期染色 体上。在此基础上，80年代初起，荧光标记的原位杂 交技术开始起步并得到运用且不断地发展起来。
荧光原位杂交实验具体步骤及详细说明
荧光原位杂交实验具体步骤及详细说明用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。
由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。
1. 探针变性将探针在75℃恒温水浴中温育5 min，立即置0℃，5～10 min，使双链DNA探针变性。
2. 标本变性（1）将制备好的染色体玻片标本于50℃培养箱中烤片2～3 h。
（经Giemsa 染色的标本需预先在固定液中退色后再烤片）。
（2）取出玻片标本，将其浸在70～75℃的体积分数70% 甲酰胺/2x SSC的变性液中变性2～3 min。
（3）立即按顺序将标本经体积分数70%、体积分数90%和体积分数100%冰乙醇系列脱水，每次5 min，然后空气干燥。
3. 杂交将已变性或预退火的DNA探针10 uL 滴于已变性并脱水的玻片标本上，盖上18x18盖玻片，用Parafilm封片，置于潮湿暗盒中37℃杂交过夜（约15～17 h）。
由于杂交液较少，而且杂交温度较高，持续时间又长，因此为了保持标本的湿润状态，此过程在湿盒中进行。
4. 洗脱此步骤有助于除去非特异性结合的探针，从而降低本底。
（1）杂交次日，将标本从37℃温箱中取出，用刀片轻轻将盖玻片揭掉。
（2）将已杂交的玻片标本放置于已预热42～50℃的体积分数50%甲酰胺/2xSSC中洗涤3次，每次5 min。
（3）在已预热42～50℃的1xSSC中洗涤3次，每次5 min。
（4）在室温下，将玻片标本于2xSSC中轻洗一下。
（5）取出玻片，自然干燥。
（6）取200 uL复染溶液（PI/antifade或DAPI/antifade染液）滴加在玻片标本上，盖上盖玻片。
5. 杂交信号的放大（适用于使用生物素标记的探针）（1）在玻片的杂交部位加150 uL封闭液I，用保鲜膜覆盖，37℃温育20min。
荧光原位杂交技术(fish)的基本原理和应用_理论说明
荧光原位杂交技术(fish)的基本原理和应用理论说明1. 引言1.1 概述荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ Hybridization，简称FISH）是一种广泛应用于生物学研究的重要技术。
它通过在细胞或组织水平上定位和检测特定DNA或RNA序列的分布情况，可以提供关于基因组结构、功能和表达的有价值信息。
该技术最早于20世纪80年代被开发出来，并且经过不断改进与扩展，如今已成为分子生物学研究中不可或缺的工具之一。
1.2 文章结构本文将首先介绍荧光原位杂交技术的基本原理，包括DNA探针的选择与设计、杂交反应条件的优化以及检测与可视化方法。
然后，我们将深入探讨荧光原位杂交技术在生物医学研究领域、植物遗传研究领域和动物进化研究领域的应用实例。
接下来，我们将评述荧光原位杂交技术的优势与局限性，包括其高灵敏度、高分辨率等优势以及对样本处理要求高、无法确定基因功能等局限性。
最后，我们将给出结论并展望荧光原位杂交技术的未来发展方向。
1.3 目的本文的目的是系统地介绍荧光原位杂交技术的基本原理和应用领域，以帮助读者深入了解这一重要技术。
通过阅读本文，读者将能够全面了解荧光原位杂交技术在生物学研究中的作用和意义，并对该技术的优势与局限性有所了解。
此外，本文也将探讨该技术未来可能的发展方向，为读者提供展望与思考。
2. 荧光原位杂交技术基本原理:2.1 DNA探针的选择与设计:荧光原位杂交技术（FISH）是一种利用DNA或RNA分子作为探针，通过特异性互补配对识别和定位目标序列的方法。
在进行FISH实验时，首先需要选择合适的DNA探针。
DNA探针通常由由人工合成的寡聚核苷酸（oligonucleotide）或从天然来源提取得到的全长DNA片段构建而成。
选择DNA探针时，需要考虑以下因素：首先是目标序列的特异性，即该序列在待检测样品中是否具有较高的丰度，并且只存在于感兴趣的目标区域中。
其次是探针长度和两个主要互补区域之间核苷酸序列的碱基组成比例。
荧光原位杂交-更新
荧光原位杂交-更新荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization，FISH）是一种基于DNA分子杂交技术，可以用于研究细胞核内DNA序列的空间分布，基因表达与功能等问题的一种重要方法。
相比于传统的DNA杂交方法，荧光原位杂交具有高灵敏度、高特异度、高分辨率、无需PCR扩增等优点，被广泛应用于在形态学及遗传水平对真核生物的相关研究。
本文将介绍荧光原位杂交的原理、方法和应用。
一、原理荧光原位杂交的原理是利用标记有荧光染料（如荧光素、rhodamine等）的DNA探针与待检测样品（常为细胞核、染色体、tissue或者section等）中的目标DNA特异性结合，形成稳定的探针-靶DNA杂交物，通过检测荧光发射信号的方法来确定目标DNA序列的位置和数量。
探针的设计是荧光原位杂交成功的关键，因为它们必须具有真确的互补性，绑定到目标DNA的特定区域上。
如何选择探针的特异性，通常取决于所要研究的问题，例如检测某一基因的副本数，探测非编码RNA，或发现肿瘤细胞中的染色体异常等。
二、方法1. 获取样品荧光原位杂交技术所需的样品通常以细胞核或组织切片的形式存在，依据所要研究的问题，通过相应方法处理，如：细胞核的分离、组织的固定剂的处理、剪切不同的组织块、制备Paraffin等经典样品处理方法。
2. 样品前处理对于切片和细胞各种杂质如化学物质、染料、蛋白质等的影响，靠的是样本的处理方法。
主要有以下几种：1) 催化游离的核酸：这一步的主要目的是去除待测样品中的核酸，包括double-stranded 的DNA和single-stranded的RNA。
当使用非常规杂交试剂或非常规探针（如bacterial artificial chromosome、cosmid probe）时，可能需要使用一些高效的去掉毛糙杂质的试剂。
2) 前处理（预处理）：固定、脱水、变性、去除RNA、去除单链DNA（ssDNA）、吉姆萨染色、荧光染色、脱色剂去除等多项操作。
原位荧光杂交操作规程(3篇)
第1篇一、目的原位荧光杂交技术是一种在细胞或组织切片上进行DNA或RNA定位的方法，通过对特定序列的DNA或RNA进行标记，从而实现对特定基因或染色体的定位和定量分析。
本规程旨在规范原位荧光杂交操作，确保实验结果的准确性和可靠性。
二、适用范围本规程适用于所有原位荧光杂交实验，包括细胞原位杂交、组织切片原位杂交等。
三、材料与设备1. 材料：- 标本：细胞或组织切片- 探针：标记有荧光染料的DNA或RNA探针- 酶标抗体：针对探针标记的荧光染料- 洗涤液：如磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）- 抗荧光抗体：用于检测酶标抗体- 封片剂：如甘油封片剂2. 设备：- 荧光显微镜- 原位杂交仪- 热循环仪- 高速离心机- 显微镜载物台- 离心管- 移液器四、操作步骤1. 标本制备：- 将细胞或组织切片固定在载玻片上，进行脱水和透明处理。
- 将载玻片放入烘箱中，进行烘烤，使切片紧密贴合在载玻片上。
2. 探针制备：- 将探针进行变性，使其单链化。
- 将变性后的探针与标记有荧光染料的探针混合，进行杂交反应。
3. 杂交反应：- 将杂交混合物滴加在载玻片上的标本上，用封片剂封口。
- 将载玻片放入原位杂交仪中，进行杂交反应。
4. 洗涤：- 将杂交后的载玻片放入洗涤液中，进行洗涤。
- 洗涤过程中，注意轻柔操作，避免破坏杂交结构。
5. 酶标抗体反应：- 将酶标抗体滴加在载玻片上的杂交结构上，进行抗体结合反应。
- 将载玻片放入原位杂交仪中，进行抗体结合反应。
6. 洗涤：- 将抗体结合后的载玻片放入洗涤液中，进行洗涤。
7. 抗荧光抗体反应：- 将抗荧光抗体滴加在载玻片上的杂交结构上，进行荧光抗体结合反应。
- 将载玻片放入原位杂交仪中，进行荧光抗体结合反应。
8. 洗涤：- 将荧光抗体结合后的载玻片放入洗涤液中，进行洗涤。
9. 封片：- 将封片剂滴加在载玻片上的杂交结构上，进行封片。
10. 观察与分析：- 将载玻片放入荧光显微镜中，进行观察和分析。
荧光原位杂交实验具体步骤及方法
荧光原位杂交实验具体步骤及方法荧光原位杂交实验具体步骤及方法用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。
由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。
1. 探针变性将探针在75℃恒温水浴中温育5 min，立即置0℃，5～10 min，使双链DNA探针变性。
2. 标本变性（1）将制备好的染色体玻片标本于50℃培养箱中烤片2～3 h。
（经Giemsa染色的标本需预先在固定液中退色后再烤片）。
（2）取出玻片标本，将其浸在70～75℃的体积分数70% 甲酰胺/2x SSC的变性液中变性2～3 min。
（3）立即按顺序将标本经体积分数70%、体积分数90%和体积分数100%冰乙醇系列脱水，每次5 min，然后空气干燥。
3. 杂交将已变性或预退火的DNA探针10 uL 滴于已变性并脱水的玻片标本上，盖上18x18盖玻片，用Parafilm封片，置于潮湿暗盒中37℃杂交过夜（约15～17 h）。
由于杂交液较少，而且杂交温度较高，持续时间又长，因此为了保持标本的湿润状态，此过程在湿盒中进行。
4. 洗脱此步骤有助于除去非特异性结合的探针，从而降低本底。
（1）杂交次日，将标本从37℃温箱中取出，用刀片轻轻将盖玻片揭掉。
（2）将已杂交的玻片标本放置于已预热42～50℃的体积分数50%甲酰胺/2xSSC中洗涤3次，每次5 min。
（3）在已预热42～50℃的1xSSC中洗涤3次，每次5 min。
（4）在室温下，将玻片标本于2xSSC中轻洗一下。
（5）取出玻片，自然干燥。
（6）取200 uL复染溶液（PI/antifade或DAPI/antifade染液）滴加在玻片标本上，盖上盖玻片。
5. 杂交信号的放大（适用于使用生物素标记的探针）（1）在玻片的杂交部位加150 uL封闭液I，用保鲜膜覆盖，37℃温育20min。
FISH-荧光原位杂交实验原位杂交 实验报告
FISH-荧光原位杂交实验原位杂交实验目的通过实验了解荧光原位杂交技术的基本原理和在生物学、医学领域的应用..掌握原位杂交技术的操作方法;熟练掌握荧光显微镜的使用方法..2. 实验原理荧光原位杂交Fluorescence in situ hybridization FISH是一门新兴的分子细胞遗传学技术;是20世纪80年代末期在原有放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术..目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域..FISH的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针;按照碱基互补的原则;与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合;形成可被检测的杂交双链核酸..由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列;因而可以将探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位..与传统的放射性标记原位杂交相比;荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特性高和可以多重染色等特点;因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注..杂交所用的探针大致可以分为三类：1染色体特异重复序列探针;例如a卫星、卫星III 类的探针;其杂交靶位常大于1Mb;不含散在重复序列;与靶位结合紧密;杂交信号强;易于检测；2全染色体或染色体区域特异性探针;其由一条染色体或染色体上某一区段上极端不同的核苷酸片段所组成;可由克隆到噬菌体和质粒中的染色体特异大片段获得；3特异性位置探针;由一个或几个克隆序列组成..探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法..间接标记是采用生物系标记的dUTPbiotin-dUTP经过缺口平移法进行标记;杂交之后用藕联的荧光素的抗生物系的抗体进行检测;同时还可以利用几轮抗生物素蛋白—荧光素、生物素化的抗—抗生物素蛋白、抗生物素蛋白—荧光素的处理;将荧光信号进行放大;从而可以检测500bp的片段..而直接标记法是将荧光素直接与探针核苷酸蔌磷酸戊糖骨架共价结合;或在缺口平移法标记探针时将荧光素核苷三磷酸掺入..直接标记法在检测时步骤简单;但由于不能进行信号放大;因此灵敏度不如间接标记的方法..3. 实验用具及材料Y染色体探针、人外周血中期染色体细胞标本、恒温水浴锅、培养箱、染色缸、载玻片、Nikon E-400、荧光显微镜、盖玻片、封口膜、200mL移液器、20mL移液器、暗盒、指甲油、甲酰胺、氯化钠、柠檬酸钠、氢氧化钠、吐温20..4. 实验方法及步骤1探针及标本的变性1探针变性将探针在75℃怛温水浴中温育5min;立即置0℃;5～10min;使双链DNA探针变性..2标本变性①将制备好的染色体玻片标本于50℃培养箱中烤片2～3h..经Giemsa染色的标本需预先在固定液中退色后再烤片..②取出玻片标本;将其浸在70～75℃的体积分数70%甲酰胺/2×SSC的变性液中变性2～3min..③立即按顺序将标本经体积分数70%、体积分数90%和体积分数100%冰乙醇系列脱水;每次5min;然后空气干燥..2杂交将已变性或预退火的DNA探针10mL滴于已变性并脱水的玻片标本上;盖上18×18盖玻片;用Parafilm封片;置于源潮湿暗盒中37℃要交过夜约15～17h..由于杂交液较少;而且杂交温度较高;持续时间又长;因此为了保持标本的湿润状态;此过程在湿盒中进行..3洗脱此步骤有助于除去非特异性结合的探针;从而降低本底..1杂交次日;将标本从37℃温箱中取出;用刀片轻轻将盖玻片揭掉..2将已杂交的玻片标本放置于已预热42～50℃的体积分数50%甲酰胺/2×SSC中洗涤3次;每次5min..3在已预热42～50℃的1×SSC中洗涤3次;每次5min..4在室温下;将玻片标本2×SSC中轻洗一下..4杂交信号的放大1在玻片的杂交部位加150mL封闭液I;用保鲜膜覆盖;37℃温育20min..2去掉保鲜膜;再加150mL avidin-FITC于标本上;用保鲜膜覆盖;37℃继续温育40min..3取出标本;将其放入已预热42～50℃的洗脱液中洗涤3次;每次5min..4在玻片标本的杂交部位加150mL封闭液II;覆盖保鲜膜;37℃温育20min..5去掉保鲜膜;加150mL antiavidin于标本上;覆盖新的保鲜膜;37℃温育40min..6取出标本;将其放入已预热42～50℃的新洗脱液中;洗涤3次;每次5min..7重复步骤1、2、3;再于2×SSC中室温清洗一下..8取出玻片;自然干燥..9取200mL PI/antifade染液滴加在玻片标本上;盖上盖玻片..5封片可采用不同类型的封片液..如果封片中不含有Mowiol可使封片液产生自封闭作用;为防止盖片与载片之间的溶液挥发;可使用指甲油将盖片周围封闭..封好的玻片标本可以在-20～-70℃的冰箱中的暗盒中保持数月之久..6荧光显微镜观察FISH结果先在可见光源下找到具有细胞分裂相的视野;然后打开荧光激发光源;FITC的激发波长为490nm..细胞被PI染成红色;而经FITC标记的探针的探针所在位置发出绿色荧光..由于本实验使用的是Y染色体上的特异序列;因此在男性外周血染色体标本的杂交中呈阳性;即使在末分裂的细胞中;也可以观察到明显的杂交信号..照相记录实验结果图16-1..附录I FISH相关溶液的配制120×SSC：175.3g NaCl; 882.g柠檬酸钠;加水至1000mL用10mol/L NaOH调pH至7.0..2去离子甲酰胺DF：将10g混合床离子交换树脂加入100mL甲酰胺中..电磁搅拌30min;用Whatmanl号滤纸过滤..3体积分数70%甲酰胺/2×SSC：35mL甲酰胺;5mL 20×SSC;10mL水..4体积分数50%甲酰胺/2×SSC：100mL甲酰胺;20mL 20×SSC;80mL水..5体积分数50%硫酸葡聚糖DS：65℃水浴中融化;4℃或-20℃保存..6杂交液：8mL体积分数25%DS; 20mL 20×SSC混合..或40mL体积分数50%DS;20mL20×SSC;40mL ddH2O混合取上述混合液50mL;与5mL DF混合即成..其终浓度为体积分数10% DS 2×SSC;体积分数50% DF..7 PI/antifade溶液PI原液：先以双蒸水配置溶液;浓度为100mg/mL;取出1mL;加39mL双蒸水;使终浓度为2.5mg /mL..Antifade原液：以PBS缓冲液配制该溶液;使其浓度为10mg/mL;用0.5mmol/L的NaHCO3调pH值为8.0..取上述溶液1mL;加9mL甘油;混匀..PI/antifade溶液：PI与antifade原液按体积比1：9比例充分混匀;-20℃保存备用..8DAPI/antifade溶液：用去离子水配制1mL/mg DAPI储存液;按体积比1:300;以antifade溶液稀释成工作液..9封闭液I：体积分数5% BSA 3mL;20×SSC 1mL;dd H2O 1mL; Tween 20 5mL混合..10封闭液II：体积分数5% BSA 3mL;20×SSC 1mL;goat serum 250mL; dd H2O 750mL; Tween 20 5mL混合..11荧光检测试剂稀释液：体积分数5% BSA 1mL;20×SSC 1mL;dd H2O 3mL; Tween 20 5mL 混合..12洗脱液：100mL 20×SSC;加水于500mL;加Tween20 500 mL..13TE缓冲液：pH8.0: 10mmol/L Tris; HCl; 1mmol/L EDTA；pH7.6: 10mmol/L Tris; HCl; 1mmol/L EDTA；pH7.4: 10mmol/L Tris; HCl; 1mmol/L EDTA..14溶液I：25mmol/L Tris HClpH 7.4; 10mmol/L EDTA..15溶液II：10% SDS;0.2M NaOH..16溶液III：Kac 14.7g; HAc 5.8mL; 加水至50mL..17LB培养基：胰化蛋白胨10g;酵母提取物5g; NaCl 10g; 加水至1000mL;用5mmol/L NaOH 调pH值至7.0..附录II DNA探针的制备质粒DNA克隆的提取、纯化和鉴定..1用接种环挑取一小块-70℃冻存的转化菌;接种于5mL LB培养基中;37℃剧烈震荡过夜..2将收集到的菌液3000r/min离心10min;弃掉上清液..3向菌体沉淀中加入溶液I300mL; 溶液II 350mL;混匀后将其置于冰浴中片刻;再加溶液III 350mL混匀;加酚和氯仿混合液体积比为1：1500mL 后充分混匀..412000r/min离心10min..5取上清液;向其加入600mL异丙醇;充分混匀后以12000r/min离心15～30min;弃掉上清液..6用1500mL体积分数70%乙醇洗涤沉淀2～3次;晾干..7用TE缓冲液溶解DNA沉淀..8加水至200mL;以Rnase A终浓度200mg /mL在50℃水浴中消化30min..9加入酚、氯仿和异丙醇三者体积比25：24：1溶液200mL混匀;12000r/min离心2min..10取上清液;再加入氯仿和异戊醇溶液体积比为24：1200mL混匀;12000r/min离心2min..11取上清液;以20mL 3M NaAc及500mL体积分数100%乙醇沉淀DNA..12可将上述溶液在-70℃放置30min至1h以充分沉淀DNA;然后用12000r/min离心15min..13将沉淀用1.5mL体积分数70%乙醇轻洗;自然晾干..14用TE缓冲液溶解DNA..15取1～2mL上述纯化的DNA溶液;于8.0g/L琼脂糖/TBE缓冲液凝胶电泳鉴定DNA并检测浓度..16取1mg DNA;用相应限制性内切酶4～5单位;BSA100～200mg /mL;于37℃水浴中酶解2～4h..17电泳观察;根据酶切片段数量及大小;估计DNA克隆插入片段大小..附录III 探针的生物素标记探针的标记可采用PCR或缺口平移法来制备;但多数情况下采用缺口平移法来制备..该过程包括以DNase I在DNA双链上作用产生缺口并以此作为第二反应步骤的作用赳噗;即大肠杆菌聚合酶I自缺口处进行修补合成..在修补合成互补链时将生物素标记的d-NTP掺入;从而复制出带有生物素标记的探针..本实验采用缺口平移法;按GIBCO公司提供的方法以biotin-14-dATP标记探针..标记好的探针可以在-20℃下长期保存..总反映体积50mL; DNA 1mg;10×dNTP 5mL; 10×Enzyme Mix 5mL..其中10×dNTP为：500mmol/L Tris·HClpH 7.850mmol/L MgCl2100mmol/Lβ-硫基乙醇100mg /ml去除核酸酶的牛血清白蛋白0.2mmol/L dCTP; 0.2mmol/L dGTP; 0.2mmol/L dTTP0.1mmol/L dATP; 0.1mmol/L biotin-14-dATP10×酶混合为：0.5units/mL DNA聚合酶I0.075untis/mL Dnase I50mmol/L Tris·HClpH 7.55mmol/L醋酸镁1mmol/L β-硫基乙醇0.1mmol/L苯甲基磺酰氟体积分数50%甘油100mg /mL牛血清白蛋白将上述混合液于16℃作用1h..用8.0g/L琼脂糖/TBE缓冲液凝胶电检测标记产物..以DNA片段长约300～500bp为宜..如片段较大;则应加适量Dnase I继续酶切;直至DNA片段长度适中后;加5mL终止缓冲液300mmol/L EDTA终止反应..用乙醇沉淀的方法将探针与非掺入的核苷酸分开..一、荧光原位杂交FISH是一种简单、敏感、而容易操作的方法;结果迅速;并能在同一标本上检测多个不同的基因;可应用于细胞培养、染色体分裂像、冰冻切片和石蜡切片..FISH技术是利用特异的DNA探针;标记了生物素;地高辛、或荧光素;对检测细胞进行DNA-DNA原位杂交;并用荧光法显示..FISH实验步骤试剂配制：1变性液70%甲酰胺+ 2×SSC;pH7.0：4 ml 20×SSC；8 ml 蒸馏水；28 ml 甲酰胺..每次新鲜配制..2杂交后洗涤液：20×SSC 4 ml；蒸馏水16 ml；甲酰胺20 ml..每次新鲜配制..调节pH前升至室温..1. 用硅化玻片;石蜡切片;60℃烤片过夜..二甲苯脱蜡至酒精;斜置切片;空气中干燥..2. 蛋白酶处理：1每个染色缸40 ml 蛋白酶K消化溶液;配制方法如下：2×SSC 40 ml 倒入Facal管;在水浴槽中预热..将消化酶液加入管内;摇动直到酶溶解..2 37℃水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液..37℃孵育20 min..3 2×SSC在室温下漂洗切片3次;每次1 min..4梯度酒精脱水-20℃预冷;空气中干燥..3. 变性：1每一个立式染色缸配制40 ml 变性溶液；278℃水浴槽中平衡预热混合液染色缸；378℃孵育8 min；4 即移入-20℃预冷70%酒精的染色缸内2 min;再依次移入80%、90%和100%的-20℃预冷酒精内;每缸2 min；5空气干燥..4. 杂交：1准备探针；2取一个较大的湿盒;交叉放置切片；3滴10 μl 探针在切片的组织上;加盖玻片；4盖上湿盒盖;37℃孵育12~16 h..杂交后水洗：5镊子小心去除盖玻片；643℃预热杂交后水洗溶液40 ml 水洗切片15 min；72×SSC37℃洗两次;每次10 min；8切片放人染色缸的1×PBS内待检测;勿使切片干燥..检测：9从1×PBS中取出切片;除去过多的水分;避免标本干燥..把切片放入湿盒内;同时处理4张切片..10每张切片使用30~60 μl 罗丹明抗-地高辛抗体或FITC卵白素;室温下孵育20 min；11去掉塑料盖膜;把切片放入含1×PBS的染色缸..1×PBS室温下洗3次;每次2 min..扩增：12从1×PBS中取出切片;斜置切片使液体排出；13每张切片滴30~60 μl 抗-卵白素抗体;加塑料盖膜;室温孵育20 min；14去掉塑料盖膜;把切片放入含1×PBS的染色缸..1×PBS室温下洗3次;每次2 min；15从1×PBS中取出切片;斜置切片使液体排出；16每张切片滴30~60 μl 抗-卵白素抗体;加塑料盖膜;室温孵育20 min；171×PBS室温下洗3次;每次2 min..5. 细胞核染色：1张切片加10~20 μl DAPI;覆盖盖玻片并在室温下孵育2~5 ml；2尽可能快的在荧光显微镜下观察或封闭盒内保存在-20℃冰箱..切片在染色之后1h内可以在显微镜下观察..二、用引物介导的原位标记PRINS是PCR和荧光原位杂交FISH的结合; PRINS是由未标记的序列特异性寡核苷酸探针与固定在细胞内的靶DNA互补序列;在聚合酶的驱动下;带有标记的脱氧核苷酸FITC-dUTP或半抗原-dUTP和dATP、dCTP、dGTP的延伸;依赖标记;新合成的DNA就能直接的或间接的带有FITC;用荧光显微镜观察..PRINS实验步骤1. 常规脱蜡浸入0.01 mol/L PBS；2. 用0.2 mol/L 盐酸处理5min；3. 蛋白酶K25 μg/ml消化37℃15 min；4. 分别用80%;95%和100%酒精脱水;室温干片；5. 加PCR混合液25 μL10 mmol/L Tris-HCl;50 mmol/L KCl;1.5 mmol/L MgCl2;各加200 μmol/L dATP;dCTP;dGTP;1.5 mmol/L dig-11-dUTP 1.5 μl;引物250 ng;Taq DNA 聚合酶2 U;加盖片；6. 94℃变性5 min后置入65℃湿盒中5 min；7. 用0.1×SSC液;65℃洗5 min；8. 片于65℃10~20 s；用4×SSC-0.1%吐温20液42℃洗5 min;2次；9. 经Buffer 1液洗后滴加20%羊血清封闭30 min；10. 加地高辛抗体复合物1：500室温下2 h；11. BufferⅢ液洗5 min；12. 用BCIP-NBT显色1~2 h;在镜下控制;终止显色；13. 用中性红或核固红衬染;酒精脱水;二甲苯透明;树脂封片..。
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常用探针类型 — 重复序列探针
重复序列探针的结合位点是基因组中多拷 贝的短重复碱基对序列（例如着丝粒和端 粒探针）所在的染色体区域。 着丝粒常常是A-T丰富区，而端粒已知含有 TTAGGG序列。由于重复序列相对容易制 备和分辨率较高（0.5Mb），这种FISH被 普遍用于筛查一般的染色体非整倍体、亚 端粒缺失和标记染色体。
杂交流程
a.两要素：
探针和靶序列 b.标记探针
直接标记和间接标记
c.变性 探针和靶序列成为单链 d.混合杂交 e.间接标记探针需连接 荧光基团的步骤
FISH
荧光标记的DNA探针 （200-500bp）
荧光原位杂交特点
与其它原位杂交技术相比，FISH的优点：
①经济安全，快速方便； ②敏感性高，特异性强，背景低； ③宜于多靶杂交，对同一标本同时进行多个探针杂 交，不同的探针可以显示不同的荧光颜色； ④使用G带玻片可作出回顾性分析；
结合技术相关检测项目
染色体病快速产前诊断（FISH、qPCR、 BoBs） 产前单基因病诊断 SNP Array 检测 某些代谢病的产前诊断
项目意义
较羊水染色体分析，FISH技术可以确定13、18、21、X、Y的染色体 数目信息，缓解唐筛阳性患者或高龄孕妇精神负担；缓解医生核型分 析工作压力，能够有针对性的对样本进行处理。
工作基础
探针 商品化探针 原位杂交仪 Luminex xMAP 液相芯片检测平台
工作基础
工作人员 1）项目负责人 刘红卫，男，妇产科实验室技术负责人，毕业 于四川大学生物工程系遗传学专业，临床遗传优 生专业副主任医师，丰富的技术操作和管理能力。 2）项目组成员 赵少志，男，检验师，四川大学华西医院医学 遗传学硕士，中国遗传医学中心、医学遗传学国 家培训中心学员。
几种技术平台比较
技术
产前 BoBs 核型分析 FISH
13, 18, 21 微缺失 三体
解释容易
成本
平台费用
++ ++ +
++ +
++ -
+ -
+ ++ +
QF-PCR
++
--
+
++
--
细胞遗传学技术的比较
FISH相关项目
羊水细胞荧光原位杂交分析（包括未培养 和培养） 血细胞荧光原位杂交分析 其他各类细胞荧光原位杂交分析 SRY等单基因分析 胚胎染色体病诊断（PGD）
WCP探针（SKY）
技术结合—产前BoBS
BACs是人类DNA的长片段克隆序列，典型的150170kbp，相对于短的DNA探针具有更好的信噪比、 不受DNA质量影响、更高的覆盖率。 将BAC DNA探针耦联至Luminex xMAP荧光编码 的微球上，将FISH技术与Luminex技术平台结合， BACs-on-Beads技术可以在同一个微孔内实现多个 FISH探针的检测，相对于同时进行成百上千次FISH 实验。 高通量、标本来源广、快速、结果明确；除了检测 13，18，21，X，Y染色体拷贝数目的变化外，还 可检测9种常见的微缺失综合征。
技术结合 — FQ-PCR
来自于分子生物学技术-定量荧光聚合酶链 反应 和FISH的结合； 对染色体13、18、21、X和Y采用荧光引物 对染色体特异性高度多态性DNA短重复序 列进行PCR扩增，快速诊断非整倍体；特 定的基因引物可以检测基因的缺失与扩增 检测“有”或“无”和数目异常；位置异 常无法判断，如平衡性染色体重排。
缺点：
不能达到100%杂交，特别是在应用较短的 cDNA探针时效率明显下降。
常用探针类型 — 基因特异探针
基因特异探针靶向每条染色体只有一个拷 贝的DNA序列。 主要用于间期或中期染色体中识别染色体 易位、倒位、重复和缺失、邻近基因综合 征、标记染色体和染色体扩增等，可检测 基因的扩增和重排。
21三体FISH
常用探针类型 — WCP探针
全基因组绘画（WCP）探针是一种复合DNA探针。 除着丝粒和端粒区外，全基因组绘画探针对全长 染色体有高度亲和力。这些探针最适用于识别中 期染色体的基因组不平衡，尤其是在许多癌症中 观察到的复杂染色体重排。 M-FISH用特殊选择的窄带滤色片连续捕获5种荧 光色素中的每一种荧光色素图像；SKY用于荧光 色素组合分析的成像设备不同：冷电荷耦合器 (CCD)照相机和Fourier变换光谱法相结合，同步 曝光成像。 这些技术目前在国内一些重点细胞遗传学实验室 中开展。
简
介
原位杂交技术（in situ hybridization，ISH） Gall和 Pardue 1969年建立。 用标记的DNA或RNA作为探针，对组织细胞内的核酸或有 丝分裂中期的染色体进行原位检测和观察。
最初的探针大多以同位素3H、32P等标记，但因同位素标 记探针对人体有放射损害、实验周期长、放射自显影的分 辨率有限、环境污染等缺点，给研究及实际应用带来了诸 多不便。
荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ hybridization ，FISH） 利用荧光物质标记探针（直接或间接），再进行杂交，可 通过荧光显微镜对靶序列进行定性、定位和定量分析
FISH技术的应用已经证实或发现了用经典细胞遗传学方 法无法证实或发现的肿瘤染色体改变，成为衔接细胞遗传 学和分子遗传学之间的一座桥梁。开创了一个新的学科— —分子细胞遗传学。
精品课件！
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1.快速且准确进行检测
FISH对于样本要求比较低，对于羊水量少、羊水活细胞数目少、孕周 偏大、细胞培养失败、核型结果难以判读等各种原因导致的核型分析 失败均可针对性的给予弥补，解决占染色体数目异常的80-90%问题。
2.弥补核型检测失败无报告的问题
3.FISH与羊水染色体核型分析构成较为完整的染色体异常 诊断平台，提高了产科胎儿产前诊断水平。 4.BoBs可检测9种常见的微缺失综合征，拓宽了检测范围。