【专题讨论】超详细包涵体复性常见问题分析
箱涵常见质量通病的防治措施
箱涵常见质量通病的防治措施【知识专栏】标题：探索箱涵常见质量通病的防治措施导读：箱涵作为现代交通工程中常用的结构之一，其质量问题一直备受关注。
本文将深入探讨箱涵常见的质量通病，分析其原因，并提出有效的防治措施，帮助读者更好地理解与应对这些问题。
正文：引言：箱涵是一种供水、供气、排水或通道等需要的地下结构，经常用于城市道路、高速公路、桥梁等工程中。
然而，在箱涵的设计、材料选择、施工等环节中，常会出现质量问题。
本文将以从简到繁、由浅入深的方式，对箱涵常见的质量通病进行全面评估，并提出相应的防治措施。
一、设计问题1. 不合理的结构设计箱涵结构的设计直接决定了其承载能力和使用寿命。
常见的设计问题包括荷载计算不准确、结构设计参数选取不合理等。
解决方法是进行综合考虑，确保设计参数科学可靠，严格按照相关规范进行设计。
2. 忽略地基条件箱涵常常需要埋设于不同地质条件的地基中，如软黏土、砂土等。
若在设计时忽略地基条件，将导致结构不稳定。
必须进行地质勘察、地基设计和加固等工作，以确保箱涵的稳定性。
二、材料问题1. 材料强度不足材料强度不足会导致箱涵结构承载能力不足，增加事故风险。
对此，应严格按照相关标准选取优质材料，并进行合理的结构计算与施工检测，以确保箱涵的安全性与耐久性。
2. 防水材料选用不当作为地下结构，箱涵必须具备良好的防水性能。
然而，一些防水材料的选择不当，使得箱涵容易受到渗水的侵蚀，影响结构的使用寿命。
在设计过程中，应选用高质量的防水材料，并对施工过程中的质量把关，确保其防水效果。
三、施工问题1. 施工工艺不当箱涵施工工艺的不当往往导致结构质量问题，如未按照正确的施工顺序进行，或施工过程中的操作失误等。
在施工前应充分制定施工方案，并由专业施工队伍进行操作，严格按照相关规范要求进行施工，以确保箱涵的质量。
2. 控制质量不严格在施工过程中，材料的质量控制是保证箱涵质量的关键。
如施工中水泥的浇筑比例不正确、搅拌时间不足等，都会影响到结构的强度与稳定性。
(整理)包涵体的分离纯化.
包涵体的纯化和复性总结（二）关于包涵体的纯化是一个令人头疼的问题，包涵体的复性已经成为生物制药的瓶颈，关于包涵体的处理一般包括这么几步：菌体的破碎、包涵体的洗涤、溶解、复性以及纯化，内容比较庞杂一、菌体的裂解1、怎样裂解细菌？细胞的破碎方法1.高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。
此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。
2.玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。
3.超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG 频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施，时间以及超声间歇时间、超声时间可以自己调整，超声完全了菌液应该变清亮，如果不放心可以在显微镜下观察。
对超声波及热敏感的蛋白和核酸应慎用。
4.反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
5.化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好，我用的浓度一般为1mg/ml。
无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且应该在破碎的同时多加几次；另外，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。
软土地基上箱涵设计要点及常见问题分析
２工 程 案例 及 问题 分析 箱 涵通 常 为 钢 筋 混凝 土 洞 身 ，在 软 土地 基 中
采 用 较 多 ，设 计 主 要 包括 如 下 内容 ： 涵顶 覆 土 荷 载 、 车辆 荷 载 、侧 面土 压 力 、地 基 反 力 、地 基 沉 降 、 洞 身结 构 受 力 和 结构 构 造 要 求等 。其 中荷 载 计 算 分析 、结 构 内力计 算 、沉 降计 算 、地 基 反 力 以及 配 筋计 算 最 为 受 到重 视 。而 对 处 于地 层 变 化 较 大 、荷 载 变 化 较 大 、处 在 填 挖 交 界 处 的涵 洞 ， 或 处 于软 土 地 基 上 不 同地 基 处 理 方式 的涵 洞 ，差 异沉 降 的设 计分 析重 视不 够 。
该没 有问题 ， 世 施 尚未完 成 的情 况 下 ， 箱涵
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２０１ ８年 ３月 第 １期 总 第 １４３期
交通 工程 建设
ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆｃｏｍｍ ｕｎｉｃａｔｉｏｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｊｕｎｅ．２０ｌ ８ Ｎ Ｏ．１ Ｓｅｒｉａ】Ｎ Ｏ．１４３
软土 地 基 上箱 涵设 计要 点及 常见 问题 分析
李 嵩
（中 交 武 汉 港 湾 工 程 设 计 研 究 院 有 限 公 司 ，湖 北 武 汉 ４ ３ ０ ０ ４ ０）
收 稿 日期 ：２０ １ ７—１ ２—１ 作 者 简 介 ： 李嵩．男，本科，助理工程 师，研究方Ｉ柚：道路与桥
蛋白复性
包涵体的变性及复性1、用1×Binding Buffer作裂解液，超声波破碎后，获得的包涵体；2、包涵体用含0.3%SKL（十二烷基肌氨酸钠）的1×Binding Buffer溶解，室温静置至完全溶解；3、充分溶解后，，加入用1×Binding Buffer配制的0.2%PEG2000和0.1mM GSSG：1mM GSH，0.1mM Arg，5-10% Glycerol），最后用1×Binding Buffer稀释蛋白至原菌液体积，调整pH（具体值视蛋白情况定，避开pI），装入透析袋中；4、用20倍体积的1×Binding Buffer进行4℃透析复性，每2h换一次，6次换液后，离心收集蛋白液；5、按可溶性蛋白纯化，注意保持低温环境，防止蛋白降解。
注意：透析液中的添加剂的浓度要在实验中摸索，每种蛋白的要求可能不同。
复性过程的添加剂：1、共溶剂：如PEG6000-20000，据说可以可逆的修饰折叠中间体的疏水集团，此外由于阻止了蛋白质分子间的相互接触的机会，也可能对复性效率的提高起作用。
一般的使用浓度在0.1%左右，具体条件可根据实验条件确定。
2、二硫键异构酶（PDI）和脯氨酸异构酶（PPI）：PDI可以使错配的二硫键打开并重新组合，从而有利于恢复到正常的结构，此外在复性过程中蛋白质的脯氨酸两种构象间的转变需要较高能量，常常是复性过程中的限速步骤，而PPI的作用是促进两种构象间的转变，从而促进复性的进行。
3、分子伴侣，即热休克蛋白（HSP），是一种没有蛋白质特异性的促进折叠的蛋白因子，研究发现很多蛋白在缺乏分子伴侣时无法自己正确的折叠。
有人构建了与伴侣分子共同表达的菌株，据说效果不错。
不过在生产中还没有看到2和3的应用的例子。
4、0.4-0.6ML-Arg：成功的应用于很多蛋白如t-PA的复性中，可以抑制二聚体的形成。
5、甘油等：增加黏度，减少分子碰撞机会，一般使用浓度在5%-30%。
桥涵施工中常见质量问题及处理方法
Engineering construction 工程施工243桥涵施工中常见质量问题及处理方法申飞(核工业西南勘察设计研究院有限公司，四川成都 610000)中图分类号：TU75 文献标识码：B 文章编号1007-6344（2018）04-0243-01摘要：近年来，我国高速公路的快速发展为我国社会经济的建设做出了巨大的贡献。
在高速公路建设的过程中，由于会受到山峰河流的阻碍，所以在建设高速公路的过程中，会出现桥涵，其作为高速公路建设质量的重要保障，桥涵的施工的技术水平和管理质量不仅关系着桥涵建设的质量，而且对于我国高速公路项目的发展也具有重要影响。
因此，本文通过分析桥涵施工中常见质量问题，探究桥涵施工中常见质量问题处理方法。
此次研究的目的主要是为了确保桥涵施工质量，促进高速公路项目的开展与建设。
关键词：桥涵工程；常见问题；处理方法0前言一般建设桥涵工程是为了跨越江河以及路基横向排水的重要工程，是属于路基工程中的部分之一。
随着我国交通迅速的发展，使得桥涵的工程质量越加完好，加大气承载力。
不过收到天气变化的影响等自然中的各种变化，导致在桥涵施工技术管理中出现了问题，影响了施工技术的管理，导致桥涵出现了一定的质量问题。
因此，本文研究的课题，对我国桥涵施工质量有着重要意义，对我国日后高速公路项目的开展具有现实意义。
1桥涵施工中常见质量问题分析1.1路基不均匀沉淀在高速公路列车行驶的过程中，在经过涵洞时，会发生车头跳车现象，其主要原因是由于涵洞本身与涵洞的两侧路基路面经手天气环境的影响或者施工质量问题，导致发生了沉淀现象。
一般涵洞的基础置于土地表面，在施工前，涵洞地基需要测试承载力，全波焊工地基能够承载列车的重量而不发生沉淀，涵洞建设的过程中，各个部位一般采用刚性材料，形变能力较小，不过由地基土受到压力二容易产生竖立位移。
涵洞建设周期一般相对较长，避免沉降任务在工程竣工后就已经完成，而在涵洞两侧的土方主要是由回填土完成，其施工速度较快，压实度较低，因此产生沉淀。
梯度透析法及稀释法蛋白的复性
蛋白的复性重组基因在表达宿主中表达量过高或合成速度过快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确配对，导致蛋白以包涵体的形式存在。
导致包涵体形成的主要原因有以下几点：⑴重组蛋白的氨基酸组成，一般说来含硫氨基酸越多越容易形成包涵体。
⑵重组蛋白所处的环境：诱导温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。
⑶重组蛋白是大肠杆菌(Escherichia coli)的异源蛋白，由于缺少真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。
⑷有报道认为，丰富的培养基有利于活性蛋白质的表达，当培养条件不佳时，容易形成包涵体。
包涵体内的蛋白是非折叠状态的聚集体，不具有生物学活性，因此要获得具有生物学活性的蛋白质必须将包涵体溶解，释放出其中的蛋白质，并进行蛋白质的复性。
包涵体复性在世界范围内都是个难题，最好的复性方法也不会超过20%。
目前大家在这方面研究也比较多，有研究证明一些分子伴侣有助于蛋白的复性；同时稀释、透析、渗透是最经典的蛋白复性的方法；另外氨基酸如精氨酸、糖类、醇类、表面活性剂对蛋白的复性都有辅助作用，还有很多的表达系统可以助复性。
本公司主要通过梯度透析和稀释的方法对变性蛋白进行复性。
梯度透析法梯度透析缓冲液配方：PBS（1L）：8.0NaCl、28.65gNa2HPO4·12H2O、0.234gNaH2PO4·2H2O缓冲液A：50mM Tris-HCl (pH8.5)、1mM EDTA、100mM NaCl、1%Triton-X-100 缓冲液B：50mM Tris-HCl (pH8.5)、1mM EDTA、100mM NaCl、1%Triton X-100、2M脲素缓冲液C：50mM Tris-HCl (pH8.5)、1mM EDTA、100mM NaCl、1%Triton-X-100、2M盐酸胍溶解缓冲液D：50mM Tris-HCl (pH8.5)、1mM EDTA、100mM NaCl、10mM β-巯基/乙醇/DTT、2mM脱氧胆酸钠、8M脲素复性缓冲液Ⅰ：50mM Tris-HCl (pH8.5)、100mM NaCl、6M/4M/2M脲素、1%甘氨酸、5%甘油、0.2%PEG、1mM氧化型谷胱甘肽、1mM还原型谷胱甘肽包涵体纯化及复性操作步骤：若蛋白以包涵体的形式纯在，则需要从包涵体中纯化出目的蛋白：1、大量诱导表达菌液，5000g离心10min，弃上清，用缓冲液A重悬，超声波破碎，功率45%，工作2s，暂停2s，破碎10min，，10,000g离心10min。
包涵体的纯化和复性总结--最全的前人经验
包涵体的纯化和复性总结二、包涵体的洗涤1、包涵体的洗涤问题通常的洗涤方法一般是洗不干净的，我以前是这么做的，先把包涵体用6M盐酸胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，你可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这就是梯度沉淀的方法，我觉得比通常的直接洗脱效果好。
包涵体一般难溶解，所以你要注意未溶解的部分，你可以跑电泳对比，因为有时候难溶解的就是你的目标蛋白，所以每次处理都要把上清和沉淀跑电泳对比，免得把目标蛋白弄丢了。
此外刚处理完的包涵体好溶解。
冷冻后难溶解，溶解也需要长点时间，也需要大量的溶剂。
如果说是不少不溶解的不是你要的，那就不用管了。
2、如何得到比较纯的包涵体对于包涵体的纯化，包涵体的前处理是很重要的。
包涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、质粒ＤＮＡ和其它杂质。
洗涤常用1%以下的中性去垢剂，如Tween、Triton、Lubel和NP40等加EDTA 和还原剂2-巯基苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇等反复多次进行，因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强，在洗涤包涵体时可加50 mM NaCL。
这样提取的包涵体纯度至少可达50%以上，而且可保持元结构。
也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不溶性杂蛋白。
洗涤液pH以与工程菌生理条件相近为宜，使用的还原剂为0.1-5mM。
EDTA为0.1-0.3 mM。
去垢剂如Triton X-100、脱氧胆酸盐和低浓度的变性剂如尿素充分洗涤去除杂质,这一步很重要,因为大肠杆菌外膜蛋白Omp T(37 KDa)在4-8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体的溶解和复性过程中可导致重组蛋白质的降解。
对于尿素和盐酸胍的选择：尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。
它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。
桥梁涵洞施工常见问题及对策论述
桥梁涵洞施工常见问题及对策论述发表时间：2016-09-20T13:34:18.517Z 来源：《建筑建材装饰》2015年12月下作者：李国兴[导读] 涵洞施工的质量对桥梁的整体性具有重要的作用，在进行桥梁涵洞施工时，经常会存在一些施工中的问题。
（江苏铁诚建设有限公司，江苏南京210000）摘要：桥梁涵洞施工是桥梁工程施工中重要的组成部分，本文具体描述了桥梁涵洞的施工内容，并且针对桥梁涵洞施工中常见问题的解决对策进行了分析。
关键词：桥梁工程；涵洞施工；问题；对策前言涵洞施工的质量对桥梁的整体性具有重要的作用，在进行桥梁涵洞施工时，经常会存在一些施工中的问题，我们必须针对施工中存在的问题进行及时的处理，以加强整体施工质量。
1桥梁涵洞的概述和桥梁的作用相比，桥梁涵洞也具有同样的作用。
桥梁涵洞作为一种通路，可以使渠及沟里的水在公路和铁路的下方通过。
另外，与桥梁跨径相比，桥梁涵洞的孔径较小。
对于公路涵洞来说，不仅可以使渠及沟里的水在公路和铁路的设施中顺利的通过，还可以将其作为一种洞穴式的水利工程进行使用，由于在涵洞上可以设计阀门，这样以来就可以对经过的水量进行有效的控制和调节。
2桥梁涵洞施工的主要内容（1）涵洞施工不仅是桥梁建设的重要内容，而且还是公路整体建设的基础内容，因此，通过提高涵洞的施工质量，就可以确保桥梁的整体质量。
在桥梁涵洞施工中，对涵洞施工的细节要求较高，并且还要对施工的地形进行严格的勘测，对施工所使用的设备和材料等进行严格的检查，科学合理地进行人力、物力的协调，以此确保桥梁涵洞施工的质量，提高涵洞施工的安全系数。
（2）在进行桥梁涵洞施工时，首先要勘察施工周围的地形，并且需要对所要经过路面的情况进行深入的分析和探讨，从而确保施工过程中大型设备和重型机械等安全地进行施工现场。
另外，在涵洞施工过程中，还要确保石子、钢筋和水泥等原材料顺利地进行施工现场，还要确保原材料的质量以及供应量的充足。
（3）在桥梁涵洞施工过程中，必须要确保施工所使用的工具顺利地入场，并进行科学合理地使用。
桥梁涵洞施工常见问题及对策论述 张学鹏
桥梁涵洞施工常见问题及对策论述张学鹏摘要：桥梁的涵洞施工是桥梁工程施工中的一个重要环节，接下来我大概描述一下桥梁涵洞的施工内容，并且谈一谈当前桥梁涵洞施工中存在的问题并分析其针对性的解决措施。
关键词：桥梁工程；涵洞施工；问题；对策涵洞施工的质量在桥梁的整体性中至关重要。
由于我们目前桥梁施工技术尚未成熟，我们在桥梁涵洞施工过程中仍存在一些大大小小的问题。
为此我们必须及时处理我们在施工过程中存在的问题，提高桥梁涵洞的施工水平进而提升桥梁施工整体的整体质量。
一、桥梁涵洞的概述1.1桥梁涵洞的主要作用桥梁涵洞与桥梁作用大同小异，相同的是它们都是一种能够使水在道路下方通过的通路；有所区别的是，与桥梁的跨径相比，桥梁涵洞的孔径较小，另外涵洞的作用较广泛，尤其是公路涵洞，它不仅可以排水使沟里的水在公路中顺利通过，还可以作为一种洞穴用来储水。
我们可以在涵洞安上阀门，有效控制并调节涵洞经过的水量。
1.2桥梁涵洞施工的主要内容（1）在涵洞施工前要严格勘测施工地形，并且严格检查施工所用的设备与材料是否达标，科学精准的预算人力物力的成本。
总之，施工前我们要牢牢把握涵洞施工的细节要求，确保桥梁涵洞施工的安全，提高涵洞施工的效率和质量。
（2）在进行桥梁涵洞施工过程中，首先要实地勘测施工地四周的地形，并深入分析路面情况，确保施工现场能够承载施工所用的大型设备和重型机械等。
另外，在施工过程中还要保证外部到施工地的道路通畅，确保施工所用的钢筋、水泥等材料能顺利地运输过来，同时要保证材料的质量和数量，为施工的顺利进行打下良好的基础。
相关的工作人员应建立一个施工平台，将施工所用材料放在该平台上，便于施工人员使用工具，让每个参与的了解施工进程并把握施工的整体性，从而提高施工的效率。
二、桥梁涵洞施工常见问题及措施2.1蜂窝问题的防治在桥梁涵洞施工过程中的一个常见问题就是蜂窝问题，解决蜂窝问题的首先要做好混凝土的成分配比，采用科学的混凝土配合比例。
包涵体蛋白的复性研究进展
基金项目 作者简介 收稿日期
中国热带农业科学院中央级公益性科研院所基本科研业务 费专项资金资助。 夏启玉（１９８３－ ），女，湖北浠水人，硕士研究生，研究方向：植 物基因工程。＊ 通讯作者，Ｅ!ｍａｉｌ：ｚｈａｎｇ＿ｃｓ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ。 ２００８! ０３!１７
（８５ ℃）溶解抗真菌重组肽的包涵体［１］。高 ｐＨ 值（≥１２）结合 低浓度的变性剂 （如 ２０％～４０％异丙基或 ｎ!丙基乙醇溶液） 用于溶解生长激素包涵体非常有效［２］。由于蛋白间二硫键的 存在，在增溶时一般要使用还原剂。还原剂的使用浓度一般 为 ５０～１００ ｍｍｏｌ／Ｌ ２!βＭＥ 或 ＤＴＴ。 ３ 包涵体的复性
基因工程技术的飞速发展为大规模生产目标蛋白质提 供了可能，大肠杆菌因其易于操作、遗传背景清楚、发酵成 本低和蛋白表达水平高等优点，成为生产重组蛋白的首选 表达系统。外源基因在大肠杆菌中的高表达常常导致包涵 体的形成，包涵体易于分离纯化，并能避免蛋白酶对外源蛋 白的降解，但包涵体不溶且无生物学活性。因此，如何高效 地复性包涵体蛋白是基因工程技术面临的一个难题。笔者 对包涵体蛋白的复性研究进展作一综述，旨在为促进基因 工程技术的发展提供理论依据。 １ 包涵体简介
较好效果［１６］。Ａｌｔａｍｉｒａｎｏ 等将 ＧｒｏＥＬ（抑制蛋白质聚集）、ＤｓｂＡ （帮助二硫键的交换）和脯氨酸异构酶固定在琼脂糖上，成功 用于变性的蝎毒素 Ｃｎ５ 的复性［１７］。
（３）脂质体亲和层析。脂质体可以识别蛋白质折叠的中 间体，如同分子伴侣抑制蛋白质聚集体的形成［１８］。因此，可 以将脂质体作为配体共价结合到层析介质上，固定化脂质 体的层析可以提高蛋白质折叠收率，并能部分纯化蛋白质［１９］； 脂双层膜可以根据蛋白质分子表面的不同疏水性能，选择 性地结合不同的蛋白质。在蛋白复性过程中，脂质体层析柱 能够键合蛋白折叠中间体，抑制其发生分子间的聚集反应， 从而提高活性产量。Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ 用固定化脂质体层析柱对碳 酸酐酶、溶菌酶和核糖核酸酶 Ａ 的复性进行了研究，取得 了较好的效果［２０］。 ３．２．５ 扩张床吸附复性（ＥＢＡ）。英国剑桥大学的 Ｃｈａｓｅ 等发 展了能在床层膨松状态下实现平推流的扩张床吸附技术［２１］。 这种层析复性方法具有处理量大、蛋白质浓度高、可重复生 产以及降低操作步骤等优点。该技术是利用扩张床吸附层 析直接从细菌裂解变性液中捕获并复性目标蛋白。其过程 是将细菌破碎液直接加入高浓度的变性剂，然后上样到扩 张好的柱床上，在上样过程中，细胞碎片和不吸附的杂质流 穿掉，而变性蛋白被吸附在凝胶上，然后用含变性剂的缓冲 液清洗掉剩余杂质，再用不含变性剂的缓冲液洗掉变性剂， 将扩张床沉降后，用洗脱缓冲液将目标蛋白洗脱下来，通过 吸附、清洗和洗脱的过程，变性蛋白得以复性并获得初步纯 化。这种扩张床式的层析复性方法具有处理量大、蛋白质浓 度高、可重复生产以及降低操作步骤等优点。Ｃｈｏ 等利用该 技术将 ｒｈＧＨ!ＧＳＴ 和 ｒｈＩＦＮ!α!２ａ 直接从细菌破碎液中提取 出来并加以复性，获得比稀释复性高 ３ 倍的复性效率和纯 度［２２］。 ４ 复性过程中的添加剂
涵体修复方案
涵体修复方案涵体修复是指对损坏或破损的涵洞进行修复和加固，以保证涵洞的正常使用和结构安全。
本文将从设计原则、材料选择和具体修复措施等方面介绍涵体修复方案。
设计原则涵体修复的设计应遵循以下原则：1. 功能性原则：修复后的涵洞应能正常通行水流，确保排水畅通。
2. 结构安全性原则：修复措施应确保涵洞的结构安全，能够承受设计荷载并抵抗外力的影响。
3. 持久性原则：修复措施应选用耐久性好的材料，能够经受各种外界环境的影响并延长使用寿命。
4. 经济性原则：修复措施应在保证结构安全和功能要求的前提下，尽可能选择成本较低的方案。
材料选择涵体修复所使用的材料应根据涵洞的具体情况选择，一般包括以下几种：1. 表面防水材料：用于修复涵洞的表面漏水问题，常见的有聚合物水泥、沥青涂料等。
2. 加固材料：用于对涵洞进行加固，可采用纤维增强材料、钢筋混凝土等。
3. 修复材料：用于修复涵洞损坏部分，可以选用标准的混凝土或修复剂。
具体修复措施涵体修复的具体措施因涵洞的破损情况而定，以下是常见的修复方法：1. 表面漏水修复：对于涵洞的表面漏水问题，可以先清理涵洞表面，然后使用防水涂料进行刷涂，确保表面防水层的完整性。
2. 裂缝修复：对于出现裂缝的涵洞，可采用裂缝注浆技术进行修复，首先将裂缝清理干净，然后注入修复剂填充裂缝。
3. 损坏部分修复：当涵洞的部分结构损坏时，可先将损坏部分清理干净，然后使用标准的混凝土或修复剂进行修复。
4. 加固措施：对于结构不稳定或需要加固的涵洞，可以采用纤维增强材料或钢筋混凝土进行加固，增加涵洞的承重能力和结构稳定性。
总结涵体修复是涵洞维护和保养的重要环节，通过科学的设计原则、合适的材料选择和具体的修复措施，可以有效修复和加固破损的涵洞，延长其使用寿命，确保交通畅通和结构安全。
在实施涵体修复方案时，应根据涵洞的具体情况和要求，有针对性地采取相应的修复措施，以实现修复效果的最大化。
注：本文所述涵体修复方案仅供参考，具体实施方案应根据涵洞的实际情况和专业人员的建议进行决策。
包涵体复性注意事项和常见问题解析
包涵体复性注意事项和常见问题解析返回:包涵体复性介绍及包涵体复性操作方法包涵体复性注意事项1.最适pH值范围为8.0-9.0之间;2.温度适宜选择4℃;3.复性过程蛋白浓度不宜过大,一般为0.1-0.2mg/mL;4.复性时间一般为24-36小时;5.低分子化合物如L-Arg有助于增加复性中间产物的溶解度;脲、盐酸胍、烷基脲、以及碳酸酰胺类等,在非变性浓度下是很有效的促进剂,都可阻止蛋白聚集;Tris 对蛋白质复性有促进作用;EDTA可以防止蛋白降解;6.首先要获得较高纯度的包涵体;7.包涵体溶解要彻底,一般应使溶解液体量较大,不要怕蛋白被稀释,要有助溶措施;8.透析前后均要离心;9.包含体要彻底洗涤干净,洗涤液中加入适量Triton-X100;10.包含体溶解后装入透析袋在复性液中复性;11.复性完毕在低浓度的缓冲液中连续缓慢透析12-24h ;12.复性率的测定时要据变性蛋白和非变性蛋白的光学性质不同测定13.TritionX100、SDS这一类去垢剂最后不易去除,在制药行业中一般不允许采用。
用Triton洗涤有些包涵体效果不是很好。
包涵体洗涤是纯化极为重要的一步,改变培养条件,再洗涤包涵体,有时可以在上柱前已经只剩下3-4条杂带,这样后续的纯化就很方便了。
14.复性时的蛋白浓度一般为0.1-1mg/ml,太高的浓度容易形成聚体沉淀,太低的浓度不经济,而且很多蛋白在低浓度时不稳定,很容易变性。
包涵体复性常见问题分析包涵体复性原则低浓度,平缓梯度,低温。
怎样洗涤包涵体?通常的洗涤方法一般是洗不干净的,可以先把包涵体用6M盐酸胍溶解充分,过滤除去未溶解的物质,注意留样跑电泳,然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳,如此类推可以一直稀释到合适的浓度,可以找到一个合适去除杂质的办法,其实这就是梯度沉淀的方法,比通常的直接洗脱效果好。
对于尿素和盐酸胍该怎么选择尿素和盐酸胍属中强度变性剂,易经透析和超滤除去。
包涵体复性方法
包涵体复性方法：一个有效的、理想的折叠复性方法应具备以下几个特点：活性蛋白质的回收率高；正确复性的产物易于与错误折叠蛋白质分离；折叠复性后应得到浓度较高的蛋白质产品；折叠复性方法易于放大；复性过程耗时较少。
（即回收高，易分离，浓度高，易放大，耗时少。
）1. 透析、稀释和超滤复性法：这三种方法是最传统也是应用最普遍的蛋白质折叠复性方法，复性活性回收率低，而且难于与杂蛋白分离。
透析法耗时长，易形成无活性蛋白质聚集体；超滤法在膜上聚集变性（不可逆变性），易造成膜污染；稀释法（直接加入水或缓冲液，放置过夜，缺点是体积增加较大，变性剂稀释速度太快，不易控制）处理量太大，不利于工业放大。
2. 凝胶过滤层析复性凝胶过滤层析复性又称体积排阻复性(SEC)，是一种广泛应用的层析技术。
与常用的稀释复性法相比，凝胶过滤层析复性能在高的起始蛋白浓度下对蛋白进行复性，活性回收率较高，同时又能使目标蛋白得到一定程度的纯化。
凝胶过滤复性时，除了蛋白质在胶粒中的传质和扩散外，蛋白质与介质之间并不发生其它任何作用。
复性过程始终发生在溶液中。
蛋白质在伸展状态中，每个蛋白质分子的伸展状态都会有差别，而不同伸展状态的蛋白质分子在凝胶颗粒内部扩散所受到的限制也不相同，有的会扩散入颗粒内部深一些，有的会浅一些，这使不同伸展状态的蛋白质分子达到一定程度的分离，这样蛋白质分子问相互作用的机会就大大减少，从而起到一定抑制凝集的作用；即使发生了部分凝集，凝集的蛋白质会附着在胶粒上，而不随着溶液向下运动，这样后面的变性剂可以赶上凝集的蛋白质，使其重新溶解并变性；并且在凝胶过滤中脲等变性剂脱除得相对较慢，这对有些蛋白质的复性是有利的。
在普通凝胶过滤中，变性剂和还原剂的脱除（？？）虽较稀释复性慢，但变性蛋白质仍会经历变性剂浓度突然变化的过程。
脲梯度复性是样品上柱前用复性缓冲液平衡柱子，接着使变性剂浓度递减(如从6M 盐酸胍或8M尿素下降到复性缓冲液中预先确定的变性剂的浓度)。
包涵体的纯化和复性总结
板块一、大肠杆菌(这里讨论的大肠杆菌为非分泌到培养基中的重组蛋白，是否有重组蛋白分泌到培养基中的工程菌我没有见过。
）一、关于菌体的量大肠杆菌表达的基因工程蛋白是纯化人员最方便获得的原料，对纯化工艺开发来说几乎没有原料方面的限制.常看到有战友用个几毫升的菌液去做纯化，对此我十分不解,同样要做,为什么不多做点呢？很少的菌体会给纯化带来一些难以估计的问题，工艺的重复性和放大往往出现问题。
因此，要做个好工艺就多发酵表达一些菌体吧.我做纯化时，初始工艺摸索用的菌体量一般为10g左右.二、关于是否包涵体表达包涵体的定义我就不讲了。
我要讲的是，一个基因工程蛋白是否是包涵体表达的说法本身就不完全准确。
至于包涵体在电镜下的晶体颗粒表现等等对我们纯化来说毫无意义，我相信做纯化工艺的人没有谁去看这个电镜，也不关心.我们判断的依据只是SDS—PAGE，目的蛋白在破菌沉淀中，我们就认为是包涵体表达，但这是一个似是而非的结论。
看着没问题，实际上是有毛病的。
关键在于你用的是什么破菌缓冲液！有些蛋白在用缓冲液A破菌时是在破菌沉淀中，而用缓冲液B破菌时却在破菌上清中。
缓冲液A和B的差别可能只是pH上相差1-2个单位。
那么它是包涵体表达还是可溶上清表达呢？说这个问题主要在于有些战友往往非常在意他的目标蛋白是否包涵体表达。
甚至还有包涵体表达就用专门的包涵体蛋白纯化方法等等.我们应该关心的是目标蛋白在什么缓冲体系下是可溶的，在什么缓冲体系下是不溶的!不要让包涵体这个概念给你误导。
三、关于表达量我们常常在发表的文章上看到，我这个工程菌的目标蛋白的表达量达到菌体总蛋白的30%、50%等等。
我要说都是文章的作者在忽悠.不知道他们是如何定量的，用的最多的大概就是SDS-PAGE的扫描分析吧。
且不说一个SDS-PAGE不能表现出所有的菌体蛋白，电泳的染色方法、染色脱色强度、照片的曝光强度、扫描分析时的条带选择等等无不对这个百分比影响巨大。
在公司的QC部门做的对此应该最有体验,20%的条带要它变成30%又有何难？我的观点是对待表达量的描述不可定量，只能定性。
用层析法分离、复性包涵体
用层析法分离、复性包涵体谷振宇Jan-Christer Janson 苏志国中国科学院过程工程研究所摘要这里提出了一种用柱层析直接从Ecoli破碎原浆中分离纯化及复性包涵体的新方法。
将传统的离心分离一步凝胶过滤所取代。
分离的原则是选择合适的介质，使之仅排阻包涵体颗粒，而其它的组份都可以进入并穿过凝胶介质。
在新的复性方法中，逐步递减的变性剂(urea或Gu-HCl) 梯度与逐步递增的pH梯度相结合，通过凝胶过滤(排阻上限小于蛋白质分子量) 层析来进行复性。
溶解在高浓度变性剂及低pH中的变性样品，然后加入到梯度形成好的层析柱中。
在层析过程中，变性蛋白质的下行速度大约是变性剂下行速度的3 倍。
因此，变性蛋白会经过已经形成好的变性剂和pH梯度，并逐步脱除变性剂，逐步地升高pH，这样可以促进正确的折叠。
梯度的形状和程度，及流速都会影响复性率，而且可以针对不同蛋白质进行调节，以得到优化的条件。
我们在此实验中选择的目标蛋白质为大肠杆菌表达的scFv 融合蛋白包涵体。
Rudolph和Lile的综述已经对蛋白质的体外复性做详细的介绍[1]。
传统的分离、复性方法如：分步离心，稀释和透析通常很耗时且复性率低。
本文中介绍了以凝胶过滤为基础发展起来的分离及复性方法。
此方法的一个优势是变性剂的脱除，流速及pH的变化可以很容易的调节。
大肠杆菌表达的scFv 融合蛋白质包涵体。
ScFv 片段在Eocli 中表达量很高，但经常会形成包涵体。
因此需要进行复性。
材料与方法脲(urea )、DTT、PMSF、溶菌酶(lysozyme)、精氨酸(arginine)、Triton X-100和DNAse购于Sigma。
GSSG，GSH购于Roche。
Berol 185 购于Akzo Nobel 表面化学公司，Sweden。
所有层析介质均为Amersham Pharmacia Biotech公司产品。
其它试剂均为分析纯。
实验用水为Millipore 纯水系统生产。
包涵体变性、复性及纯化
一、菌体的裂解1、怎样裂解细菌？细胞的破碎方法1.高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。
此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。
2.玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。
3.超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG 频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施，时间以及超声间歇时间、超声时间可以自己调整，超声完全了菌液应该变清亮，如果不放心可以在显微镜下观察。
对超声波及热敏感的蛋白和核酸应慎用。
4.反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
5.化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好，我用的浓度一般为1mg/ml。
无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且应该在破碎的同时多加几次；另外，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。
这是标准配方:裂解液：50mM Tris-HCl(pH8.5~9.0), 2mM EDTA, 100mM NaCl, 0.5% Triton X-100, 1mg /ml溶菌酶。
包涵体的纯化和复性总结全
包涵体的纯化和复性总结二、包涵体的洗涤1、包涵体的洗涤问题通常的洗涤方法一般是洗不干净的，我以前是这么做的，先把包涵体用6M盐酸胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，你可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这就是梯度沉淀的方法，我觉得比通常的直接洗脱效果好。
包涵体一般难溶解，所以你要注意未溶解的部分，你可以跑电泳对比，因为有时候难溶解的就是你的目标蛋白，所以每次处理都要把上清和沉淀跑电泳对比，免得把目标蛋白弄丢了。
此外刚处理完的包涵体好溶解。
冷冻后难溶解，溶解也需要长点时间，也需要大量的溶剂。
如果说是不少不溶解的不是你要的，那就不用管了。
2、如何得到比较纯的包涵体对于包涵体的纯化，包涵体的前处理是很重要的。
包涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、质粒ＤＮＡ和其它杂质。
洗涤常用1%以下的中性去垢剂，如Tween、Triton、Lubel和NP40等加EDTA 和还原剂2-巯基苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇等反复多次进行，因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强，在洗涤包涵体时可加50mM NaCL。
这样提取的包涵体纯度至少可达50%以上，而且可保持元结构。
也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不溶性杂蛋白。
洗涤液pH以与工程菌生理条件相近为宜，使用的还原剂为0.1-5mM。
EDTA为0.1-0.3mM。
去垢剂如Triton X-100、脱氧胆酸盐和低浓度的变性剂如尿素充分洗涤去除杂质,这一步很重要,因为大肠杆菌外膜蛋白Omp T(37KDa)在4-8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体的溶解和复性过程中可导致重组蛋白质的降解。
对于尿素和盐酸胍的选择：尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。
它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。
蛋白质复性
重组包涵体蛋白质复性邹平基因工程技术的发展掀开了人类生命科学研究的崭新篇章，开辟了现代生物工业发展的新纪元。
重组DNA技术为大规模生产目标蛋白质提供了可能，E.coli以其易于操作、遗传背景清楚、发酵成本低和蛋白表达水平高等优点，是生产重组蛋白的首选表达系统。
但外源基因在E.coli中的高表达常常导致包涵体的形成，如何高效地复性包涵体蛋白是基因工程技术面临的一个难题。
随着人类基因组计划的完成和蛋白组计划的实施，人们将会更多地面临这一问题的挑战。
一、包涵体蛋白1、包涵体的形成包涵体主要是因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，而无法形成正确的次级键等原因形成的；也可能是外源基因合成速度太快，没有足够的时间进行折叠、二硫键不能正确的配对、过多的蛋白间的非特异性结合、蛋白质无法达到足够的溶解度等；重组蛋白质的一级结构也与包涵体形成有关，一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关；重组蛋白所处的环境不适，发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时易形成包涵体。
2、减少包涵体形成的策略降低重组菌的生长温度，是减少包涵体形成的最常用的方法。
低生长温度降低了无活性聚集体形成的速率和疏水相互作用；细菌生长缓慢溶氧水平低，也可减少包涵体的形成。
在培养重组菌中供给丰富的培养基，创造最佳培养条件，如供氧充足、合适pH等，以减少包涵体的形成。
添加可促进重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂，增加细胞的渗透压。
在低的诱导剂条件下培养重组菌，减少重组蛋白表达量，也可减少包涵体的形成。
利用硫氧还蛋白融合表达或与目标蛋白共表达，得到可溶性目的蛋白。
筛选合适的宿主菌，使表达的重组蛋白可溶。
3、包涵体破菌、分离、洗涤常用高压匀化或机械、化学和酶相结合的方法破碎含包涵体的宿主菌细胞 ,再将破碎液通过低速离心或过滤除去可溶蛋白后获得包涵体。
包涵体中除了目的蛋白外还含有脂类、脂多糖、核酸和杂蛋白等成分，而这些成分会影响包涵体蛋白的复性，故去折叠前应洗涤包涵体，以去除杂质。
包涵体蛋白的变复性研究
包涵体蛋白的变复性研究高永贵 关怡新 姚善泾(浙江大学化学工程与生物工程学系,浙江杭州 310027)摘 要:针对基因工程蛋白在 E.coli中表达多为无活性包涵体的特点,介绍了包涵体洗涤和去折叠的方法、蛋白质体外折叠的过程和机理、体外复性技术以及复性蛋白的检测,着重讨论了最近发展起来的蛋白质复性新技术.关 键 词:包涵体,去折叠,蛋白质复性中图分类号: 文献标识码:A 文章编号:1001-7119(2003)01-0010-06R efolding of G enetic E ngineering Protein Expressed as I nclusion BodiesG AO Yong-gui,GUAN Yi-xin,YAO Shan-jing(Depart.of Chem.and Biochem.Eng.,Zhejiang Univ.,Hangzhou310027China)Abstract:The genes,of interest are often expressed as inactive inclusion bodies in Escherichia coli,s o the methods for resus2 pending and un folding inclusion bodies,the pathway and technique of protein refolding in vitro and the determination of renatured protein was overviewed.Especially,the new technique of protein refolding recently developed was emphasized.K ey w ords:inclusion body;un folding;protein renaturation 随着基因工程技术的迅猛发展,人们越来越多地通过蛋白质的异源表达为临床和工业生产提供一些蛋白质多肽产品.迄今为止, E.coli以其易于操作、遗传背景清楚、发酵成本低和蛋白表达水平高等优点,依然是生产重组蛋白的首选表达系统,尤其适合表达不经过蛋白质翻译后修饰(如糖基化)就具有生物活性的基因工程蛋白.但是在 E. coli中表达的蛋白常常以包涵体的形式沉积于细胞内,表现为无活性的不溶性聚集物,如何高效地复性包涵体蛋白经常是基因工程技术面临的一个难题.随着人类基因组计划的完成和后基因组计划的实施,人们将会更多地面临这一问题的挑战.因此,本文将着重介绍包涵体蛋白的变复性技术及其最新研究动态,期望能有助于促进这一研究的深入和问题的早日解决.1 基因工程蛋白在 E.coli中的表达革兰氏阴性菌 E.coli被内膜(又称质膜)和外膜分隔成胞内、周质和胞外三个腔室,相应地在E.coli中表达的异源重组蛋白可定位于胞内、周质空间或胞外培养基中[1].有限的周质空间使得产物的表达量仅为0.3%～4%,同时产物容易发生二硫键错配,因此除了作为抗体基因表达的首选策略外,至今以周质分泌途径生产重组蛋白达到工业化规模的应用很少[2].细菌素释放蛋白(Bacterioncin release protein,BRP)系统和α-溶血素(Haem olysin A,HlyA)系统是目前两种主要使外源蛋白分泌到培养基的表达系统,但是前一系统的缺陷是BRP的诱导表达可能会影响工程菌的生长;后者的缺陷则在于融合蛋白C端的HlyA信号序列有时会干扰融 第19卷第1期2003年1月 科技通报BU LLETI N OF SCIE NCE AND TECH NO LOGYV ol.19 N o.1 Jan.2003收稿日期:2001-10-15;修订日期:2002-04-29基金项目:教育部留学回国科研启动基金及浙江省自然科学基金(201099)资助项目作者简介:高永贵,男,1971年生,湖北黄岗人,生物化学工程博士.合蛋白的生物活性,因此迄今只有少数重组蛋白可成功地利用 E.coli进行分泌表达[3].在胞内直接表达蛋白则是研究最早、采用最多的表达策略,目前已经积累了许多成功的经验.采用较强的启动子(如λP L、T7或串联启动子),外源基因可在胞内获得高效表达,一般占细菌总蛋白的10%～50%.胞内表达的最大问题是产物形成不溶性的包涵体,虽然这可为后续的分离纯化带来方便,但包涵体必须经过体外复性才有可能获得生物活性[1].2 包涵体的去折叠的,任何影响中间体稳定的因素(如pH值、离子强度、温度等)都可导致包涵体的形成.鉴于包涵体蛋白无活性及复性困难的缺点,在表达外源基因的同时,人们试图采用共表达分子伴侣或折叠酶以及调[1],但效果并不理想,因此面临的挑战是既能利用包涵体蛋白的高表达,又能对其进行很好地复性.为了成功地对包涵体蛋白复性,应先对包涵体进行分离纯化及去折叠(即变性溶解),然后采用合适的复性方法促进变性蛋白再折叠进而恢复活性.2.1 包涵体的分离纯化常用高压匀化或机械、化学和酶相结合的方法破碎含包涵体的宿主菌细胞,再将破碎液通过低速离心或过滤除去可溶蛋白后获得包涵体.包涵体中除了目的蛋白外还含有脂类、脂多糖、核酸和杂蛋白等其它成分,而这些成分会影响包涵体蛋白的复性,故去折叠前应洗涤包涵体,以去除杂质.常用E DT A、低浓度的变性剂(尿素、盐酸胍)、弱去污剂Trion X-100、脱氧胆酸等洗涤包涵体,洗涤后包涵体的主要成分为聚合态的目的蛋白[4].2.2 包涵体的去折叠极端pH值、高温、去污剂、高浓度的无机盐或有机溶剂均可用于溶解包涵体.从已发表的文献看,绝大多数是采用6m ol/L盐酸胍或8m ol/L脲并结合还原剂来溶解包涵体.但是高浓度的变性剂可能会严重破坏蛋白质的二级结构,产生不可逆变性,导致无法复性.因此,包涵体溶解时不仅要采用尽可能低的变性剂浓度,还要注重其它包涵体溶解方法的研究.极端pH和变温就被用来溶解包涵体,以替代高浓度的变性剂.G avit et al.采用低pH(≤2.6)和高温(85℃)溶解抗真菌重组肽的包涵体[5].高pH (≥12)结合低浓度的变性剂(如20%～40%异丙基或n-丙基乙醇溶液)用于溶解生长激素包涵体非常有效[6].去污剂用于蛋白质去折叠,其优点是蛋白质去折叠后即具生物活性.采用此方法洗涤包涵体时,应尽可能除去与膜结合的蛋白酶,避免包涵体溶解后即被降解;另外去污剂会干扰蛋白质下游层析过程,因此层析前必须除去复性混合物中的去污剂[4].当蛋白表达量很高时,包涵体的在位溶解质复性的收率下降[8].这些方法的选择与体系和基因工程蛋白的性质有关,虽然有许多方法可用来溶解包涵体,但不同溶解方法将极大地影响后续的复性和整个加工过程的成本,所以对具体的包涵体蛋白,进行去折叠过程的方法学研究仍具有实用价值.3 蛋白质体外折叠复性的过程 与机理 An finsen在研究RNase A时发现一种蛋白质的结构、稳定性和功能的全部信息均来源于其氨基酸组成和排列,多肽链的折叠是一个自发的过程,主要取决于给定氨基酸的序列[7].这一规律被称作生物体内的第二遗传密码.虽然第二遗传密码如何控制蛋白质高级结构形成的机制至今仍不明了,但已经清楚的是变性蛋白质的再折叠同时受热力学和动力学控制,三级结构形成的动力来自去折叠蛋白质暴露在外的疏水基团逐步被包埋而引起的自由能变化.常用图1所示的模型来描述蛋白质折叠的过程[8].在折叠起始阶段,去折叠蛋白质(U)的疏水性氨基酸暴露在分子表面,产生大量非极性基团,热力学的驱动力使它们聚集在一起形成幼稚的二级结构(I1…I i为中间态),幼稚的二级结构很不稳定,与U之间存在着平衡.在中间态I i向天然状态(N)转变过程中,存在更加有序、结构致密、几乎与天然态相似的熔球态(M olten globule,I n),I n与N之间存在着较大的自由能屏障,两者的转化是整个折 第1期高永贵等.包涵体蛋白的变复性研究11 叠途径的限速步骤.中间体正确折叠是分子内的一级反应,而中间体的聚集则是发生在分子间的二级或高级反应,中间体的浓度对聚集反应影响大,必须控制中间体的浓度以有利于反应向正确折叠的方向进行.变性蛋白质的空间结构被破坏,疏水侧链外露,而复性后的蛋白质具有致密的空间结构,疏水基团包埋使得蛋白质疏水性逐渐减小而亲水性增强,因此这一特性的变化对进行蛋白质复性方法学探究、建立监测蛋白质复性动态过程和复性蛋白质的定量分析大有裨益.图1 蛋白质再析叠的动态模型Fig.1K inetic m odel of protein refolding4 去折叠包涵体蛋白的体外 复性方法 包涵体蛋白的体外复性是基因工程蛋白生产过程中最关键和最困难的一步,已成为产业化的瓶颈之一.蛋白质体外复性的一般策略就是考虑影响复性收率的各种因素(如蛋白质浓度、温度、pH 值、适宜的氧化—还原体系等)和应用实际,尽量抑制蛋白质的聚集而促进折叠中间体向天然态的方向折叠.在实验室少量蛋白需要复性时,一般采用传统的稀释和透析复性,复性时蛋白质初浓度为10～100μg/m L 或更低,但工业上采用此复性方法需要很多的容器及大量的复性缓冲液,同时复性蛋白回收困难,因此,笔者着重探讨最近发展起来的包涵体复性技术,以促进这一问题的早日解决.4.1 分子伴侣介导的复性法分子伴侣(M olecular Chaperone )是抑制伸展肽链及部分折叠肽链的聚集、协助蛋白质折叠复性的一类蛋白,目前已经确认的分子伴侣主要为Hsp60、Hsp70以及Hsp90三个高度保守的家族.当变性蛋白进入分子伴侣中空环状的疏水空腔后,在空腔的“An finsen Cage ”分隔下可部分或完全避免蛋白分子间的聚集,使变性蛋白在疏水环境下进行“结合-释放-再结合”的循环直至恢复到天然构象状态,从而防止多肽链的错误折叠或聚集.分子伴侣与变性蛋白相互作用的特异性很低或不具特异性,这为体外分子伴侣介导的复性提供了更多的选择对象.剑桥大学Fersht et al.对分子伴侣介导的蛋白折叠复性的研究最为出色,他们不仅研究了分子伴侣G roE L 促进蛋白折叠的机理及高效复性的协同条件,如与G roES 配对使用、ATP 的需求,而且用E.coli 表达制备了起作用的Minichaperone(G roE L191-345片断),并建立了一套固定化的、可以循环使用的分子伴侣重折叠系统[9,10].该系统由固定在琼脂糖凝胶上的三部分组成,即能阻止蛋白聚合的Minichaperone (G roE L191-345)、能催化二硫键重排和形成的DsbA 以及起顺反异构作用的肽基脯氨酸异构酶(PPI ).用此系统对蝎毒Cn5进行复性,活性收率达87%,解决了蝎毒Cn5复性困难的问题.徐明波等利用PDI (二硫键异构酶)、PPI 和分子伴侣催化重组人I L -2和G M -CSF 包涵体的再折叠,也获得了较好的复性收率[11].天然分子伴侣来源有限,对那些价格相对低廉的蛋白质,人工分子伴侣的应用或许更具实际意义.David 和Samuel 研究发现采用小分子的去污剂和环糊精(β-C D )可引导蛋白质折叠,并把这些低分子量的助剂称为人工分子伴侣,其协助的蛋白质折叠过程为:先将高浓度的盐酸胍溶液快速稀释,去污剂捕获非天然状态的蛋白质形成蛋白质-去污剂复合物,从而阻止了蛋白质的凝聚,当加入环糊精使去污剂从蛋白质上剥离后,蛋白质就逐渐复性[12].最近,刘晓光等利用阳离子表面活性剂CT AB 和环糊精联合作用协助变性溶菌酶的复性[13],也取得较好的效果.分子伴侣的实用性取决于其稳定性、重复利用率及与复性蛋白分离的难易,固定化Minichaperone 技术及人工分子伴侣的应用是今后分子伴侣介导的复性方法的发展方向.4.2 反向微团复性法反向微团是由表面活性剂在有机溶剂中形成的水相液滴,微团中表面活性剂极性头部向内,疏水尾部向外.在含有增溶剂的水溶液中,将去折叠的蛋白引入到含有反向微团的溶液中时,蛋白将会插入到微团中,并与活性剂的极性头作用,逐渐进行复性.反向微团复性蛋白质的主要过程如图2所示,通过相转移使变性溶解的蛋白进入到反向微团中,然后交换缓冲液而逐渐降低反向微团中的变性剂浓度,同时加入氧化还原剂使变性蛋白的二硫键再氧化重排而获得天然构象,最后将复性蛋白从微团中抽提到水相溶液中.利用反向微团可使盐酸胍变性的RNase A 在24h 内获得100%的复性率[14],表明反向微团是一种很有前景的蛋白复性方法.要形成反向微团并促使变性蛋白进入微团内的条件苛刻,而微团内的微环境很难与蛋白质复性的最适 12 科 技 通 报19卷条件一致,因此该法的实际操作复杂,同时复性对象仅限极少数蛋白.图2 反向微团中的蛋白折叠技术更是日益备受关注.与传统的稀释法或透析法相比,层析折叠复性的优势在于:1)在进样后可很快脱除变性剂,操作效率高;2)层析固定相对变性蛋白的吸附可减少变性蛋白在脱除变性剂后形成聚集体,这不仅提高了蛋白质复性的活性收率,而且可提高蛋白质复性的初始浓度;3)在复性的同时可使目标蛋白与杂质分离,特别适合包涵体蛋白的复性;4)便于回收变性剂,以降低废水处理成本.目前,用于蛋白质复性的层析折叠复性法主要有凝胶G FC 基于蛋白质S tokes 半径的差异和凝胶排阻作用,通过“Bu fferExchange ”逐渐脱除变性剂而使蛋白质复性 操作简单,可对所有蛋白质进行复性,介质可多次使用,但易造成样品的过度稀释和引起柱堵塞,样品处理量较小,纯化效果稍差carbonic anhydrase E.coli integration host factor ,rhETS -1,RNase A Heterodimeric platelet -derived growth factor u -PA 171819HIC 基于蛋白质与介质的疏水性相互结合,实现蛋白质与极性变性剂的分离而促使蛋白质复性 复性与纯化的集成,同时可检测活性蛋白的量,但仅限部分蛋白的折叠分析,无工业应用实例,易造成柱堵塞rhIFN -γ,rhIFN -βRecombinant human G C -CSF2021IEC 蛋白质与介质间存在电荷作用力,梯度洗脱时脱除变性剂而逐步复性蛋白质 对蛋白质具有浓缩作用,柱容量高,但变性剂易在柱上保留而影响蛋白吸附,只限一些蛋白,介质较贵Papiloma virus HPVE7MS2fusion protein Recombinant human secretory leukocyte2223AFC 蛋白与配体的特异性亲和吸附,洗脱时使变性剂与蛋白分离,促使蛋白复性,固定化配体有金属、脂质体和分子伴侣 复性与纯化的集成,复性后蛋白浓度较高,但介质昂贵且寿命较短,仅限具H istine T ag 等少数蛋白rhPrion bovine carbonic anhydrase2425 蛋白质层析折叠复性是一种处于发展阶段的方法,不仅需要从理论方面对复性的机理进行深入研究,而且应该关注合成高性能(对蛋白质复性和分离效果好)价格比的层析介质的研究.无论如何,层析方法在蛋白质复性方面已发挥着越来越大的作用,尤其是操作简单的G FC 复性蛋白质技术,已被许多厂家大规模地应用于工业化生产.但液相层析技术用于蛋白质的复性,一个最为主要的问题就是复性过程中会产生蛋白质聚集体,这些聚集体沉聚在柱上造成堵塞,降低了分辨率,并引起柱压升高.谷振宇等人发展的一种脲梯度凝胶过滤复性蛋白质的新方法,即蛋白质在脲由高到低的无级变化浓度下逐渐复性,复性后再与脲等小分子变性剂分开,从而更好地避免蛋白质聚合[26],当然该法对操作和设备要求较高.笔者进行复性液中添加适量脲的凝胶复性溶菌酶的研究,结果表明,即使变性溶菌酶的初始浓度高达100mg/m L 也很少有蛋白质沉淀,同时采用等盐洗脱,操作简单.还可采用连续上样操作进而提高功效.4.4 其它复性方法近年来折叠促进剂协助的复性方法也取得长足发展.我们把能够促进蛋白再折叠的化学物质统 第1期高永贵等.包涵体蛋白的变复性研究13 称为折叠促进剂,折叠促进剂的作用原理在于稳定复性蛋白质的天然结构、优先去除错误折叠蛋白质的稳定性、增加折叠复性中间体的溶解性等,进而抑制或减少了导致蛋白质无活性的聚集.应用于蛋白质复性并具有显著效果的折叠促进剂有表面活性剂[27]、聚乙二醇(PFG)[28,29]、L-精氨酸[30]、抗体等[31].折叠促进剂协助的复性也存在溶液稀释的过程,因此与传统的稀释复性一样具有活性蛋白浓度低、目标产物回收困难的缺点,尤其是表面活性剂可与蛋白质结合或形成胶束,很难去除.虽然如此,但聚乙二醇还是一种较有前景的折叠促进剂. PEG不仅能显著增加包涵体蛋白的复性效率,同时还是双水相的成相聚合物,因此利用双水相技术可以实现蛋白质复性与分离的耦合.此外,由于分子印迹技术提供了制备具有分子识别功能的模板聚合物,所以利用这一模板,在缓慢复性的同时可分离变性态和天然态的蛋白质,避免蛋白质聚集,而且还可采用亲和折叠过渡态的模板,起到类似酶的诱导协和作用而促进蛋白质的折叠.迄今为止,虽然分子印迹技术主要用于分离,但分子印迹介导蛋白质复性的诱人前景值得人们探索.5 复性蛋白质的检测研究蛋白质的复性,必须建立适当的检测方法,以鉴定复性蛋白质的生化、免疫学、物性以及蛋白变性态与天然态的区别,从而对复性方法进行评价和条件优化.主要有:1)凝胶电泳 其中最为常用的是还原和非还原的S DS-PAGE,适于鉴定产物的纯度及复性蛋白质的聚集状态;2)光谱学方法 主要有紫外光谱、荧光光谱和圆二色谱C D等,这些方法可用来研究蛋白质分子复性过程中构象的变化,特别用于鉴定折叠中间体和复性蛋白质的构象[12].3)色谱学方法 近几年人们利用蛋白质天然态和变性态色谱行为的差异来研究复性并用于复性蛋白质的检测如天然态、变性及复性蛋白质、折叠中间体等SEC上色谱保留体积的差异[15,18],反相高效液相色谱(RP-HP LC)检测活性和变性重组人粒细胞集落刺激因子包涵体蛋白的含量进而监测复性动态过程[32];4)粘度与浊度 蛋白质折叠状态不同,其溶解性存在一定差异,从而影响其粘度的变化,因此可通过测定溶液的浊度(常以600或400nm的光吸收值表示)来反映蛋白质聚集的快慢与程度;5)免疫学方法 利用酶联免疫、蛋白印迹法可以测定不同状态蛋白质的抗体-抗原结合力的差异,从而说明其空间构象状态;6)生物学活性及比活性测定 这是作为对最后的折叠状态评价的一个重要指标,一般是通过采用动物或细胞模型直接测定复性蛋白质所具有的生物学效应来表示.6 结束语随着越来越多的功能基因被发现和克隆,蛋白质异源表达将会越来越受到重视,如何使表达产物具有生物活性是决定该产物能否服务于人类健康和上游生物学家的努力是否有意义的根本条件,因此蛋白质体内外折叠机理的差异和体外高效复性技术必将倍受关注.参考文献:[1] 龙建银,王会信.外源基因在大肠杆菌中表达的研究进展[J].生物化学与生物物理进展,1997,24(2):126～131.[2] Wulfing C,Pluckthun A.Protein folding in the periplasm ofEscherichia coli.[J].M ol M icrobiol,1994,12(5):685～692.[3] Blight M A,H olland I B.Heterologus protein secretion and the ver2satile Escherichia coli haem olysin translocator[J].T rends in Biotech, 1994,12(11):450～455.[4] De Bernardez Clark E.Protein refolding for industrial process[J].Current Opinion in Biotechnology,2001,12:202～207.[5] G avit P,Better M.Production of antifungal recombinant peptides inE schericia coli[J].J Biotechnol,2000M,79:127～136.[6] Patra A K,Mukhopadhyay R,Muhhija R,et al.Optimization of in2clusion body s olubilization and renaturation of recombinant human growth horm one from Escherichia coli.[J].Protein Express Purif, 2000,18:182～192.[7] An finsen C B.Principles that g overn the folding of protein chains[J].Science,1973,181:223～230.[8] G oldberg M E,Rudolph R,Jaenicke R.A kinetic study of the com2petition between renaturation and aggregation during the refolding of denatured-reduced egg white lys ozyme[J].Biochemistry,1991,30: 2790～2797.[9] Ralph Z ahn,Ashley M B,Sarah P,et al.Chaperone activity andstructure of m onomeric polypeptide binding domains of G roE L[J].Proc Natl Acad Sci US A,1996,93:15024～15029.[10] M yriam M A,C onsuelo G,Lourival D P,et al.Oxidative refoldingchromatography:folding of the scorpion toxin Cn5[J].NatureBiotechnology,1999,17:187～191.[11] 徐明波,孟文华,马贤凯.PDI、PPI和分子伴侣催化重组人I L-2和G M-CSF的再折叠[J].中国科学B辑,1994,24:717～723.[12] R ozema D,G allman S H.Artificial chaperone-assisted refolding of 14 科 技 通 报19卷Denatured-reduced lys ozyme:m odulation of the com petition be2 tween renaturation and aggregation[J].Biochemistry,1996,35:15760～15771.[13] 刘晓光,董晓燕.分子伴侣与蛋白质复性的简介[J].化学工业与工程,2000,17(2):120～124.[14] Hagen A J,Hatton T A,W ang D I C.Protein refolding in reversemicelles[J].Biotech and Bioeng,1989,35:955～965.[15] Batas B,Chaudhuri J B.Protein refolding at high concentration us2ing size-exclusion chromatography[J].Biotech and Bioeng,1996,50:16～23.[16] Batas B,Chaudhuri J B.C onsideration of sam ple application and e2lution during size-exclusion chromatography-based protein refold2 ing[J].J Chromatography A,1999,864:229～236.[17] W emer M H.Refolding proteins by gel filtration chromatography[J].FE BS Lett,1994,345(2):125～130.[18] Müller C,Rinas U.Renaturation of heterodimeric platelet-derivedgrowth factor from inclusion bodies of recombinant Escherichia coliusing size-exclusion chromatography[J].J Chromatography A,1999,855:203～213.[19] Fahey E M,Chaudhuri J B.Refolding of low m olecular weighturokinase plasminogen activator by dilution and size exclusion chro2matography-a com parative study[J].Separation Science andT echnology,2000,35(11):1743～1760.[20] G eng X D,Chang X Q.H igh-performance hydrophobic interactionchromatography as a tool for protein refolding[J].J Chromatogra2 phy,1992,599:185～194.[21] Liu T,G eng X D.The separation efficiency of biopolymers withshort column in liquid chromatography[J].Chinese Chemical Let2ter,1999,10(3):219～212.[22] Suttnar J.Procedure for refolding and purification of recombinantfrom Escherichia coli inclusion bodies using a strong anion exchanger[J].J Chromatography B,1994,656(1):123～126.[23] Hamaker K H.Chromatography for rapid bu ffer exchange and refold2ing of secreatory leukocyte protease inhibitor[J].Biotech Prog,1996,12(2):184～189.[24] Z ahn R.Human prion proteins expressed in Escherichia coli and pu2rified by high affinity column refolding[J].FE BS letters,1997,417(3):400～404.[25] Y oshim oto M.Imm obilized lipos ome chromatography for studies ofprotein-membrane interactions and refolding of denatured bovinecarbonic anhydrase[J].J Chromatography B,1998,712:59～71.[26] 谷振宇,苏志国.蛋白质的层析折叠复性[J].化工学报,2000,51(S):325～329.[27] Z ardeneta G,H orowitz P M.Detergent,lipos ome and micelle-as2sisted protein refolding[J].Anal Biochem,1994,223:1～6. 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【专题讨论】超详细包涵体复性常见问题分析包涵体复性常见问题分析1. 对于尿素和盐酸胍该怎么选择?尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。
它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。
尿素溶解包涵体较盐酸胍慢而弱，溶解度为70-90%，尿素在作用时间较长或温度较高时会裂解形成氰酸盐，对重组蛋白质的氨基进行共价修饰，但用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀以及溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化等优点，故目前已被广泛采用。
盐酸胍溶解能力达95%以上，且溶解作用快而不造成重组蛋白质的共价修饰。
但它也有成本高、在酸性条件下易产生沉淀、复性后除去可能造成大量蛋白质沉淀和对蛋白质离子交换色谱有干扰等缺点。
2. 怎样洗涤包涵体？通常的洗涤方法一般是洗不干净的，可以先把包涵体用6M盐酸胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这就是梯度沉淀的方法，比通常的直接洗脱效果好。
3. 8M尿素溶解的包涵体溶液应如何保存?在4度放置半个月，都没什么问题。
在室温放置超过48小时，可能会对目的蛋白有影响，因为尿素在碱性条件下可使一些氨基酸酰基化，所以早些处理BI溶液比较好。
4. 包涵体复性有什么原则？低浓度，平缓梯度，低温。
5. 复性时的蛋白浓度是？一般使用浓度为0.1-1mg/ml，太高的浓度容易形成聚体沉淀，太低的浓度不经济，而且很多蛋白在低浓度时不稳定，很容易变性。
6. 复性中蛋白析出是怎么回事？该怎么处理？出现蛋白析出，肯定是条件变化太剧烈了。
复性应该采取复性液浓度和PH值逐渐变化的方法，例如根据包涵体的溶液成分，每隔1个PH或浓度值配置一种溶液，逐步透析到正常。
此外透析时必须浓度极低，条件温和，使蛋白质能够正确折叠。
但是复性的比率应该很低。
若加变性剂尿素可加到2M，盐酸胍可加到1-1.5M；另外可将甘油浓度增加，范围可在≤30%，且在复性样品中也可加适量甘油。
包涵体复性效率和检测复性是一个非常复杂的过程，除与蛋白质复性的过程控制相关外，还很大程度上与蛋白质本身的性质有关，有些蛋白非常容易复性，如牛胰RNA酶有12对二硫键，在较宽松的条件下复性效率可以达到95%以上，而有一些蛋白至今没有发现能够对其进行复性的方法如IL-11，很多蛋白的复性效率只有百分之零点几。
一般说来，蛋白质的复性效率在20%左右。
影响复性效率的因素有蛋白质的复性浓度，变性剂的起始浓度和去除速度、温度、pH、氧化还原电势、离子强度、共溶剂和其他添加剂的存在与否等。
根据具体的蛋白性质和需要，可以从生化、免疫、物理性质等方面对蛋白质的复性效率进行检测。
其效果检测方法如下：1. 凝胶电泳：一般可以用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳可以检测变性和天然状态的蛋白质，或用非还原的聚丙烯酰胺电泳检测有二硫键的蛋白复性后二硫键的配对情况。
2. 光谱学方法：可以用紫外差光谱、荧光光谱、圆二色性光谱（CD）等，利用两种状态下的光谱学特征进行复性情况的检测，但一般只用于复性研究中的过程检测。
3. 色谱方法：如IEX、RP-HPLC、CE等，由于两种状态的蛋白色谱行为不同。
4. 生物学活性及比活测定：一般用细胞方法或生化方法进行测定，较好的反映了复性蛋白的活性，值得注意的是，不同的测活方法测得的结果不同，而且常常不能完全反映体内活性。
5. 黏度和浊度测定：复性后的蛋白溶解度增加，变性状态时由于疏水残基暴露，一般水溶性很差，大多形成可见的沉淀析出。
6. 免疫学方法：如ELISA、WESTERN等，特别是对结构决定簇的抗体检验，比较真实的反映了蛋白质的折叠状态。
包涵体复性的方法一个有效的、理想的折叠复性方法应具备以下几个特点：活性蛋白质的回收率高；正确复性的产物易于与错误折叠蛋白质分离；折叠复性后应得到浓度较高的蛋白质产品；折叠复性方法易于放大；复性过程耗时较少。
1. 透析、稀释和超滤复性法：这三种方法是最传统也是应用最普遍的蛋白质折叠复性方法，复性活性回收率低，而且难于与杂蛋白分离。
透析法耗时长，易形成无活性蛋白质聚集体；超滤法在膜上聚集变性，易造成膜污染；稀释法处理量太大，不利于工业放大。
2. 凝胶过滤层析复性凝胶过滤层析复性又称体积排阻复性(SEC)，是一种广泛应用的层析技术。
与常用的稀释复性法相比，凝胶过滤层析复性能在高的起始蛋白浓度下对蛋白进行复性，活性回收率较高，同时又能使目标蛋白得到一定程度的纯化。
凝胶过滤复性时，除了蛋白质在胶粒中的传质和扩散外，蛋白质与介质之间并不发生其它任何作用。
复性过程始终发生在溶液中。
蛋白质在伸展状态中，每个蛋白质分子的伸展状态都会有差别，而不同伸展状态的蛋白质分子在凝胶颗粒内部扩散所受到的限制也不相同，有的会扩散入颗粒内部深一些，有的会浅一些，这使不同伸展状态的蛋白质分子达到一定程度的分离，这样蛋白质分子问相互作用的机会就大大减少，从而起到一定抑制凝集的作用；即使发生了部分凝集，凝集的蛋白质会附着在胶粒上，而不随着溶液向下运动，这样后面的变性剂可以赶上凝集的蛋白质，使其重新溶解并变性；并且在凝胶过滤中脲等变性剂脱除得相对较慢，这对有些蛋白质的复性是有利的。
在普通凝胶过滤中，变性剂和还原剂的脱除虽较稀释复性慢，但变性蛋白质仍会经历变性剂浓度突然变化的过程。
脲梯度复性是样品上柱前用复性缓冲液平衡柱子，接着使变性剂浓度递减(如从6M 盐酸胍或8M尿素下降到复性缓冲液中预先确定的变性剂的浓度)。
此法为蛋白质复性提供了一个较温和的环境，实现了线性去除变性剂，对高浓度变性蛋白质的复性效果十分显著。
对初始浓度为17mg／ml的还原变性溶菌酶，在40min内可以得到高达9O%的活性回收率。
此外在脲梯度SEC的基础上发展了pH和脲浓度双梯度SEC法用于蛋白复性，效果很好。
在SEC复性的基础上设计的连续基质辅助蛋白复性系统能使变性蛋白定量地转换成复性的天然态蛋白。
此复性方法能够将复性过程中产生的蛋白聚集体再次复性，使蛋白最大程度地得到回收。
伴侣溶剂塞(Chaperon solventplug)SEC复性法在一定程度上解决了变性蛋白进入柱顶端之前发生沉淀这一问题。
此外，抗体、小分子添加剂如L一精氨酸和环糊精等共价结合到SEC固定相上也可能会提高某些蛋白的复性效率，同时又能使这些物质得以重复利用，降低生产成本。
3. 高蛋白浓度下的复性方法：一个成功的复性过程在于能够在高蛋白浓度下仍能得到较高的复性率。
一个方法是把变性蛋白缓慢连续或不连续地加入到复性液中。
在两次蛋白加入之间，应有足够的时间间隔使蛋白质折叠通过了易聚集的中间体阶段。
这是由于完全折叠的蛋白通常不会与正在折叠的蛋白一起聚集。
第二种方法是用温度跳跃策略。
变性蛋白在低温下复性折叠以减少聚集，直到易聚集的中间体大都转化为不易聚集的后期中间体后，温度快速升高来促进后期中间体快速折叠为蛋白的天然构象。
第三种方法是复性在中等的变性剂浓度下进行，变性剂浓度应高到足以有效防止聚集，同时又必须低到能够引发正确复性。
4. 添加促进剂的复性方法：包涵体蛋白质折叠复性促进剂的促进作用可以分为：稳定正确折叠蛋白质的天然结构、改变错误折叠蛋白质的稳定性、增加折叠复性中间体的溶解性、增加非折叠蛋白质的溶解性。
通常使用的添加剂有：a) 共溶剂：如PEG6000~20000，通过与中间体特异的形成非聚集的复合物，可以阻止蛋白质分子间的相互碰撞机会，减少蛋白质的聚集；b) 去污剂及表面活性剂：如Trition X-100、CHAPs、磷脂、磺基甜菜碱等对蛋白质复性有促进作用，但它们能与蛋白质结合，很难去除；c) 氧化-还原剂：对于含有二硫键的蛋白，复性过程中应加入氧化还原体系，如GSH/GSSG、DTT/GSSG、DTE/GSSG 等，氧化还原系统通过促进不正确形成的二硫键快速交换反应，提高了正确配对的二硫键的产率；d) 小分子的添加剂：如盐酸胍或尿素、烷基脲、碳酸酰胺类等，都可阻止蛋白聚集，它们的作用可能为：稳定蛋白的活性状态、降低非正确折叠的稳定性、增加折叠中间体的稳定性、增加解折叠状态的稳定性。
e、0.4~0.6M L-Arg：L-Arg 能使得不正确折叠的蛋白质结构以及不正确连接的二硫键变得不稳定，使折叠向正确方向进行，可大幅度地提高包涵体蛋白质的折叠效率。
e) 添加分子伴侣和折叠酶：分子伴侣是指能够结合和稳定另外一种蛋白质的不稳定构象，并能通过有控制的结合和释放，促进新生多肽链的折叠、多聚体的装配或降解及细胞器蛋白的跨膜运输的一类蛋白质。
折叠酶有二硫键异构酶、脯氨酸异构酶等。
分子伴侣和折叠酶都能在体外调节蛋白质的正确折叠，提高蛋白质的合成效率。
但这类蛋白在折叠复性后要除去，而且十分昂贵，因此采用可回收利用的方法如固定化法为好。
f) 人工伴侣：为模仿分子伴侣而发展的一种方法：首先，变性蛋白被复性液中的去污剂捕获，形成蛋白-去污剂复合体，复合体的形成抑制了蛋白的聚集，然后加入环糊精从复合体中去除去污剂，使得蛋白质正确折叠。
g) 单克隆抗体：待折叠复性的蛋白质的抗体可有效协助复性，但只限于此蛋白才能获得明显的助折叠作用。
h) 其它：多聚离子化合物如肝素可以促进蛋白质的复性，具有稳定天然蛋白质的作用；甘油可以增加黏度，减少分子碰撞的机会，减少错配以提高复性效率；适量的盐浓度可以降低某些带电基团间的斥力，有利于蛋白质的折叠；辅助因子、短链醇、高渗物等能有效的降低聚集体的形成，对蛋白有稳定的作用。
5. 液相色谱（LC）复性法：液相色谱是一种最有效的纯化蛋白质的方法，已成为基因重组蛋白质纯化的必不可少的手段，现有报道，疏水相互作用色谱（HIC）、离子交换色谱（IEC）、凝胶排阻色谱（SEC）、亲和色谱（AFC）已成功的对变性蛋白进行了复性。
与传统的稀释法和透析法相比，液相色谱复性的优点是：a) 在进样后可很快的除去变性剂；b) 由于色谱固定相对变性蛋白质的吸附可明显的减少、甚至完全消除变性蛋白质分子在脱离变性剂环境后的分子聚集，从而避免了沉淀的产生，提高蛋白质复性的质量和活性回收率；包涵体形成原因及减少策略形成原因1. 表达量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。
原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。
2. 重组蛋白的氨基酸组成，一般说来含硫氨基酸越多越容易形成包涵体。
3. 重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。
4. 重组蛋白是大肠杆菌(Escherichia coli)的异源蛋白，由于缺少真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。