基因工程(基因工程的主要技术与原理-核苷酸序列分析)课件
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ddCTP
基因工程(基因工程的主要技术与原理核苷酸序列分析)
通过聚丙烯酰胺凝胶电 泳能分辨出小至一个碱基 长度差异的DNA片段,从 而将混合产物中不同长度 DNA片段分离开。
基因工程(基因工程的主要技术与原理核苷酸序列分析)
再通过放射自显影曝光, 根据片段尾部的双脱氧核 苷酸读出该DNA的碱基排列 顺序。
该方法以待测DNA为模板，在DNA聚合酶的 催化作用下合成新的DNA链；
反应体系中除含有四种脱氧核苷酸(dATP、 dCTP、dGTP和dTTP)外，加入了一种双脱氧 核苷酸(*ddATP或*ddCTP或*ddGTP或*ddTTP)。
基因工程(基因工程的主要技术与原理核苷酸序列分析)
在DNA合成过程中，标记的*ddNTP将与相应的 dNTP竞争掺入到新合成的DNA互补链中。
基因工程(基因工程的主要技术与原理核苷酸序列分析)
5´-磷酸核苷酸的基本结构
基因工程(基因工程的主要技术与原理核苷酸序列分析)
(一)基本原理
在DNA聚合酶的作用下，双脱氧核苷酸分子 可以象正常核苷酸一样参与DNA合成；
但是，由于它自身3′位置-OH的缺失，至使下 位核苷酸的5′磷酸基无法与之结合，从而导致反 应终止，并产生长度不一的DNA片段。
通过凝胶电泳分离，放射自显影确定DNA片段 末端的碱基，进而推断DNA的核苷酸序列。
基因工程(基因工程的主要技术与原理核苷酸序列分析)
5´ 3´
5´ 3´
5´ 3´
正常的DNA合成反应基因工程(基因工程d的dN主T要P技掺术与入原到理-DNA合成反应后导致反应终止
核苷酸序列分析)
基于双脱氧核苷酸的这种特性，Sanger于 1977年建立了以双脱氧链终止反应为基础来 测定DNA序列的方法；
如果是dNTP掺入其中，DNA互补链则将继续延 伸下去；如果是*ddNTP掺入其中，DNA互补链的 合成则到此终止.而双脱氧核苷酸的掺入是随机 的，故各个新生DNA片段的长度互不相同。
基因工程(基因工程的主要技术与原理核苷酸序列分析)
H
ddNTP
基因工程(基因工程的主要技术与原理核苷酸序列分析)
ddATP
基因工程(基因工程的主要技术与原理核苷酸序列分析)
(二) 序列分析的基本步骤
模板变性(dnature template)：将待测DNA模板 与引物混合，通过加热使模板变性； 退火(annealing)：将变性的模板与引物混合物 缓慢降温，使引物与模板结合；
3. 分离：通过凝胶电泳分离片段群；
4. 推导：再经放射线自显影，确定各片段末端碱基， 从而得出目的DNA的碱基序列。
基因工程(基因工程的主要技术与原理核苷酸序列分析)
凝胶电泳分离，放射线自显影分析
G A+G C+T C 3′
5′ 5′ C T T基因T工T程(基T因T工程G的G主要G技术C与原T理T- A G C 3′
变性
(放射性自显影只显示标记的单链)
C C+T
特异性切割
基因工程(基因工程的主要技术与原理核苷酸序列分析)
G A+G C+T C
凝胶电泳分离， 放射自显影确 定末端碱基。
基因工程(基因工程的主要技术与原理核苷酸序列分析)
(二)基本步骤
1. 标记：将待测DNA片段的5‘端磷酸基作放射性标记；
2. 裂解：修饰和裂解特定碱基，随机产生一端被标记的、 起始位点相同的、不同长度的、以不同碱基结 尾的DNA片段群；
基因工程(基因工程的主要技术与原理核苷酸序列分析)
来自百度文库
Maxam-Gilbert化学降解法的缺陷：
操作繁琐； 化学试剂毒性较大； 放射性同位素标记效率偏低，放射自显影
曝光时间长； 人工读取数据费时费力；
基因工程(基因工程的主要技术与原理核苷酸序列分析)
二、双脱氧链终止法
1977年，英国的F.Sanger充分利用DNA复 制的生物学特性，设计了一种通过DNA复制 来识别4种碱基的方法，即双脱氧链终止测 序方法(dideoxy chain termination)或称 Sanger酶学法。
核苷酸序列分析)
(三) 化学降解法的应用
Maxam-Gilbert化学降解法的测序长度大约为250个 碱基，适合G+C含量较高及较短的寡核苷酸片段的 测序；
从DNA两端分别测定同一条DNA核苷酸序列，相互 参照测定结果，可以得到准确的核苷酸序列；
Maxam-Gilbert化学降解法不需要进行酶催化反应， 因此，不会产生由于酶催化反应而带来的误差；
基因工程(基因工程的主要技术与原理核苷酸序列分析)
核心原理：
利用特定的化学试剂对不同碱基进行特异 性切割。
硫酸二甲酯： 哌啶甲酸： 肼+NaCl： 肼：
G G和A C T和C
基因工程(基因工程的主要技术与原理核苷酸序列分析)
5′ 3′
G A+G
3′ 5′
待测DNA
放射性标记5′末端 R
限制性酶切
生物技术专业核心课程
基因工程
淮阴师范学院 高清松
基因功能的研究是生命科学中的主要课题； 其首要条件是获知目的基因的核苷酸排列顺 序，即基因测序。 基因测序是基因 操作中最基本的技 术之一。
基因工程(基因工程的主要技术与原理核苷酸序列分析)
第四节 DNA核苷酸序列分析 (Nucleotide sequence analysis)
基因工程(基因工程的主要技术与原理核苷酸序列分析)
基因测序方法
Maxam-Gilbert 化学降解法 双脱氧链终止法(Sanger 酶解法)
基因工程(基因工程的主要技术与原理核苷酸序列分析)
一、Maxam-Gilbert 化学降解法
1977年，A. M. Maxam和W. Gilbert首先 建立了 DNA片段序列的测定方法，由于该方 法是用特定化学试剂修饰不同碱基，并在相 应碱基处切断DNA片段而进行系列分析的,故 称之为Maxam-Gilbert化学降解法。
基因工程(基因工程的主要技术与原理核苷酸序列分析)
(一)基本原理
将一个DNA片段的5‘端磷酸基作放射性标记 ；分别采用不同的化学试剂修饰和裂解特定碱 基，从而产生一系列长度不一而5‘端被标记的 DNA片段；
通过凝胶电泳分离这些以特定碱基结尾的片 段群，再经放射自显影，就可确定各片段末端 碱基，从而得出目的DNA的碱基序列。
基因工程(基因工程的主要技术与原理核苷酸序列分析)
通过聚丙烯酰胺凝胶电 泳能分辨出小至一个碱基 长度差异的DNA片段,从 而将混合产物中不同长度 DNA片段分离开。
基因工程(基因工程的主要技术与原理核苷酸序列分析)
再通过放射自显影曝光, 根据片段尾部的双脱氧核 苷酸读出该DNA的碱基排列 顺序。
该方法以待测DNA为模板，在DNA聚合酶的 催化作用下合成新的DNA链；
反应体系中除含有四种脱氧核苷酸(dATP、 dCTP、dGTP和dTTP)外，加入了一种双脱氧 核苷酸(*ddATP或*ddCTP或*ddGTP或*ddTTP)。
基因工程(基因工程的主要技术与原理核苷酸序列分析)
在DNA合成过程中，标记的*ddNTP将与相应的 dNTP竞争掺入到新合成的DNA互补链中。
基因工程(基因工程的主要技术与原理核苷酸序列分析)
5´-磷酸核苷酸的基本结构
基因工程(基因工程的主要技术与原理核苷酸序列分析)
(一)基本原理
在DNA聚合酶的作用下，双脱氧核苷酸分子 可以象正常核苷酸一样参与DNA合成；
但是，由于它自身3′位置-OH的缺失，至使下 位核苷酸的5′磷酸基无法与之结合，从而导致反 应终止，并产生长度不一的DNA片段。
通过凝胶电泳分离，放射自显影确定DNA片段 末端的碱基，进而推断DNA的核苷酸序列。
基因工程(基因工程的主要技术与原理核苷酸序列分析)
5´ 3´
5´ 3´
5´ 3´
正常的DNA合成反应基因工程(基因工程d的dN主T要P技掺术与入原到理-DNA合成反应后导致反应终止
核苷酸序列分析)
基于双脱氧核苷酸的这种特性，Sanger于 1977年建立了以双脱氧链终止反应为基础来 测定DNA序列的方法；
如果是dNTP掺入其中，DNA互补链则将继续延 伸下去；如果是*ddNTP掺入其中，DNA互补链的 合成则到此终止.而双脱氧核苷酸的掺入是随机 的，故各个新生DNA片段的长度互不相同。
基因工程(基因工程的主要技术与原理核苷酸序列分析)
H
ddNTP
基因工程(基因工程的主要技术与原理核苷酸序列分析)
ddATP
基因工程(基因工程的主要技术与原理核苷酸序列分析)
(二) 序列分析的基本步骤
模板变性(dnature template)：将待测DNA模板 与引物混合，通过加热使模板变性； 退火(annealing)：将变性的模板与引物混合物 缓慢降温，使引物与模板结合；
3. 分离：通过凝胶电泳分离片段群；
4. 推导：再经放射线自显影，确定各片段末端碱基， 从而得出目的DNA的碱基序列。
基因工程(基因工程的主要技术与原理核苷酸序列分析)
凝胶电泳分离，放射线自显影分析
G A+G C+T C 3′
5′ 5′ C T T基因T工T程(基T因T工程G的G主要G技术C与原T理T- A G C 3′
变性
(放射性自显影只显示标记的单链)
C C+T
特异性切割
基因工程(基因工程的主要技术与原理核苷酸序列分析)
G A+G C+T C
凝胶电泳分离， 放射自显影确 定末端碱基。
基因工程(基因工程的主要技术与原理核苷酸序列分析)
(二)基本步骤
1. 标记：将待测DNA片段的5‘端磷酸基作放射性标记；
2. 裂解：修饰和裂解特定碱基，随机产生一端被标记的、 起始位点相同的、不同长度的、以不同碱基结 尾的DNA片段群；
基因工程(基因工程的主要技术与原理核苷酸序列分析)
来自百度文库
Maxam-Gilbert化学降解法的缺陷：
操作繁琐； 化学试剂毒性较大； 放射性同位素标记效率偏低，放射自显影
曝光时间长； 人工读取数据费时费力；
基因工程(基因工程的主要技术与原理核苷酸序列分析)
二、双脱氧链终止法
1977年，英国的F.Sanger充分利用DNA复 制的生物学特性，设计了一种通过DNA复制 来识别4种碱基的方法，即双脱氧链终止测 序方法(dideoxy chain termination)或称 Sanger酶学法。
核苷酸序列分析)
(三) 化学降解法的应用
Maxam-Gilbert化学降解法的测序长度大约为250个 碱基，适合G+C含量较高及较短的寡核苷酸片段的 测序；
从DNA两端分别测定同一条DNA核苷酸序列，相互 参照测定结果，可以得到准确的核苷酸序列；
Maxam-Gilbert化学降解法不需要进行酶催化反应， 因此，不会产生由于酶催化反应而带来的误差；
基因工程(基因工程的主要技术与原理核苷酸序列分析)
核心原理：
利用特定的化学试剂对不同碱基进行特异 性切割。
硫酸二甲酯： 哌啶甲酸： 肼+NaCl： 肼：
G G和A C T和C
基因工程(基因工程的主要技术与原理核苷酸序列分析)
5′ 3′
G A+G
3′ 5′
待测DNA
放射性标记5′末端 R
限制性酶切
生物技术专业核心课程
基因工程
淮阴师范学院 高清松
基因功能的研究是生命科学中的主要课题； 其首要条件是获知目的基因的核苷酸排列顺 序，即基因测序。 基因测序是基因 操作中最基本的技 术之一。
基因工程(基因工程的主要技术与原理核苷酸序列分析)
第四节 DNA核苷酸序列分析 (Nucleotide sequence analysis)
基因工程(基因工程的主要技术与原理核苷酸序列分析)
基因测序方法
Maxam-Gilbert 化学降解法 双脱氧链终止法(Sanger 酶解法)
基因工程(基因工程的主要技术与原理核苷酸序列分析)
一、Maxam-Gilbert 化学降解法
1977年，A. M. Maxam和W. Gilbert首先 建立了 DNA片段序列的测定方法，由于该方 法是用特定化学试剂修饰不同碱基，并在相 应碱基处切断DNA片段而进行系列分析的,故 称之为Maxam-Gilbert化学降解法。
基因工程(基因工程的主要技术与原理核苷酸序列分析)
(一)基本原理
将一个DNA片段的5‘端磷酸基作放射性标记 ；分别采用不同的化学试剂修饰和裂解特定碱 基，从而产生一系列长度不一而5‘端被标记的 DNA片段；
通过凝胶电泳分离这些以特定碱基结尾的片 段群，再经放射自显影，就可确定各片段末端 碱基，从而得出目的DNA的碱基序列。