干扰素的工艺制备流程 ppt课件
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干扰素生产工艺(共45张PPT)
第二十八页，共45页。
3.4．菌体收集
连续流离心机：冷却的发酵液，16000 r/min离心收集。菌体保存：－20℃冰柜，不超过12个月。检测：干扰素含量、菌体蛋白含量、菌体枯燥失重、质粒结构一致性、质粒稳定性。
第二十九页，共45页。
4 干扰素的别离纯化工艺过程
4.1、干扰素别离工艺过程 4.2、干扰素的纯化工艺过程
第十页，共45页。
免疫调节活性机制
对巨噬细胞的作用：IFNγ可使巨噬细胞外表MHCⅡ类分子的表达增加，增强其抗原递呈能力；此外还能增强巨噬细胞外表表达Fc受体，促进巨噬细胞吞噬免疫复合物、抗体包被的病原体和肿瘤细胞。对淋巴细胞的作用：干扰素对淋巴细胞的作用较为复杂，可受剂量和时间等因素的影响而产生不同的效应。在抗原致敏之前使用大剂量干扰素或将干扰素与抗原同时投入会产生明显的免疫抑制作用；而低剂量干扰素或在抗原致敏之后参加干扰素那么能产生免疫增强的效果。在适宜的条件下，IFNγ对B细胞和CD8+T细胞的分化有促进作用，但不能促进其增殖。IFNγ能增强TH1细胞的活性，增强细胞免疫功能；但对TH2细胞的增殖有抑制作用，因此抑制体液免疫功能。IFNγ不仅抑制TH2细胞产生IL-4，而且抑制IL-4对B细胞的作用，特别是抑制B细胞生成IgE。
第三十四页，共45页。
〔4〕初级别离
盐析: 4M硫酸铵，2℃～10℃，搅匀,静置过夜。离心：连续流离心机，16000 r/min保存：收集沉淀，粗干扰素，4℃保存。
第三十五页，共45页。
4.2、干扰素纯化工艺过程
溶解粗干扰素沉淀与疏水层析阴离子交换层析与浓缩阳离子交换层析与浓缩凝胶过滤层析无菌过滤分装
第十二页，共45页。
1.5.干扰素生产工艺路线〔1〕
基因工程药物之干扰素的制备流程课件
基因工程药物的应用领域
肿瘤治疗
基因工程药物在肿瘤治疗 中发挥了重要作用，如干 扰素、白细胞介素等免疫 调节，基因工 程药物提供了有效的治疗 手段，如囊性纤维化、血 友病等。
抗病毒治疗
针对某些病毒性疾病，基 因工程药物可以起到抗病 毒和免疫调节的作用，如 艾滋病、肝炎等。
干扰素的临床应用与疗效
干扰素在临床上主要用于治疗病 毒性感染、肿瘤以及一些自身免
疫性疾病。
通过注射或雾化吸入给药，干扰 素可有效抑制病毒复制，缓解疾 病症状，提高患者生存率和生活
质量。
然而，干扰素也存在一些副作用 ，如发热、肌肉酸痛、肝肾功能 异常等，需要在医生的指导下合
理使用。
03
基因工程制备干扰素的流程
目的基因的表达
在培养条件下，目的基因在细胞内表达，产生相应的蛋白质或核酸产物。
干扰素的分离纯化
分离方法
采用离心、过滤、萃取等方法，将目 的产物从细胞培养液中分离出来。
纯化方法
通过凝胶电泳、色谱技术（如离子交 换、亲和、排阻等）、超滤等方法， 将目的产物进行纯化。
04
干扰素的质量控制与安全性评 价
。
免疫学评价
检测干扰素对机体免疫系统的影响 ，如免疫原性、抗体产生情况等， 以评估其免疫安全性。
不良反应监测
对临床使用过程中出现的不良反应 进行监测和记录，及时处理并分析 原因，确保患者用药安全。
干扰素的稳定性研究
温度稳定性
研究干扰素在不同温度下的稳定性， 确定其保存、运输和使用的适宜温度 范围。
极具挑战性。
生产成本高
基因工程药物的生产通常需要昂 贵的设备和精细的工艺控制，这 导致了干扰素的生产成本居高不
下。
【完整版】重组干扰素-α 生物制药工艺学PPT文档
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ挑取单菌落于液体ypdzeocin100mgml培养基中300rmin30培养至od600为15取1ml稀释至100ml同样培养基中振荡培养至od6007000rmin4离心15分钟取上清液经硫胺盐析浓缩透析用无菌水5ml溶解后以125的分离胶做sdspage分析
重组干扰素-α
演讲：谢思思 PPT制作：朱宇婷、张芳芳 资料查找：陈雪梅、方琦璐、钱媛 媛、夏烽、董敏健、袁海剑
感谢观看
IFNα-2b简介
IFNα-2b是苏黎世大学Charles Weissmann实验室最新发现的抗病毒 药物，由Biogen公司发展的，最终由Schering-Plough公司出品，商品名 为Intron-A。它应用于多种适应症，包括病毒性感染和肿瘤。它被批准用 于乙、丙型肝炎、毛细胞白血病、多发性骨髓瘤、滤泡性淋巴瘤、良性 肿瘤和恶性黑色素瘤的治疗等的治疗。
干扰素（IFN)简介
• 干扰素是由多种细胞产生的一组蛋白质类细胞因子，具有广泛的 抗病毒，抗肿瘤免疫调节活性，是人体防御系统的重要组成部分。 根据其来源、分子结构和抗原性的差异分为α,β,γ,ω四个类型。α 型干扰素又依其结构的不同再分为α-1b, α-2a, α-2b等亚型，其具 体表现在个别氨基酸的差异上。我们要具体讲讲rhIFN α-2b的生产 工艺设计。
来源于维基百科 理化性质：
分子量：19247 结构特点：四个Cys残基，形成两个二硫键
无糖基化位点 PI:5-6 在的溶液中稳定，对热也稳定 对各种蛋白酶敏感，比活为2X10^8 IU/mg
制备工艺路线：
制备工艺过程
• 基因的制备 • 构建重组质粒 • 酵母转化 • 发酵及表达产物的SDS-PAGE分析 • 样品的纯化
重组干扰素-α
演讲：谢思思 PPT制作：朱宇婷、张芳芳 资料查找：陈雪梅、方琦璐、钱媛 媛、夏烽、董敏健、袁海剑
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IFNα-2b简介
IFNα-2b是苏黎世大学Charles Weissmann实验室最新发现的抗病毒 药物，由Biogen公司发展的，最终由Schering-Plough公司出品，商品名 为Intron-A。它应用于多种适应症，包括病毒性感染和肿瘤。它被批准用 于乙、丙型肝炎、毛细胞白血病、多发性骨髓瘤、滤泡性淋巴瘤、良性 肿瘤和恶性黑色素瘤的治疗等的治疗。
干扰素（IFN)简介
• 干扰素是由多种细胞产生的一组蛋白质类细胞因子，具有广泛的 抗病毒，抗肿瘤免疫调节活性，是人体防御系统的重要组成部分。 根据其来源、分子结构和抗原性的差异分为α,β,γ,ω四个类型。α 型干扰素又依其结构的不同再分为α-1b, α-2a, α-2b等亚型，其具 体表现在个别氨基酸的差异上。我们要具体讲讲rhIFN α-2b的生产 工艺设计。
来源于维基百科 理化性质：
分子量：19247 结构特点：四个Cys残基，形成两个二硫键
无糖基化位点 PI:5-6 在的溶液中稳定，对热也稳定 对各种蛋白酶敏感，比活为2X10^8 IU/mg
制备工艺路线：
制备工艺过程
• 基因的制备 • 构建重组质粒 • 酵母转化 • 发酵及表达产物的SDS-PAGE分析 • 样品的纯化
基因工程制取干扰素ppt课件
• 3、碱裂解法 １）将冼过的500ml 培养物的细菌沉淀物[ 来自收获细菌的步骤3] 重悬于10ml （18ml）溶液Ｉ中。 溶液Ｉ: 50mmol/L葡萄糖 25mmol/L Tris.Cl(pH8.0) 10mmol/L EDTA(pH8.0) 溶液Ｉ可成批配制，在10 lbf/in2(6.895x104Pa)高压下蒸气灭菌15分钟，贮存 于４℃。 ２）加1ml(2ml)新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml,溶于10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)] 。当溶液的pH值低于8.0时，溶菌酶不能有效工作。 ３）加20ml(40ml)新配制的溶液Ⅱ。 溶液Ⅱ: 0.2mol/L NaOH(临用前用10mol/L贮存液现用现稀释） 1％SDS 盖紧瓶盖，缓缓颠倒离心瓶数次，以充分混匀内容物。于室温放置5-10分钟 。
基因工程制取干扰素
将目的基因克隆到大肠杆 菌中的重要操作步骤：
目的基因的分离
目的基因与克隆 载体的体外重组
克隆载体
→
重组体导入大肠杆菌K12
→
重组质粒
受体菌的培养及筛选
→
从受体菌中获取目的基因
表达载体
导入大肠杆菌
受体菌的筛选，表达性、稳定性等检测
→
工程菌
一、目的基因的分离
1、总 RNA 的提取 RNA 提取方法：Trizol法 2.mRNA 的分离 （注意事项） 将生产干扰素的人白细胞的mRNA分级分离然 后进行凝胶电泳切取相对分子质量为256bp的 部分
• •
•
2、感受态细胞（大肠杆菌k12）的制备 ( CaCl2 法，亦可直接购买)--注意事项 （1）、将培养液分转入1.5ml的离心管中（一管10ml菌液可分装成约6管1.5ml的 离心管中）,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟。 （2）、弃去上清,用预冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液200微升轻轻悬浮细胞,冰上放 置30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。 （3）、弃去上清,加入200微升预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬 浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。 3、转化-注意事项： a、全量（20 μl）加入至100 μl 感受态细胞中，冰中放置30分钟。 b、42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。 c、加入890 μl AMP阴性培养基，37℃振荡培养60分钟。取100μl铺板 （注意加 AMP时的温度,温度过高,会使克隆株无法筛选出来 ，另，铺板前后注意用吹风 机吹干 ）。
干扰素制备的工艺流程1
基因工程药物的制造实例
什么是干扰素？
❖ 概念(interferon,IFN)：机体免 疫细胞产生的一类细胞因子，是 机体受到病毒感染时，免疫细胞 通过抗病毒应答反应而产生的一 组结构类似、功能接近的生物调 节蛋白。
干扰素的作用？
❖ 一、抗增生作用：这是干扰素能用于治疗多种肿瘤 的原因。 二、抗病毒作用：当我们的机体感染病毒时，体内 会产生大量的干扰素。 三、免疫调节作用 四、抗纤维化作用 五、干扰素还有抗新血管增生、促进细胞凋亡等多 种功能
❖ 干扰素是目前最主要的抗病毒感染和抗肿瘤生物制 品。
·
干扰素的合成
❖ 一、基因工程菌的组建 1、如何构建基因工程菌？也就是DNA重组
克隆单元操作步骤。 切、接、转、增、检
2、切之前还需要做什么？ 获取目的cDNA
❖ 1、干扰素cDNA的获得
全RNA
寡dT—纤维柱
mRNA
产生干扰素的白细胞
5%~23%蔗 糖密度梯度 离心提取12
精提
冻干
成品检定
成品包装
(P73)
制备的过程及要求： （1）发酵 （2）产物提取纯化 （3）质量控制标准和要求（P74）
❖ 小故事
❖ 抉择
一个农民从洪水中救起了他的妻子，他的孩子 却被淹死了。
事后，人们议论纷纷。有的说他做得对，因为 孩子可以再生一个，妻子却不能死而复活。有的说 他做错了，因为妻子可以另娶一个，孩子却不能死 而复活。
❖ 感悟：很多事情根本没有错与对，也容 不得你去细想错与对，如果过于犹豫或过于 在乎别人的想法，你可能什么事也做不成。
我听了人们的议论，也感到疑惑难决：如果只 能救活一人，究竟应该救妻子呢，还是救孩子?
于是我去拜访那个农民，问他当时是怎么想的 。
什么是干扰素？
❖ 概念(interferon,IFN)：机体免 疫细胞产生的一类细胞因子，是 机体受到病毒感染时，免疫细胞 通过抗病毒应答反应而产生的一 组结构类似、功能接近的生物调 节蛋白。
干扰素的作用？
❖ 一、抗增生作用：这是干扰素能用于治疗多种肿瘤 的原因。 二、抗病毒作用：当我们的机体感染病毒时，体内 会产生大量的干扰素。 三、免疫调节作用 四、抗纤维化作用 五、干扰素还有抗新血管增生、促进细胞凋亡等多 种功能
❖ 干扰素是目前最主要的抗病毒感染和抗肿瘤生物制 品。
·
干扰素的合成
❖ 一、基因工程菌的组建 1、如何构建基因工程菌？也就是DNA重组
克隆单元操作步骤。 切、接、转、增、检
2、切之前还需要做什么？ 获取目的cDNA
❖ 1、干扰素cDNA的获得
全RNA
寡dT—纤维柱
mRNA
产生干扰素的白细胞
5%~23%蔗 糖密度梯度 离心提取12
精提
冻干
成品检定
成品包装
(P73)
制备的过程及要求： （1）发酵 （2）产物提取纯化 （3）质量控制标准和要求（P74）
❖ 小故事
❖ 抉择
一个农民从洪水中救起了他的妻子，他的孩子 却被淹死了。
事后，人们议论纷纷。有的说他做得对，因为 孩子可以再生一个，妻子却不能死而复活。有的说 他做错了，因为妻子可以另娶一个，孩子却不能死 而复活。
❖ 感悟：很多事情根本没有错与对，也容 不得你去细想错与对，如果过于犹豫或过于 在乎别人的想法，你可能什么事也做不成。
我听了人们的议论，也感到疑惑难决：如果只 能救活一人，究竟应该救妻子呢，还是救孩子?
于是我去拜访那个农民，问他当时是怎么想的 。
干扰素的工艺制备流程39页PPT
谢谢！
51、 天 下 之 事 常成 于困约 ，而败 于奢靡 。——陆 游 52、 生 命 不 等 于是呼 吸，生 命是活 动。——卢 梭
53、 伟 大 的 事ຫໍສະໝຸດ 业，需 要决心 ，能力 ，组织 和责任 感。 ——易 卜 生 54、 唯 书 籍 不 朽。——乔 特
55、 为 中 华 之 崛起而 读书。 ——周 恩来
干扰素的工艺制备流程
1、合法而稳定的权力在使用得当时很 少遇到 抵抗。 ——塞 ·约翰 逊 2、权力会使人渐渐失去温厚善良的美 德。— —伯克
3、最大限度地行使权力总是令人反感 ；权力 不易确 定之处 始终存 在着危 险。— —塞·约翰逊 4、权力会奴化一切。——塔西佗
5、虽然权力是一头固执的熊，可是金 子可以 拉着它 的鼻子 走。— —莎士 比
基因工程药物之干扰素的制备流程课件
基因工程药物之干扰素的制备流程课件•引言•基因工程药物制备基础•干扰素制备流程详解•质量控制与安全性评估目•临床应用与市场前景•总结与展望录干扰素的基因克隆与表达目的基因的获取从人或动物细胞中提取干扰素基因，或通过化学合成方法获得。
基因克隆将目的基因插入到合适的载体中，如质粒、病毒等，构建重组DNA分子。
基因表达将重组DNA分子导入到宿主细胞中，如大肠杆菌、哺乳动物细胞等，进行基因表达，产生干扰素蛋白。
通过机械、化学或酶解等方法破碎细胞，释放干扰素蛋白。
细胞破碎初步纯化高度纯化利用离心、过滤、层析等技术对干扰素蛋白进行初步纯化，去除杂质和宿主细胞蛋白。
通过高效液相色谱、凝胶过滤层析等技术对干扰素蛋白进行高度纯化，获得高纯度的干扰素制品。
030201干扰素的分离纯化干扰素的制剂与质量控制制剂工艺将纯化后的干扰素蛋白进行制剂加工，如冻干、分装等，制备成适合临床使用的干扰素制剂。
质量控制对干扰素制剂进行质量检测和控制，包括外观、纯度、活性、安全性等方面的检测，确保产品质量符合规定标准。
基因工程药物是指利用基因工程技术生产的药物，包括基因重组蛋白质、基因治疗剂、基因疫苗等。
具有高效、特异性强、安全性高等优点，已成为现代医药产业的重要组成部分。
基因工程药物概述特点定义干扰素介绍定义干扰素是一类具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等多种生物活性的蛋白质，是机体天然免疫的重要组成部分。
分类根据结构和功能不同，干扰素可分为α、β、γ等多种类型，其中α-干扰素是临床上应用最广泛的一种。
制备流程研究背景随着重组DNA技术的不断发展，利用基因工程技术生产干扰素已成为可能。
市场需求干扰素具有广泛的临床应用价值，市场需求量大，因此研究其制备流程具有重要意义。
基因重组通过体外DNA重组技术，将目的基因与载体DNA进行切割、拼接，构建重组DNA分子。
基因表达将重组DNA分子导入宿主细胞，利用宿主细胞的转录和翻译系统，表达出具有特定生物学活性的蛋白质分子。
干扰素制备的工艺流程图课件
干扰素的制备流程
•
PPT学习交流
1
干扰素
什么是干扰素?
• 概念(interferon,IFN):机体免疫细胞产生的一类细胞因 子,是机体受到病毒感染时,免疫细胞通过抗病毒应答反 应而产生的一组结构类似、功能接近的生物调节蛋白。
• 根据分子结构和抗原性的差异分为α、β、γ、ω等4个 类型。
• α干扰素又依其结构分为α1b、α2a、α2b等亚型
成的沉淀应包括染体DNA、高分子量RNA和钾-SDS-蛋白质-膜复合
5）用合适转头于4 ℃以4000转/分离心15分钟，不开刹车而使转头自
转。如果细 菌碎片贴壁不紧，可以5000转/分再度离心20分钟，然后
能将上清全部转到另一瓶中，弃去残留在离心管内的粘稠状液体。未
成致密沉淀块原因通常是由于溶液Ⅲ与细菌裂解物混合不充分。
提取重组质
粒③
4）加15ml(20ml)用冰预冷的溶液Ⅲ。
溶液Ⅲ：5mol/L 乙酸钾60ml 冰乙酸 11.5ml 水 28.5ml
所配制的的溶液对钾是3mol/L,对乙酸跟是5mol/L。
封住瓶口，摇动离心瓶数次以混匀内容物，此时应不再出现分明
个液相。置冰 上放10分钟，应形成一白色絮状沉淀。于0 ℃放置后
2、细菌的收获和裂解
1）用合适转头于4℃以4000转/分离心15分钟,弃上清,敞开离心管口并倒置离心管
部流尽。
2）将细菌沉淀重悬于100ml用冰预冷的STE中。
STE 0.1mol/L NaCl
10mmol/L Tris.Cl(Ph8.0)
1mmol/L EDTA(Ph8.0)
按步骤1）所述方法离心，以收集细菌细胞。
PPT学习交流
6
目的基因与克隆载体进行体 外重组
•
PPT学习交流
1
干扰素
什么是干扰素?
• 概念(interferon,IFN):机体免疫细胞产生的一类细胞因 子,是机体受到病毒感染时,免疫细胞通过抗病毒应答反 应而产生的一组结构类似、功能接近的生物调节蛋白。
• 根据分子结构和抗原性的差异分为α、β、γ、ω等4个 类型。
• α干扰素又依其结构分为α1b、α2a、α2b等亚型
成的沉淀应包括染体DNA、高分子量RNA和钾-SDS-蛋白质-膜复合
5）用合适转头于4 ℃以4000转/分离心15分钟，不开刹车而使转头自
转。如果细 菌碎片贴壁不紧，可以5000转/分再度离心20分钟，然后
能将上清全部转到另一瓶中，弃去残留在离心管内的粘稠状液体。未
成致密沉淀块原因通常是由于溶液Ⅲ与细菌裂解物混合不充分。
提取重组质
粒③
4）加15ml(20ml)用冰预冷的溶液Ⅲ。
溶液Ⅲ：5mol/L 乙酸钾60ml 冰乙酸 11.5ml 水 28.5ml
所配制的的溶液对钾是3mol/L,对乙酸跟是5mol/L。
封住瓶口，摇动离心瓶数次以混匀内容物，此时应不再出现分明
个液相。置冰 上放10分钟，应形成一白色絮状沉淀。于0 ℃放置后
2、细菌的收获和裂解
1）用合适转头于4℃以4000转/分离心15分钟,弃上清,敞开离心管口并倒置离心管
部流尽。
2）将细菌沉淀重悬于100ml用冰预冷的STE中。
STE 0.1mol/L NaCl
10mmol/L Tris.Cl(Ph8.0)
1mmol/L EDTA(Ph8.0)
按步骤1）所述方法离心，以收集细菌细胞。
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6
目的基因与克隆载体进行体 外重组
发酵产品---干扰素ppt课件
(2)培养基组成
种子培养基的营养成分宜丰富些，尤其是氮 源的含量应较高(即C/N低)。相反，对于发 酵培养基，氮源含量应比种子培养基稍低 (即C/N高)。
(3)溶解氧
基因工程菌发酵要求培养液中有足够的溶 解氧，为了提高发酵罐的供氧能力，往往 需要增大搅拌转速，增加空气流量，或通 入纯氧
(4)温度
1
干扰素概述
2
生产干扰素的菌种
发酵工艺过程 发酵过程控制
3
4 5
分离纯化过程
干扰素α-2b的发酵工艺过程：
取保存工作种子批菌种，室温融化 1.接种：接入50L种子罐，接种 连续流离心机：冷却的发酵液， 1.接种：通入300L培养基的发酵罐，接种量 摇瓶培养：30 ，pH7.0 ，250 量℃ 10% 。 16000 r/min 离心收集。 10%。 r/min，18±2. 2h 培养：30 菌体保存：－ 20 ℃ 冰柜，不超过 12℃ 个，pH7.0。 2.控制：级联调节通气量和搅拌转速。 检测：OD值和发酵液杂菌检查。 3.控制：级联调节通气量和搅拌 月。 3.前4h：30℃，pH7.0，DO为30%。 转速 检测：干扰素含量、菌体蛋白含量、 4.4h后：20℃，pH6.0，DO为60%，5～6.5h。 4.DO为30%，3～4h，OD>4.0。 菌体干燥失重、质粒结构一致性、质 5.终点控制：OD值达9.0±1.0，5℃冷却水快 5.检测：显微镜和LB培养基划 速降温至15℃以下。 粒稳定性。 线检查，控制杂菌。 6.检测：发酵液杂菌检查
溶解粗干扰素 沉淀除杂质 疏水层析 无菌过滤分装
溶解粗干扰素
• 用超纯水配制纯化缓冲液。 • 在2～1O℃将粗干扰素倒入匀浆器中，加pH7.5 磷酸缓冲液，匀浆，使之完全溶解。
干扰素ppt课件
4h后：20℃，pH6.0，DO为60%，5～6.5h。
终点控制：OD值达9.0±1.0，5℃冷却水快速降
温至15℃以下。
检测：发酵液杂菌检查
4．菌体收集
连续流离心机：冷却的发酵液，16000 r/min 离心收集。 菌体保存：－20℃冰柜，不超过12个月。 检测：干扰素含量、菌体蛋白含量等。
������
������
1990，rhuIFNγ-1b；1993，rhuIFNβ-1b；
2001－2002：PEG化IFN，PEG-Intron, Pegasys
表达产物：无糖基化，N-met，无活性包涵体
工艺特点：发酵过程，随后变性、复性过程。
3、干扰素生产工艺路线（4）
动物无限细胞系培养生产工艺：
第一步：干扰素α-2b基因的克隆 P73 图2－13
pBR322质粒
诱生的白细胞
提取全RNA 通过寡dT-纤维素柱获得寡A的mRNA
pBR322质粒DNA的PstI酶 蔗糖密度梯度离心提取12s的 mRNA 切割加上dA或dC 逆转录成cDNA 双链cDNA接上dT或dG尾
退火获的杂交质粒
转化大肠杆菌
干扰素教学
2、重组干扰素的临床应用
广谱抗病毒活性（rhuIFNα） 慢性乙型、丙型、丁型肝炎；疱疹、病毒性角膜炎。 直接抗肿瘤活性（rhuIFNα） ������ 毛细胞和慢性髓样白血病、Kaposi肉瘤、非霍奇
金淋巴瘤。 免疫调节活性——治疗慢性肉芽肿瘤（rhuIFNγ） 多发性硬化症rhuIFNβ
cDNA,PCR，基因连接质粒, 转化E.coli,筛选鉴定克隆。
1、基因工程假单胞杆菌菌种建立
第二步：表达载体构建 IFN基因与表达载体连接 转化大肠杆菌 筛选阳性克隆 获得序列正确表达载体
最新干扰素制备的工艺流程PPT课件
❖ 2、细菌的收获和裂解 １）用合适转头于4℃以4000转/分离心15分钟，弃上清，敞 开离心管口并倒置离心管使上清全部流尽。
❖ ２）将细菌沉淀重悬于100ml用冰预冷的STE中。 STE 0.1mol/L NaCl 10mmol/L Tris.Cl(pH8.0) 1mmol/L EDTA(pH8.0) 按步骤１）所述方法离心，以收集细菌细胞。
❖ （11）等电点测定 等电聚焦电泳。
❖ （12）除菌半成品应做干扰素效价测定、无菌试验和热源质 试验。
成品检定
❖ （1）物理性状
❖
冻干品白色或微黄色疏松体，加入注射水后不得
含有肉眼可见不溶物。
❖ （2）鉴别试验
❖
应用ELISA或中和试验检定。
❖ （3）水分测定
❖
用卡氏法，应低于3%。
❖ （4）无菌试验
❖ （7）残余血清IgG含量测定
❖
在应用抗体亲和层析法作为纯化方法时必须进行此项
检定。
❖ （8）残余抗生素活性测定
❖
半成品中不应有抗生素活性存在。
❖ （9）紫外光谱扫描
❖
检查半成品的光谱吸收值，最大吸收值应在280±2纳
米。
❖ （10）肽图测定
❖
用CNBr裂解法，测定结果应符合干扰素的结构，且批
与批之间应一致。
c、d等，在每一个单菌落中挑取部分细菌转涂到含有四环素
的培养基上，不能生长的是绝大部分含有重组质粒的细菌及
少量可能发生突变的非重组质粒的细菌单菌落。原因：因为
PBR322含有抗四环素基因，重组质粒中目的基因插在抗四环
素基因中，使其结构破坏，失去抗四环素作用。
五、提取重组质粒
❖ 1、对上一步获得含目的基因的大肠杆菌在含有氯霉素的培 养基中扩大培养15h。培养时间：前人实验证实大肠杆菌K12 生长前6h为迟缓期, 6~15. 5h为对数增时期, 15. 5~ 19. 5h为稳定期, 19. 5h后为衰亡期。氯霉素：氯霉素可抑制宿 主的蛋白质合成，结果阻止了细菌染色体的复制，然而，松 弛型质粒仍可继续复制。
❖ ２）将细菌沉淀重悬于100ml用冰预冷的STE中。 STE 0.1mol/L NaCl 10mmol/L Tris.Cl(pH8.0) 1mmol/L EDTA(pH8.0) 按步骤１）所述方法离心，以收集细菌细胞。
❖ （11）等电点测定 等电聚焦电泳。
❖ （12）除菌半成品应做干扰素效价测定、无菌试验和热源质 试验。
成品检定
❖ （1）物理性状
❖
冻干品白色或微黄色疏松体，加入注射水后不得
含有肉眼可见不溶物。
❖ （2）鉴别试验
❖
应用ELISA或中和试验检定。
❖ （3）水分测定
❖
用卡氏法，应低于3%。
❖ （4）无菌试验
❖ （7）残余血清IgG含量测定
❖
在应用抗体亲和层析法作为纯化方法时必须进行此项
检定。
❖ （8）残余抗生素活性测定
❖
半成品中不应有抗生素活性存在。
❖ （9）紫外光谱扫描
❖
检查半成品的光谱吸收值，最大吸收值应在280±2纳
米。
❖ （10）肽图测定
❖
用CNBr裂解法，测定结果应符合干扰素的结构，且批
与批之间应一致。
c、d等，在每一个单菌落中挑取部分细菌转涂到含有四环素
的培养基上，不能生长的是绝大部分含有重组质粒的细菌及
少量可能发生突变的非重组质粒的细菌单菌落。原因：因为
PBR322含有抗四环素基因，重组质粒中目的基因插在抗四环
素基因中，使其结构破坏，失去抗四环素作用。
五、提取重组质粒
❖ 1、对上一步获得含目的基因的大肠杆菌在含有氯霉素的培 养基中扩大培养15h。培养时间：前人实验证实大肠杆菌K12 生长前6h为迟缓期, 6~15. 5h为对数增时期, 15. 5~ 19. 5h为稳定期, 19. 5h后为衰亡期。氯霉素：氯霉素可抑制宿 主的蛋白质合成，结果阻止了细菌染色体的复制，然而，松 弛型质粒仍可继续复制。
重组人干扰素生产工艺(精品PPT)
来源：活化的T细胞和NK细胞产生
功能：免疫调节
提高单核巨噬细胞、树突状细胞的抗原提呈能力 增强Tc细胞和NK细胞的杀伤活性
抑制TH2细胞形成，下调体液免疫应答 趋化作用
抗病毒和抗肿瘤作用〔次要〕 2. 根据动物来源确定分类，例如人干扰素〔HuIFN〕，小鼠干扰素〔MuIFN〕。
第五页，共四十五页。
上市重组干扰素: α2a、α2b、α1b、 β1b，γ
的免疫抑制作用；而低剂量干扰素或在抗原致敏之后参加干扰素那么能产生免疫增强的效果。在适宜的条件下，IFNγ对B细胞和CD8+T细胞的分化有促进作用，但不能促进其增殖。IFNγ能 增强TH1细胞的活性，增强细胞免疫功能；但对TH2细胞的增殖有抑制作用，因此抑制体液免疫功能。IFNγ不仅抑制TH2细胞产生IL-4，而且抑制IL-4对B细胞的作用，特别是抑制B细胞生成 IgE。
第十一页，共四十五页。
1.4 重组(zhònɡ zǔ)干扰素的临床应用
广谱抗病毒活性〔rhuIFNα〕 慢性乙型、丙型、丁型肝炎；疱疹、病毒性
角膜炎。 直接抗肿瘤活性〔rhuIFNα〕 毛细胞和慢性髓样白血病、 Kaposi肉瘤(ròuliú)、
非霍奇金淋巴瘤。 免疫调节活性——治疗慢性肉芽肿瘤〔rhuIFNγ〕 多发性硬化症 rhuIFNβ
第四页，共四十五页。
天然(tiānrán)干扰素 分类
1. 根据来源、基因序列和氨基酸组成分类 I 型干扰素： IFNα、IFNβ、IFN τ、IFN ω 来源：白细胞、成纤维细胞、病毒感染的组织细胞等
功能(gōngnéng) ：抗病毒感染、抗肿瘤生长 免疫调节(较弱〕
其中IFN-α为多基因产物，有23种以上的亚型。 II 型干扰素：干扰素γ〔IFN )
功能：免疫调节
提高单核巨噬细胞、树突状细胞的抗原提呈能力 增强Tc细胞和NK细胞的杀伤活性
抑制TH2细胞形成，下调体液免疫应答 趋化作用
抗病毒和抗肿瘤作用〔次要〕 2. 根据动物来源确定分类，例如人干扰素〔HuIFN〕，小鼠干扰素〔MuIFN〕。
第五页，共四十五页。
上市重组干扰素: α2a、α2b、α1b、 β1b，γ
的免疫抑制作用；而低剂量干扰素或在抗原致敏之后参加干扰素那么能产生免疫增强的效果。在适宜的条件下，IFNγ对B细胞和CD8+T细胞的分化有促进作用，但不能促进其增殖。IFNγ能 增强TH1细胞的活性，增强细胞免疫功能；但对TH2细胞的增殖有抑制作用，因此抑制体液免疫功能。IFNγ不仅抑制TH2细胞产生IL-4，而且抑制IL-4对B细胞的作用，特别是抑制B细胞生成 IgE。
第十一页，共四十五页。
1.4 重组(zhònɡ zǔ)干扰素的临床应用
广谱抗病毒活性〔rhuIFNα〕 慢性乙型、丙型、丁型肝炎；疱疹、病毒性
角膜炎。 直接抗肿瘤活性〔rhuIFNα〕 毛细胞和慢性髓样白血病、 Kaposi肉瘤(ròuliú)、
非霍奇金淋巴瘤。 免疫调节活性——治疗慢性肉芽肿瘤〔rhuIFNγ〕 多发性硬化症 rhuIFNβ
第四页，共四十五页。
天然(tiānrán)干扰素 分类
1. 根据来源、基因序列和氨基酸组成分类 I 型干扰素： IFNα、IFNβ、IFN τ、IFN ω 来源：白细胞、成纤维细胞、病毒感染的组织细胞等
功能(gōngnéng) ：抗病毒感染、抗肿瘤生长 免疫调节(较弱〕
其中IFN-α为多基因产物，有23种以上的亚型。 II 型干扰素：干扰素γ〔IFN )
基因工程药物之干扰素的制备流程课件
纯化方法
采用色谱（如凝胶过ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ色谱、离子交 换色谱）、电泳等纯化技术，进一步 分离和纯化干扰素蛋白质。
纯度检测
通过SDS-PAGE、高效液相色谱等方 法检测干扰素的纯度，确保产品质量 。
04
干扰素制备过程中的质量控制
工程菌的质量控制
菌种鉴定
确保所使用的工程菌种是正确的，并通过基因测 序等方法进行验证，防止菌种污染或误用。
降低干扰素制备成本的发展需求
原料与耗材的成本控制
在干扰素的制备过程中，原料和耗材的成本占据了很大比例。因此，寻找更经济 、高效的原料来源，以及降低耗材的使用量，是降低成本的重要途径。
生产工艺的优化与改进
通过优化生产工艺，减少生产步骤、提高生产效率，可以降低干扰素的生产成本 。此外，开发连续化、规模化的生产工艺，实现资源的充分利用和能源的高效利 用，也是降低成本的关键。
种类
根据产生来源和受体特异性，干扰素主要分为三类：Ⅰ型干 扰素（包括α和β干扰素）、Ⅱ型干扰素（γ干扰素）和Ⅲ型 干扰素（λ干扰素）。
干扰素的生物学活性
抗病毒活性
干扰素能够抑制病毒的复制和 扩散，通过诱导细胞产生抗病 毒蛋白，降解病毒RNA、阻止 病毒蛋白合成等方式发挥作用
。
抗肿瘤活性
干扰素可以抑制肿瘤细胞的增殖， 诱导肿瘤细胞凋亡，同时激活免疫 系统，增强机体对肿瘤的免疫应答 。
免疫调节活性
干扰素能够调节机体的免疫功能， 激活免疫细胞，增强机体的免疫力 ，从而抵抗病毒和肿瘤的侵袭。
干扰素在医学领域的应用
抗病毒治疗：干扰素已被广泛应用于 病毒感染性疾病的治疗，如乙型肝炎 、丙型肝炎、尖锐湿疣等。
免疫治疗：干扰素可用于免疫调节， 治疗一些自身免疫性疾病和免疫缺陷 病。
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气量和搅拌转速，控制溶解氧为30%，培养3～4小时，转入
发酵罐中，同时取样发酵液进行显微镜检查和LB培养基划线
检查，控制杂菌
❖ 3.发酵罐培养 将种子液通入300L培养基的发酵罐中，接 种量10%，培养温度30℃，pH7.0。级联调节通气量和搅拌转 速，控制溶解氧30%，培养4小时。然后控制培养温度20℃， pH6.0，溶解氧60%，继续培养5～6.5小时。同时进行发酵液 杂菌检查，当OD值达9.0±1.0后，用5℃冷却水快速降温至 15℃以下，以减缓细胞衰老。或者将发酵液转入收集罐中， 加入冰块使温度迅速降至10℃以下。
干扰素的工艺制备流程
干扰素的工艺制备流程
基因工程大肠杆菌发酵生产工艺:
上市产品：重组人干扰素rhuIFN 1986，rhuIFNα-2a， rhuIFNα-2b； 1990，rhuIFNγ-1b；1993，rhuIFNβ-1b； 2001－2002： PEG化IFN，PEG-Intron, Pegasys 表达产物：无糖基化，N-met，无活性包涵体 工艺特点：发酵过程，随后变性、复性过程。
EcoR I
BamH I
EcoR I
BamH I
2.连接完成后分离纯化，测序，与原干扰素序列比对。 3.鉴定序列无误后，导入受体细胞，筛选
干扰素的工艺制备流程
将cDNA克隆到含有四环素、氨苄青霉素抗性基因的质 粒中，转化到大肠杆菌，重组的载体 DNA 分子在一定条件 下转化入大肠杆菌，形成携带质粒的菌株。
电泳切取目的基因片段 ❖ 3. 用逆转录试剂盒逆转录，把总mRNA逆转录成cDNA ❖ 4. 以cDNA为模板、干扰素引物为引物，PCR，得到完全的干
扰素基因的PCR产物 ❖ 5.人工加尾形成“粘性末端”
干扰素的工艺制备流程
❖ 1. 提取载体（质粒、病毒等），双酶切，再把干扰素基因
的PCR产物用相应的酶酶切，用菌体裂解 ❖ 预处理 ❖ 初级分离
干扰素的工艺制备流程
❖ 裂解缓冲液：纯化水配制，2℃～10℃（pH7.5） ❖ 使用保护剂：EDTA，PMSF。 ❖ 破碎菌体：2厘米以下的碎块 ❖ 搅拌：加裂解缓冲液，2℃～10℃，2hr ❖ 冻融: 细胞完全破裂，释放干扰素。
干扰素的工艺制备流程
基因工程药物 --干扰素的制备
干扰素的工艺制备流程
概念(interferon,IFN)：机体 免疫细胞产生的一类细胞因 子，是机体受到病毒感染时， 免疫细胞通过抗病毒应答反 应而产生的一组结构类似、 功能接近的生物调节蛋白。
根据分子结构和抗原性的差 异分为α、β、γ、ω等4个类 型。
干扰素的工艺制备流程
❖ 4. 菌体收集 将已降温的发酵液转入连续流离心机， 16000 r/min离心收集。进行干扰素含量、菌体蛋白含量、 菌体干燥失重、质粒结构一致性、质粒稳定性等项目的检测。 菌体于－20℃冰柜中保存时，不得超过12个月。每保存3个 月，检查一次活性。
干扰素的工艺制备流程
3.1、干扰素分离工艺过程 3.2、干扰素的纯化工艺过程
干扰素的工艺制备流程
❖ 不同来源的干 扰素
干扰素的工艺制备流程
❖ 广谱抗病毒活性（rhuIFNα） 慢性乙型、丙型、丁型肝炎；疱疹、病毒性角膜炎。
❖ 直接抗肿瘤活性（rhuIFNα） 毛细胞和慢性髓样白血病、 Kaposi肉瘤、非霍奇金 淋巴瘤。
❖ 免疫调节活性——治疗慢性肉芽肿瘤（rhuIFNγ） ❖ 多发性硬化症 rhuIFNβ
基因工程菌的制备
❖ 目的基因的分离 克隆载体
→ 目的基因与克隆
载体的体外重组
重组体导入大肠杆菌K12
→
→
受体菌的培养及筛选 从受体菌中获取目的基因
表达载体
重组质粒
导入大肠杆菌
→
受体菌的筛选，表达性、稳定性等检测
工程菌
干扰素的工艺制备流程
❖ 1. 破碎细胞，用Trizol法提取总的RNA ❖ 2. 将生产干扰素的人白细胞的mRNA分级分离然后进行凝胶
干扰素的工艺制备流程
由于质粒重组时有3种基本方式，即：目的基因与克隆载体 重组，目的基因片段与目的基因片段重组，克隆载体与克隆 载体重组；另外重组过程可能会发生基因突变情况
干扰素的工艺制备流程
对基因工程大肠杆菌进行评价分析，并保存菌种。
干扰素的工艺制备流程
启开种子 精提 冻干
制备种子液 半成品制备
❖ 加絮凝剂聚乙烯亚胺: 2℃～10℃，搅拌45min，对菌体碎片进行絮凝。
❖ 加凝聚剂醋酸钙溶液: 2℃～10℃,搅拌15min，对菌体碎片、DNA等进行 沉淀。
干扰素的工艺制备流程
❖ 连续流离心机：2℃～10℃，16000 r/min ❖ 收集上清液：含有重组干扰素蛋白质 ❖ 杂质沉淀：121℃、30min 蒸汽灭菌,焚烧处理。
干扰素的工艺制备流程
❖ 盐析: 硫酸铵，2℃～10℃，搅匀,静置过夜。 ❖ 离心：连续流离心机，16000 r/min ❖ 保存：收集沉淀，粗干扰素，4℃保存。
干扰素的工艺制备流程
❖ 溶解粗干扰素 ❖ 沉淀与疏水层析
阴离子交换层析与浓缩 阳离子交换层析与浓缩 凝胶过滤层析 ❖ 无菌过滤分装
干扰素的工艺制备流程
1. 根据来源、基因序列和氨基酸组成分类
◆ I 型干扰素：IFNα、IFNβ、IFN τ、IFN ω
来源：白细胞、成纤维细胞、病毒感染的组织细胞等 功能 ：抗病毒感染、抗肿瘤生长 、免疫调节(较弱） 其中IFN-α为多基因产物，有23种以上的亚型。
◆ II 型干扰素：干扰素γ（IFN)
来源：活化的T细胞和NK细胞产生 功能：免疫调节
❖ 配制纯化缓冲液： 超纯水，pH7.5磷酸缓冲液，0.45 μm滤器和10 ku 超滤系统，百级层流下收集。冷却至2℃～10℃。
❖ 检查: 缓冲液的pH值和电导值。 ❖ 溶解：2℃～10℃，匀浆，完全溶解。
成品检定
发酵培养 半成品检定
成品包装
粗提 分装
❖ 1．菌种培养
取－70℃下保存的甘油管菌种（工作种
子批），于室温下融化。然后，接入摇瓶，培养温度30℃，
pH7.0，250 r/min活化培养18±2小时后，进行吸光值测定
和发酵液杂菌检查。
❖ 2．种子罐培养
将已活化的菌种接入装有30L培养基的
种子罐中，接种量10%，培养温度30℃，pH7.0，级联调节通