生物大分子的电子显微镜技术

染色与投影
染色----增加核酸分子的电子密度 样品展层后,粘取至铜网上,经过染色和金属投 影以增强反差. 染色液为1~2%的PTA, (用90% 乙醇配制,100ml染液中含1ml的浓硫酸)或醋酸 双氧铀,染色10~30秒后.自然晾干.
关于生物大分子：蛋白质，酶，核酸，多糖，脂类 研究生物大分子的意义：理化特性及空间构像与功能 研究生物大分子的方法 物理化学方法探讨理化特性
X－射线衍射技术分析结晶样品
电子显微镜的直接观察技术
核酸的电子显微镜研究技术
核酸的分类：
DNA
双链dsDNA、线性的， 超螺旋 的， 单链 ssDNA RNA 单链 ssRNA 、线性的，三叶草形 的 双链dsRNA
样品配制
醋酸铵法:
上相液组成:醋酸铵 (终浓度)0.5~2Mol(PH7.5)
核酸样品
0.5~1ug∕ml
总体积50ul
细胞色素C
0.05~0.1mg∕ml
下相液:0.05~0.25M醋酸铵水溶液或双蒸水
•甲酰铵法:
上相液组成:Tris-Na3EDTA(PH8.5) 0.1~0.01M
核酸样品
0.5~1ug∕ml
s s 1um=1.20X106Da
特点和应用
样品量少；操作简便；制备样品时间短。 适合观察核酸分子的形状和长度、双链或单链
的区分、根据长度计算核酸的分子量； 进行异源双链分子分析、分子杂交、转录复合
体、核酸蛋白质复合体等研究； 基因组织结构、基因片段的缺失、断裂基因、
插入或倒置、基因定位及碱基组成特征等方面 的研究。
细胞色素C
0.05~0.1mg∕ml
甲酰铵
40~50%
下相液:0.1MTris~0.01MNa3EDTA(PH8.5),20%甲酰铵.
展层方法及步骤
5.
1 4
3 2
展层 1.样品溶液(上相溶 液) 2.展层液(下相溶液) 3.滑石粉 4.载玻片
沾网: 将铜网的膜面朝下, 沾取液面上的样品
脱水与染色 铜网以45º角插入 无水乙醇片刻,进行 脱水,以同样方法在 2%PTA中染色
蛋白质单分子展层操作
对核酸样品和试剂的要求：
1.核酸样品纯度高，去除其他混杂的核酸和蛋白质成份； 2.核酸样品为新鲜制备,并尽量保持其长链的完整性; 3.样品浓度在5ug∕ml以上; 4.样品溶液中无表面活性剂及变性剂等其他污染; 5.溶液的PH在6~10之间; 6.展层的碱性蛋白常选择细胞色素C,电泳纯; 7.所用试剂为分析纯,器具洁净,无去污剂等残留; 8.制备RNA样品的试剂与器具须高温烘烤,使RNA酶失活.
染色与投影
染色----增加核酸分子的电子密度 样品展层后,粘取至铜网上,经过染色和金属投 影以增强反差. 染色液为1~2%的PTA, (用90% 乙醇配制,100ml染液中含1ml的浓硫酸)或醋酸 双氧铀,染色10~30秒后.自然晾干.
投影-----使核酸细分子的直径加粗 染色后的样品以投影角度5~9º,用铂~钯合金进 行旋转投影,或再加喷一薄层碳膜,以增加强度.
染色与投影
染色----增加核酸分子的电子密度 样品展层后,粘取至铜网上,经过染色和金属投 影以增强反差. 染色液为1~2%的PTA, (用90% 乙醇配制,100ml染液中含1ml的浓硫酸)或醋酸 双氧铀,染色10~30秒后.自然晾干.
投影-----使核酸细分子的直径加粗 染色后的样品以投影角度5~9º,用铂~钯合金进 行旋转投影,或再加喷一薄层碳膜,以增加强度.
金属投影: 在真空喷镀仪中 对样品进行重金 属旋转投影.
微滴扩散法及单滴展开法
适合微量样品的操作,单滴展 开法的展层样品液只需5~10ul, 操作方法与展层方法相同,可 用16孔酶标板代用展层容器
一步释放法
病毒，噬菌体等含核酸的细胞器，不进行提取核酸， 利用展层上相液（2M醋酸铵），下相液（0.2M醋酸铵 或水溶液）盐浓度的巨大差异，高盐中的病毒遇到低渗 溶液而破裂，核酸分子释放，并与细胞色素C结合，随 着单分子层展开，因此，释放与展层在一步完成
特点和应用
样品量少；操作简便；制备样品时间短。 适合观察核酸分子的形状和长度、双链或单链
的区分、根据长度计算核酸的分子量； 进行异源双链分子分析、分子杂交、转录复合
体、核酸蛋白质复合体等研究； 基因组织结构、基因片段的缺失、断裂基因、
插入或倒置、基因定位及碱基组成特征等方面 的研究。
蛋白质单分子展层操作
电镜观察要求
染色，投影后，核酸分子的直径从20A增至 80~100A，故在10万倍以下可以观察到；
Baidu Nhomakorabea
蛋白质单分子膜展层技术的原理
某些碱性蛋白质在低盐溶液或水的表面形成不溶性变 性薄膜，单浓度和加到溶液表面的量合适，该膜就展 开成为单分子层，也就是一个多肽链构成的分子网。 如果将核酸样品混合在溶液中，碱性蛋白上的氨基酸 碱性基团便与核酸分子链上的酸性基团以水合键结合， 核酸分子相对稳定地固着在蛋白质分子上。展层时， 核酸分子随着蛋白质在溶液表面的展开而被拉开伸展 为弯曲的二维结构。由于蛋白质单分子膜作基础，使 核酸分子保持完整性，经捞网，染色，金属投影，电 镜观察。
核小体－－DNA 与蛋白质聚合一起构成的染 色体的单位
核酸分子电镜观察的要求:
核酸分子需要打开超螺旋成为二维伸展的长链; 核酸分子太细需要加粗； 提高电子反差。
分子长度测量及计算
对已知的标准分子进行观察和计算，完整的分子 的长度应相对一致。
观察100个以上的分子，拍像记录； 矫正电镜放大倍数； 测量分子，50~200份单分子； 统计学方法计算平均值，作出长度分布图； 用已知的标准分子进行对照测算 经验公式：ds 1um=2.07X106Da
对核酸样品和试剂的要求：
1.核酸样品纯度高，去除其他混杂的核酸和蛋白质成份； 2.核酸样品为新鲜制备,并尽量保持其长链的完整性; 3.样品浓度在5ug∕ml以上; 4.样品溶液中无表面活性剂及变性剂等其他污染; 5.溶液的PH在6~10之间; 6.展层的碱性蛋白常选择细胞色素C,电泳纯; 7.所用试剂为分析纯,器具洁净,无去污剂等残留; 8.制备RNA样品的试剂与器具须高温烘烤,使RNA酶失活.