鸡胚培养和细胞培养
鸡胚成纤维细胞(CEF)的制作及细胞培养
鸡胚成纤维细胞（CEF）的制作及细胞培养（一）CEF的制备1. 实验试剂1×DMEM（不含丙酮酸钠）、小牛血清、高压过的PBS、胰酶、双抗。
2. 实验设备和材料酒精灯、酒精喷壶、酒精棉、打火机、计时器、一次性手套废液缸、镊子、细胞瓶、50 mL试管架、50 mL离心管、1000ul 移液枪及枪头、100 uL移液枪及枪头、塑料吸管、一次性培养皿、SPF鸡胚（9-11日龄均可）将3把小镊子、1把剪刀、1个50 mL离心管、1个玻璃培养皿放入一个大号饭盒内；取一中号锥形瓶，瓶口由内到外分别盖上6层纱布、锡箔纸、报纸包好，高压30 min备用。
3. 实验步骤（1）将所用材料放入超净工作台（小牛血清及胰酶除外），紫外照射30 min。
（2）用镊子取出高压过的平皿、镊子，倒入PBS液；（3）酒精消毒气室处蛋壳，去除蛋壳，撕开壳膜、尿囊膜和羊膜，取出鸡胚，置于培养皿中用镊子去除头、四肢和内脏，并将胚体置于另一个培养皿中冲洗干净；（4）将胚体置于高压过的50 mL离心管内，略水平放置，用剪刀充分剪碎，越碎越好；（5）加入胰酶（5 mL/个），37℃水浴锅内消化5-8 min，待胚体呈绒毛状即可，吸除消化液；（6）加入30 mL含10%血清的DMEM，充分吹打，静置片刻，过滤至锥形瓶内；（7）重复第六步；（8）分装至培养瓶或将细胞按1.2×106 cells/well传到6孔板中，每孔 2 mL。
（二）细胞冻存（1）倒去细胞上清液，加入PBS洗去残留的培养基，洗两次。
（2）加入0.25%的胰酶，消化10-20 s后倒去。
（3）1瓶细胞加入1 mL培养基吹打均匀，吸入到离心管中。
（4）将细胞离心，1000 rpm，2-3 min。
（5）根据计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20% FBS+10% DMSO）重悬细胞，一般两瓶细胞冻存三管（FBS越高，细胞复苏时活力越大）。
DMSO一定要配成10%。
鸡胚成纤维细胞的制作及培养
鸡胚成纤维细胞培养1、准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。
开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。
2、布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。
3、选胚：取9-10日龄鸡胚，（注：鸡胚日龄越小，形成细胞活力越好，但产量较低）用新洁尔灭消毒蛋壳10分钟后放净化台。
用碘酒、酒精消毒蛋壳。
用镊子打开气室。
4、用另一套镊子将壳膜打开将鸡胚夹起去头、爪、眼，放灭菌生理盐水中。
5、把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。
6、剪切：用眼科剪把组织切成1~2毫米大小的块，以便于消化。
7、处理组织：将已剪碎的组织碎片倒入一个带玻璃珠的灭菌三角瓶中，其中加入0.25%的胰酶，10个胚约7ml，或加组织消化液，一个胚1ml（组织消化液以及胰酶的配置见微生物指导）结扎瓶口或塞以胶塞。
8、消化：将其置入37℃水浴箱中或用恒温水浴，消化中应不停摇动，如用电磁恒温搅拌器消化更好。
消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。
消化10－15分钟。
一般约12分钟。
视鸡胚日龄大小而定。
越小消化时间越短。
见组织松软即可。
一般不可消化时间太长否则容易导致细胞活力不足。
9、分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，加入0.5％的含5％犊牛血清双抗的的水解乳蛋白Hank，s液少许。
（制法见微生物试验实习指导），用力震摇，或用吸管吹打。
使细胞分散，脱落。
然后用纱布过滤或随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。
低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清（可以不离心吸掉上清），加入适量含有血清的培养液。
10、计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。
对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。
动物检疫中实验室检验的主要方法
动物检疫中实验室检验的主要方法动物检疫是通过对动物体内的样本进行实验室检验，以便检测出一些疾病、寄生虫及其他有害生物。
以下是动物检疫中常用的实验室检验方法：1. 细菌培养：用于检测动物体内的细菌感染，主要通过从样本中取得细菌并将其培养在适当的培养基上。
培养后，通过观察细菌的形态特征、生长速率和产生的代谢产物来确定细菌的种类和数量。
2. 病毒分离和鉴定：针对动物患病的病毒感染，可以采用细胞培养、鸡胚培养或小鼠接种等方法，将动物体内的病毒分离出来。
分离后，可以使用免疫荧光、酶联免疫吸附试验（ELISA）或PCR等技术对病毒进行鉴定和定量。
3. 血清学检验：检测动物体内的免疫反应，主要通过血液样本中的血清进行。
血清中的抗体水平可以通过酶联免疫吸附试验、补体结合试验或中和试验等方法进行测定，以确定动物是否感染某种病原体，并评估其免疫状态。
4. 寄生虫检测：用于检测动物体内的寄生虫感染，包括内寄生虫和外寄生虫。
内寄生虫的检测常通过粪便检查，利用显微镜观察寄生虫卵或幼虫的存在和数量。
对于外寄生虫，可以通过沾取动物毛发或皮肤组织样本，用显微镜观察或进行分离培养来检测寄生虫的存在。
5. 分子生物学方法：包括PCR、实时定量PCR和基因测序等技术，可以用于检测动物体内的病原体DNA或RNA。
这些方法在诊断疾病、监测感染水平以及进行病原体基因型鉴定等方面具有高灵敏度和高特异性。
6. 组织学检查：对于一些疑难病例，可以通过组织学检查来确定疾病的诊断。
常用的方法包括组织切片染色和显微镜观察，可以帮助确定动物体内的病理变化和病因。
总之，动物检疫中的实验室检验方法丰富多样，根据需要选择合适的方法进行检测，以确保动物的健康和防控有害生物的传播。
这些检验方法的应用可以帮助监测和预防动物病原体的传播，保护人畜健康和农业生产安全。
鸡胚培养
鸡胚培养前言：鸡胚培养法是用来培养某些对鸡胚敏感的动物病毒的一种培养方法，用牛痘病毒（vaccinia virus）和鸡新城疫病毒（Newcastle-disease virus）接种鸡胚。
牛痘病毒适宜于在绒毛尿囊膜上生长，经培养后，产生肉眼可见的白色痘疱样病变，似小结节或白色小片云翳状。
鸡新城疫病毒适宜接种在尿囊腔和羊膜腔内，生长后，鸡胚全身皮肤出现出血点，以脑后最显著。
基本原理鸡胚培养法是用来培养某些对鸡胚敏感的动物病毒的一种培养方法，此方法可用以进行多种病毒的分离、培养，毒力的滴定，中和试验以及抗原和疫苗的制备等。
鸡胚培养的技术比组织培养容易成功，也比接种动物的动物来源容易，无饲养管理及隔离等的特殊要求，且鸡胚一般无病毒隐性感染，同时它的敏感范围很广，多种病毒均能适应，因此，是常用的一种培养动物病毒的方法。
器材牛痘病毒液，鸡新城疫病毒液；白壳受精卵（自产出后不超过10天，以5天以内的卵为最好）；孵卵器，检卵灯，齿钻，磨壳器，钢针，蛋座木架，注射器，2．5%碘酒，70%酒精，镊子，剪刀，封蜡（固体石蜡加 1/4凡士林，溶化），灭菌培养皿，灭菌盖玻片等。
操作步骤1．准备蛋胚孵育前的鸡卵先用清水以布洗净，再用干布擦干，放入孵卵器内进行孵育（37℃，相对湿度是45—60%），孵育三日后，鸡卵每日翻动1—2次。
孵至第4日，用检卵灯观察鸡胚发育情况，未受精卵，只见模糊的卵黄黑影，不见鸡胚的形迹，这种鸡卵应淘汰。
活胚可看到清晰的血管和鸡胚的暗影，比较大一些的可以看见胚动，随后每日观察一次，将胚动呆滞或没有运动的、血管昏暗模糊者，即可能是已死或将死的鸡胚，要随时加以淘汰。
生长良好的蛋胚一直孵育到接种前，具体胚龄视所拟培养的病毒种类和接种途径而定。
2．接种1）绒毛尿囊膜接种（a）将孵育10—12天的蛋胚放在检卵灯上，用铅笔勾出气室与胚胎略近气室端的绒毛尿囊膜发育得好的地方。
（b）用碘酒消毒气室顶端与绒毛尿囊膜记号处，并用磨壳器或齿钻在记号处的卵壳上磨开一三角形或正方形（每边约5—6mm）的小窗，不可弄破下面的壳膜。
病毒的培养方法哪几种
病毒的培养方法哪几种病毒的培养方法是研究和了解病毒特性、生命周期以及对人类和生态系统的影响的重要手段。
通过培养病毒，科学家可以进一步研究病毒的基本特征、复制和传播机制，以及开发疫苗和药物。
本文将介绍几种常见的病毒培养方法。
一、细胞培养法细胞培养法是常见的病毒培养方法之一。
病毒在体内是依赖于宿主细胞才能生存和复制的，因此通过培养感染体细胞的方式，可以实现病毒的大规模培养。
这种方法需要选取合适的细胞系，如HeLa细胞、Vero细胞等，将病毒接种在细胞培养基中，让病毒感染细胞并进行复制。
通过观察细胞的形态学变化、病毒颗粒释放和细胞死亡等现象，可以判断病毒的感染情况和生命周期。
二、鸡胚培养法鸡胚培养法常用于培养禽类和一些昆虫病毒。
在鸡胚培养技术中，科学家会将病毒接种到受精鸡蛋的卵黄囊或坏死胚中，利用卵黄囊提供的营养和鸡胚的生长环境，促进病毒的复制和生产。
通过观察鸡胚的发育情况和病变症状，可以判断病毒感染的程度和效果。
三、动物模型法动物模型法常用于病毒研究的初期，用于检测病毒分离和扩增的能力。
科学家会选择合适的动物种类，如小鼠、大鼠、兔子或猴子等，将病毒接种到动物的体内。
通过观察动物是否出现病征、病毒在体内的分布和病理变化，判断病毒的毒性和致病能力。
然而，由于动物模型法具有伦理和实验条件限制，现在越来越多的科学家转向细胞培养法和分子生物学技术。
四、感染性核酸和蛋白质培养法感染性核酸和蛋白质培养法是一种近年来发展起来的新技术。
通过利用已经纯化的病毒核酸或蛋白质，将其与适当的宿主细胞或胚胎培养在一起，使其感染并继续生长。
这种方法可以绕过病毒的复制步骤，直接利用病毒的核酸或蛋白质进行培养，从而更快地得到病毒产物。
然而，由于该方法无法复制整个病毒生命周期，可能会影响病毒的完整性和活性。
总结起来，病毒的培养方法有细胞培养法、鸡胚培养法、动物模型法和感染性核酸和蛋白质培养法等。
不同的方法适用于不同类型的病毒和研究目的。
鸡胚成纤维细胞的制作及培养
鸡胚成纤维细胞的制作及培养鸡胚成纤维细胞培养1、准备:取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。
开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。
2、布局:点燃酒精灯，安装吸管帽。
3、选胚:取9-10日龄鸡胚，(注:鸡胚日龄越小，形成细胞活力越好，但产量较低)用新洁尔灭消毒蛋壳10分钟后放净化台。
用碘酒、酒精消毒蛋壳。
用镊子打开气室。
4、用另一套镊子将壳膜打开将鸡胚夹起去头、爪、眼，放灭菌生理盐水中。
5、把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污;如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。
6、剪切:用眼科剪把组织切成1~2毫米大小的块，以便于消化。
7、处理组织:将已剪碎的组织碎片倒入一个带玻璃珠的灭菌三角瓶中，其中加入0.25%的胰酶，10个胚约7ml，或加组织消化液，一个胚1ml(组织消化液以及胰酶的配置见微生物指导)结扎瓶口或塞以胶塞。
8、消化:将其置入37?水浴箱中或用恒温水浴，消化中应不停摇动，如用电磁恒温搅拌器消化更好。
消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。
消化10,15分钟。
一般约12分钟。
视鸡胚日龄大小而定。
越小消化时间越短。
见组织松软即可。
一般不可消化时间太长否则容易导致细胞活力不足。
9、分离:在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，加入0.5,的含5,犊牛血清双抗的的水解乳蛋白Hank，s液少许。
(制法见微生物试验实习指导)，用力震摇，或用吸管吹打。
使细胞分散，脱落。
然后用纱布过滤或随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。
低速(500~1000转/分)离心消化液5分钟，吸出上清(可以不离心吸掉上清)，加入适量含有血清的培养液。
10、计数:用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。
对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO调整。
一种鸡胚胎成纤维细胞体外三维培养和分离的方法
一种鸡胚胎成纤维细胞体外三维培养和分离的方法1. 从鸡胚体内收集成纤维细胞：使用灭菌的工具和培养介质，从鸡胚体内收集成纤维细胞。
2. 细胞培养基的制备：制备适宜的细胞培养基，比如DMEM（Dulbecco's Modified Eagle's Medium），其中包含适当的营养物质和补充物。
3. 细胞培养底物处理：在培养器中涂覆适宜的细胞培养底物，比如胶原蛋白、明胶或聚二甲基丙烯酸甲酯（PDMA）等。
4. 细胞预处理：将收集到的鸡胚胎成纤维细胞在预处理培养基中预处理一段时间，以提高细胞的存活率和增殖速度。
5. 细胞接种：将经过预处理的细胞接种至培养器中的培养底物上，使细胞附着并形成单层或多层细胞。
6. 体外三维培养的创建：将培养器中的细胞培养至一定程度，使细胞形成三维结构，如球状或纺锤状。
7. 细胞增殖和细胞养护：提供适宜的培养条件，包括合适的培养基、温度、湿度和氧气含量，以促进细胞增殖和维持细胞的健康状态。
8. 培养基的更换：定期更换培养基，以排除废弃物和维持细胞的正常功能。
9. 细胞监测和分析：使用显微镜和其他细胞学技术，定期监测和分析培养器中的细胞状态、数量和生长速度。
10. 细胞传代：当细胞达到一定密度时，可以进行细胞传代，将细胞分离、稀释并重新接种，以维持细胞的健康状态和继续培养。
11. 细胞分离：使用适当的消化酶（如胰蛋白酶）或细胞分离缓冲液，将三维细胞结构分离为单个细胞。
12. 细胞计数：使用细胞计数仪或显微镜，对分离的细胞进行计数，以确定细胞的数量。
13. 细胞检测：采用细胞培养板或微孔板等细胞培养容器，将分离的细胞均匀地分配在不同孔或区域上，以进行后续的细胞检测和分析。
14. 细胞培养条件的优化：在细胞分离过程中，根据不同实验目的，优化培养条件，如培养基的配方、温度、湿度和氧气含量等。
15. 细胞培养的存活率和生长速度的分析：通过计算存活细胞的比例和细胞增殖速率，评估细胞培养的效果。
鸡胚的实验报告
一、实验目的1. 了解鸡胚培养的基本原理和操作步骤；2. 掌握鸡胚培养过程中细胞的分离、培养和传代技术；3. 观察鸡胚成纤维细胞的生长、形态和增殖情况。
二、实验原理鸡胚培养是一种在体外培养鸡胚细胞的方法，主要用于研究细胞生物学、分子生物学和发育生物学等领域。
通过将鸡胚组织中的细胞分离出来，并在特定的培养条件下进行培养，可以观察到细胞的生长、形态和增殖情况，从而研究细胞的生物学特性。
三、实验材料1. 新鲜鸡蛋：选用新鲜鸡蛋，确保蛋壳完整，无破损；2. 实验器材：解剖刀、剪刀、镊子、解剖盘、培养皿、移液枪、培养箱、显微镜等；3. 培养基：DMEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、胰蛋白酶等；4. 其他：消毒剂、无菌操作台、无菌棉签等。
四、实验步骤1. 鸡胚的获取：将新鲜鸡蛋在37℃温水中浸泡10分钟，使蛋壳软化，然后用解剖刀在鸡蛋的一端切开，取出鸡胚。
2. 鸡胚的解剖：将鸡胚放在解剖盘上，用剪刀剪开卵黄囊，取出卵黄囊膜，用镊子取出鸡胚成纤维细胞。
3. 细胞的分离：将鸡胚成纤维细胞放入装有DMEM培养基的培养皿中，用胰蛋白酶消化细胞，待细胞变圆后加入胎牛血清终止消化，然后用移液枪吹打细胞，使细胞分散。
4. 细胞的接种：将分散的细胞接种到培养皿中，放入培养箱中培养。
5. 细胞的观察：在显微镜下观察鸡胚成纤维细胞的生长、形态和增殖情况。
6. 细胞的传代：待细胞生长到一定密度后，用胰蛋白酶消化细胞，将细胞分离成单个细胞，再进行接种。
五、实验结果1. 鸡胚成纤维细胞在培养过程中，呈扁平梭形，细胞质丰富，细胞核明显。
2. 随着培养时间的延长，细胞逐渐增多，细胞密度逐渐增大。
3. 在显微镜下观察，细胞形态规则，生长旺盛。
4. 经过传代培养，细胞仍保持良好的生长状态。
六、实验讨论1. 鸡胚培养过程中，无菌操作至关重要，需严格按照无菌操作规程进行。
2. 培养基的质量对细胞的生长和增殖有重要影响，需选用优质培养基。
3. 细胞传代次数过多，可能导致细胞生长缓慢、形态发生变化，影响实验结果。
实验三、鸡胚细胞的原代培养(改进)
13. 分别取2ml ,2ml和3ml细胞悬液接种至三只培 养瓶中(3ml在塑料瓶),补加培养液至总体积 5ml; 14. 培养瓶加塞, 侧面标记。 37 ℃培养. 15. 后天上午来观察细胞,并进行细胞传代. 生长面
含鸡胚鸡蛋示意图
标记气室示意图
培养中的成纤维细胞
注 意
清理台面,用品洗净,交回. 预习下节课内容：细胞的传代培养/冻存 一个总的实验报告,包括上周实验准备工作, 本周的原代培养和传代培养. 要对结果进 行分析。
• B分散细胞培养 目的——反映了单个细胞的生物学特性 ——对单一细胞类型进行分离和纯化 接种方法： 1. 用吸管吸取一定量的细胞悬液，加入培养 器皿中，加入适量的培养液，封口 2. 恒温培养 3. 观察细胞生长状态，及时更换培养液。
• C悬浮细胞培养 某些白血病细胞、腹水瘤细胞等。 对培养基不断搅拌或者对培养器皿进行 振荡、旋转而维持细胞的悬浮状态。
鉴定各种细胞产物的程序。
无血清培养液中补加物具有独特性：适用于某 种细胞株的培养液，很可能不适合另一种细胞 株的生长。即使同源组织的不同细胞株，所需 补加物也不同。 无血清培养基的目前使用情况：尚处于研究阶 段，难以推广。目前，绝大多数人工合成培养 基使用时还需添加血清
抗 菌 素 的 使 用
抗生素的作用：在培养液配制后，培养液内常加 适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。 抗生素的使用量：通常是青霉素和链霉素联合使 用。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每 毫升100单位。 庆大霉素：每毫升100单位——方便、广谱、稳 定
6. 将材料转入B再次清洗; 7. A换Hank’s，材料再于A中漂洗; 8. 剪取1/5~1/3的组织,转入小烧杯(10ml) ，剪成 0.5~1mm3碎块。 9. 将碎块倒入三角锥瓶,用1ml胰酶清洗小烧杯, 合入锥瓶,迅速摇匀; 10. 锥瓶加塞,覆口,拿出工作台,于37 ℃水浴锅中 消化5~7分钟(严格)!,中间摇动2~3次; 11. 于超净工作台中加入4~5ml培养基,终止消化. 用吸管充分吹打7~8次; 12. 将细胞悬液用纱布过滤,进入20ml烧杯(凹面!) 用培养基清洗纱布2次,每次3~4ml;
鸡胚成纤维细胞的原代培养
鸡胚成纤维细胞的原代培养171850044生拔钱诗晨一、背景知识1.1原代培养与传代培养1.1.1原代培养是指直接从生物体取材（细胞、组织或器官）进行的第一次培养（中途不分割培养物、不更换培养物的生长器皿）。
1.1.2传代细胞培养分割细胞培养物进行的再配养注：细胞培养的代不是指细胞分裂次数，而是指培养的次数1.2细胞体外培养要求的条件✓无菌✓适宜温度：哺乳动物细胞36.5℃ 0.5℃，植物细胞原生质体25℃左右✓生理渗透压✓适宜酸碱度：7.2-7.4✓气体：95%空气+5%二氧化碳✓培养基：提供水、各种有机营养（糖、氨基酸、维生素等）及无机盐、生长调节因子等1.3培养细胞生长类型悬浮型：培养时不黏附于支持物之上。
而呈现悬浮生长的细胞。
贴壁型：培养时需要黏附于一定固相支持物表面才能很好生长的细胞。
又称黏附依赖型细胞（分如下四类）✧成纤维细胞：胞体呈梭形或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。
✧上皮型：细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。
✧游走型：呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。
此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。
在一定条件下，如培养基化学性质变动等，它们也可能成纤维细胞形态。
✧多形型：是一些形态上不规则的细胞。
细胞一般分胞体和胞突两部分，胞体呈不规则多边形，胞突呈细长丝状。
如神经元和神经胶质细胞1.4原代细胞培养的一般办法1.4.1植块培养法直接将组织块接入培养皿底部，待组织块贴牢在底部后再加入培养基培养的方法1.4.2离散细胞培养法用酶消化组织，使细胞之间连接破坏，将组织离散成单细胞悬液进行培养的方法注：原代培养中的植块培养法与组织培养不是一回事；植物组织培养又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织、器官或细胞、原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。
鸡胚原代细胞培养
鸡胚原代细胞培养实验材料9～10日龄鸡胚;Hank"s液50mL;0．5％水解乳蛋白液或MEM培养液20mL 内含犊牛血清1mL;双抗0．2mL;pH7．2;O．25％胰蛋白酶5mL、7％NaHC031mL;手术剪;镊子;灭菌的培养皿;50mL三角瓶;滴管若干;链霉素小空瓶若干加入细胞悬液培养用;高压灭菌塞子若干;培养盘;蛋座;95％酒精;水浴锅..实验内容及操作程序1．配液制备细胞前先在Hnak"s液中加青、链霉素;使其含量为青霉素100IU/mL;链霉素100μg/mL;用7％NaHC03调整pH至7．2～7．4;将胰蛋白酶调整pH7．6玫瑰红色..置37℃水浴锅中预热备用..2. 取胚及剪碎将胚蛋气室端向上直立于蛋座上;用碘酊消毒气室;以镊子击破卵壳并弃之;撕破卵膜揭之;继撕破绒尿膜、羊膜;取出胚胎于灭菌平皿中..剪去头部、翅爪及内脏;用Hank"s液简称H液洗去体表血液;移人灭菌三角瓶中;用灭菌剪刀剪碎鸡胚;使成为约1mm3大小的碎块;加5mL H液轻摇;静止1～2min;使其组织块下沉..吸去上层悬液;依同法再洗2次;至上悬液不混浊为止;吸干H液留组织.. 3．消化自水浴锅内取出预热的胰酶;按组织块量约3～5倍加入三角瓶中;1个鸡胚约需5mL胰酶;三角瓶上加塞;以免CO2挥发及污染..37℃水浴约20min左右;每隔5min轻轻摇动1次;由于胰酶作用;使细胞与细胞之间的氨基和羧基游离;待液体变混而稍稠;此是再轻摇可见组织块悬浮在液体内而不易下沉时;则需中止消化;如再继续消化下去可破坏细胞膜而不易贴壁生长;如果消化不够;则细胞不易分散..4．洗涤取出三角瓶后静置1min;让组织块下沉后;吸去胰酶液;用10mL Hank"s 液反复轻洗3次;以洗去胰酶;吸干上清液;留组织块..5．吹打加2mL含血清的0．5％水解乳蛋白营养液或：MEM培养液;以粗口吸管反复吹吸数次;使细胞分散;此时可见营养液混浊即为细胞悬液..静置1min;使未冲散的组织块下沉后;小心地将细胞悬液吸出1mL于20mL营养液中;此液细胞数约50万～70万/mL..如需大量细胞;可继续加营养液冲打;一个鸡胚约可做100mL细胞悬液..6．细胞计数取上述细胞悬液0．5mL加入0．1％结晶紫一柠檬酸0.1mol/L溶液2mL;置室温或37℃温箱中5～10min;充分振动混合后;用毛细管吸取滴人血细胞计数板内;在显微镜下计数..计数方法按白细胞计数法;计算四角大格内完整细胞的总数..如3～5个聚集在一起;则按1个计算;然后将细胞总数按下法换算成每毫升中的细胞数..细胞数/mL=4大格细胞总数/4×10 000×稀释倍数例如：4大格的细胞总数为284个;而稀释倍数为50．5mL染色液;则每毫升细胞悬液的细胞数为284/4×10 000×5=3．5×104个..7．稀释按照每毫升50万～70万个细胞密度的标准;将细胞悬液用营养液稀释之.. 计数时;可见到大部分细胞完整分散;3～5个细胞成堆;且细胞碎片很少;说明消化适度；如分散细胞少;则消化不够；如细胞碎片多;则消化过度..活细胞计数法取2％台盼蓝溶液1滴;细胞悬液1滴;混合计数;活细胞不着色;死细胞呈蓝色..8．分装培养分装于链霉素瓶中;每瓶约1mL;瓶口橡皮塞要塞紧..不合适者弃去;以免漏气造成污染或C02跑掉而营养液变碱..将细胞瓶横卧于培养盘中;于瓶上面划一直线;以表示直线的对侧面为细胞在瓶内的生长位置..瓶上注明组别、日期;置37℃温箱培养;4h后细胞即可贴附于瓶壁;24～36h生长成单层细胞;此时可吸去培养液;更换维持液;并接种病毒..附：细胞培养所需的常用培养基与试剂1．Hank’s液配制原液甲NaCl 8gKCl 2gMgSO4·7H20 2gMgCl2·6H20 2g2．8％CaCl2 100mL双蒸水加至1 000mL先将固体成分加于800mL双蒸水中;加温到50～60℃加速溶解;再加入CaCl2溶液;最后加双蒸水补足到1 000mL..加氯仿2mL;摇匀后于4℃贮存..原液乙Na2HPO4·2H20 1.2gKH2PO4·2H20 1.2g葡萄糖20g0．4％酚红lOOmL双蒸水加：1 000mL将上列各物混合后使其溶解;加氯仿2mL;摇匀后于4℃贮存..Hank"s工作液原液甲1份原液乙1份双蒸水18份工作液分装100mL;或500mL盐水瓶中;115~C灭菌10min;使用前以7％NaHCO3调节pH至0 7．2～7．6..2．0．4％酚红溶液配制酚红0.4g0．1％NaOH溶液11.28mL将酚红置于研钵中;加磨边缓缓加NaOH溶液;直到所有颗粒完全溶解;置于至lOOmL量杯中;最后加双蒸水至lOOmL;摇匀后;保存于4℃冰箱内备用.. 3. 0.5％乳蛋白水解物溶液配制乳蛋白水解物5gHank"s液l 000mL将乳蛋白水解物放入1 000mL Hank"s液中;待完全溶解后;摇匀分装于lOOmL 的盐水瓶中;每瓶95mL;115℃lOmin灭菌;4℃贮存备用..4．营养液生长液配制O．5％乳蛋白水解物95mL犊牛血清5mL青霉素、链霉素lmL将上述溶液混合后;以7％NaHCO3适量调节pH到7.2～7.4..维持液按上述方法;加犊牛血清2.5mL即成..5．MEM培养液MEM培养基一袋;加1 000mL双蒸水;过滤除菌或高压灭菌;分装于100ml盐水瓶中;每瓶90ml;用前以7％NaHC03调pH到7.2～7.4;并加10％犊牛血清..6．双抗配制青霉素100万IU链霉素1gHank"s液100mL将青、链霉素溶解于：100mL Hank"s溶液中;此为双抗溶液;无菌操作;分装小瓶;每瓶：lmL;内含有青霉素IIU;链霉素10000μg;低温冻结保存..使用时每100mL营养液中加双抗lmL;即每mL营养液中含青霉素100IU;链霉素100gμg..7. 7％NaHCO3溶液配制NaHCO3 7g双蒸水100mL将NaHC03溶于双蒸水中;置水浴锅中加热溶解;115℃10min灭菌后;无菌操作分装小瓶;每瓶lmL;4℃保存..8. 0.25％胰蛋白酶配制胰蛋白0.25gHang’s液100mL将胰蛋白酶溶于Hank"s液中;待完全溶解后;用0.2μm滤膜过滤;检验无菌后才能使用..无菌分装小瓶;每瓶5mL;低温冻结保存..使用时;以7％NaHC03调节pH到7.6-7.8。
鸡胚原代细胞培养
鸡胚原代细胞培养细胞是一微小而完整的生命单位，它组成各种生物体并生长、繁殖。
在生命体外，如果提供类似生物体内的环境条件，细胞也能生长繁殖。
要使每个细胞都能从人造环境中获得营养物质，必须将组织块分散成单个细胞。
组织培养法是目前培养病毒应用最广的一种方法，其优点是：一般没有隐性感染，没有免疫抵抗力，便于选择易感细胞，实验条件易于控制，成本便宜，经济适用。
组织培养法多应用于病毒的分离、鉴定、病毒感染细胞的机制、生产疫苗和抗原等。
很多组织，包括鸡胚，各种动物的肾脏组织，人胎羊膜细胞或流产胎儿组织等均可作组织培养的来源。
细胞来源的选择，主要是根据细胞对病毒的敏感性而定。
组织培养的方法中以单层细胞培养是最常用的方法，它又有原代和次代细胞培养、二倍体细胞株和传代细胞系三种类型。
原代培养是指将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖的过程。
本试验介绍原代细胞的鸡胚成纤维细胞培养方法。
（一）实验目的了解单层细胞培养方法（二）实验材料1、10日龄鸡胚。
2、1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank’s液，碘酒。
3、无菌组织培养瓶、吸管、滴管、剪子、镊子、超净工作台、CO2培养箱、蒸水器、纯水器（生物级）、滤器、真空泵、高压灭菌锅、培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃）。
（三）实验方法1、用碘酒消毒鸡卵气室端外壳，并将鸡胚直立于卵架上。
以镊子将小鸡取出放在无菌培养皿内，去头，爪、内脏和骨骼，用Hanks氏溶液洗2-3次。
2、用小剪在小烧瓶内将鸡胚剪成小块（1～２mm3），加Hankr氏溶液（约１０ml）冲洗2-3次，静置１～２分钟，用毛细吸管吸去液体，依同法再洗涤２次，将血球充分洗去。
３、用镊子将组织块放入无菌三角烧瓶内，加入１０～１５ml0.25液，37?水溶浴20分钟，中间摇动几次，由于胰酶的作用可使大量的细胞游离，液体变混，经四层纱布过滤后的细胞悬液，低速离心沉淀（1000转/分钟以内），5分钟，吸上去清液，再用Hanks氏溶液洗一次，沉淀物加入适量营养液，用白细胞计数的方法进行计数，使成每毫升含50～８０万细胞的细胞悬液。
微生物分离纯化与接种技术
微生物分离纯化与接种技术微生物分离纯化与接种技术微生物学是一门研究微生物的学科，在医学、食品工业、环境保护等行业有着广泛的应用。
而微生物的研究需要用到微生物分离纯化与接种技术，这些技术可以让我们有效地获取纯净的微生物，并在实验室中控制其生长条件，从而更好地研究微生物的特性和应用价值。
按照微生物的性质，可以将微生物分为细菌、真菌和病毒三大类。
不同的微生物类型需要不同的分离纯化与接种技术。
细菌分离纯化技术是微生物学中最基础的技术，其中最常用的方法就是传统的培养基分离法。
这种方法直接将微生物置于固体培养基中，允许其在特定的温度和pH条件下生长，然后通过形态特征和生长习性的观察，将细菌区分出来。
而对于那些难以直接用固体培养基分离纯化出来的细菌，我们还可以采用流式细胞术分离法、限制性酶切片段长度多态性分析法等先进的分离技术。
真菌分离纯化技术一般采用无菌活体动物或者人工培养基的方法。
在真菌分离和鉴定时，需要根据真菌的外部形态、菌丝的生长特性和菌落的颜色等特征来进行区分和鉴定。
为了保证真菌的纯度，我们也需要通过重复传代、提取DNA序列、限制性酶切片段长度多态性分析等方法进行多角度的鉴定，以确保纯化出来的真菌种类正确。
病毒是一种极小的微生物，一般无法在常规的细胞培养中生长。
因此，分离纯化技术对于病毒的研究尤其重要。
常见的病毒分离技术有鸡胚培养、细胞培养等。
鸡胚培养可以在和病毒感染相同的生理和代谢环境下使病毒生长，而细胞培养则是让病毒通过培养基中细胞对它的反应来分离纯化。
此外，病毒也可以通过电镜、PCR等现代分析技术来进行分离纯化和鉴定。
接种技术是指将纯化出来的微生物直接加入到培养基或其他基质中，让它们在有利的环境中进行生长和加工。
接种技术对于微生物学的研究至关重要，它可以帮助我们更好地了解微生物的特性，有效地应用于医学、环境保护、食品工业以及其他相关行业。
总之，微生物分离纯化与接种技术是微生物学中的重要技术，在微生物学和相关行业中有着广泛的应用。
病毒学研究的基本方法
四、病毒的鉴定
病毒鉴定是诊断病毒性疾病的可靠方法， 也是病毒分类的前提。一般可通过以下方 法确证病毒的存在：
(一)病毒的群体形态特征 1. 噬菌斑
噬菌斑(plaque)测定一般采用双层平板法，将一定量经稀 释的噬菌体悬液与高浓度敏感菌悬液及半固体琼脂培养基 (1％琼脂)混合均匀后，然后倒入含底层琼脂培养基(2％ 琼脂)的平板，经过一段时间培养后，在细菌菌苔上会出 现一个个圆形局部透明区域，即噬菌斑。 可以认为，每个噬菌斑是一个噬菌体侵染的结果，一个噬 菌斑中的噬菌体遗传性都相同，故通过多次重复接种，可 获得纯系噬菌体。 因每种噬菌体的噬菌斑有一定的大小、形状、边缘和透明 度，故可作为鉴定的指标。此外，噬菌斑亦可用于病毒的 定量。
根据培养方法不同
4、微载体细胞培养 利用对细胞无毒性的微小颗粒，按一定比 例放入混悬的培养的营养液中，作为细胞 附着增殖的载体。 大大扩大了细胞长成单层的附着面， 充分利用生长空间和营养液，达到了提高 细胞产量的目的。
常用的细胞培养
类型
原代细胞培养 二倍体细胞株 传代细胞系
名称
恒河猴肾细胞培养，各种动物胚肾、肺等细 胞培养，鸡胚成纤维细胞培养 WI-38（人胚肺细胞株） ，HL-8（恒河猴胚细 胞株） Hela 细胞，Detroit 细胞（胸骨髓细胞系） ， Chang C/I/L/K（人结膜 C，肠 I，肝 L 与肾 K 细胞系） ， Vero （绿猴肾细胞系） ， BHK-21 （幼地鼠肾细胞系）
2. 冷冻干燥 在真空条件下使冰冻病毒悬液 脱水（通常是冷冻真空干燥），可保存几 年甚至几十年，毒力不变。
毒种的保护剂：一般用脱脂牛乳、经灭活 的动物血清、饱和蔗糖溶液等。真空干燥 时，将病毒液加等量保护剂，每支装0.2～ 0.5ml，放入冻干机内冷冻。现代冻干机具 有冷冻、干燥、抽真空等全部装置，使用 十分方便。
实验一-鸡胚成纤维细胞的培养
02
实验过程中，细胞形态和生长曲线的变化符合预期，表明实验
操作和Байду номын сангаас件控制得当。
传代培养后细胞稳定增殖，表明所使用的培养基和条件能够支
03
持鸡胚成纤维细胞的正常生长。
对实验的改进和展望
在未来的实验中，可以尝试优化培养基的成分，以提高细胞的生长速度和活性。
可以进一步研究不同条件对鸡胚成纤维细胞生长和功能的影响，如温度、pH、气体 环境等。
了解细胞培养的基本原理和操作流程
掌握细胞生长和增殖 的基本原理，了解细 胞周期和细胞分裂的 过程。
了解细胞培养过程中 的注意事项和安全措 施。
熟悉细胞培养的基本 流程，包括原代细胞 的培养和传代细胞的 继代培养。
学习细胞培养的实验设计和数据分析方法
01 学习如何设计细胞培养的实验方案，确定实验参 数和对照组设置。
实验一-鸡胚成纤维 细胞的培养
目 录
• 实验目的 • 实验原理 • 实验步骤 • 结果分析 • 实验结论
01
CATALOGUE
实验目的
掌握鸡胚成纤维细胞的培养技术
01
掌握细胞培养的基本操作，如细胞分离、传代、计 数等。
02
熟悉细胞培养所需的仪器和试剂，如显微镜、细胞 培养皿、胰蛋白酶等。
03
了解细胞培养的环境条件，如温度、湿度、气体等 。
细胞形态的观察结果分析
总结词
观察鸡胚成纤维细胞的形态变化，分析 细胞形态与细胞功能的关系。
VS
详细描述
在实验过程中，通过显微镜观察鸡胚成纤 维细胞的形态变化，记录细胞的形态特征 。通过对比不同培养时间的细胞形态，可 以分析细胞形态与细胞功能的关系，进一 步了解细胞的生理状态和变化规律。
动物微生物3.4 病毒感染的实验室诊断
项目三病毒任务五病毒感染的实验室诊断一、病毒的一般诊断程序（一）标本的采集和处理用于分离病毒的标本应含有足够量的活病毒，因此必须根据病毒的生物学特性、病毒感染的特征、流行病学规律以及机体的免疫保护机制，来选择所需要采集标本的种类、确定最适采集时间和标本处理的方法。
标本采集必须无菌操作，如有细菌污染，可通过加抗菌素、过滤和离心等方法处理。
由于大多数病毒对热不稳定，所以标本经处理后一般应立即接种。
若需要运送或保存，数小时内可置于50％中性甘油内4℃保存，对需较长时间冻存的标本最好置于-20℃以下或干冰保存。
以感染病毒的动物病料采集为例，一般说来，应从病畜体内存在病毒最多的器官或组织采取病料。
例如上呼吸道疾病取鼻分泌物，脑炎取脑组织，痘症取患部皮肤。
采集病料的时间，以症状刚出现时为佳。
检查抗体时，则采取一个病畜的初期和恢复期的血清，以了解抗体滴度的变化。
（二）病毒的分离培养病毒与细菌不同，病毒是严格的活细胞内寄生的，因此分离培养病毒应采用寄主接种法、鸡胚培养法或细胞培养法，而且还必须根据不同病毒的要求进行选择，才能得到满意的结果。
1、寄主接种法分离的标本接种于实验寄主的种类和接种途径主要取决于病毒寄主范围和组织嗜性，同时还应考虑操作、培养及结果判定的简便。
噬菌体标本可接种于生长在培养液或培养基平板中的细菌培养物。
植物病毒标本可接种于敏感植物叶片，产生坏死斑或枯斑。
动物病毒标本可接种于敏感动物的特定部位，嗜神经病毒接种于动物脑内，嗜呼吸道病毒接种于动物鼻腔。
常用动物有小白鼠、大白鼠、地鼠、家兔和猴子等。
在兽医病毒学实践中，还常用本动物进行实验感染试验。
例如，应用健康马驹作马传染性贫血病毒接种试验；应用健康猪、鸡分别作猪瘟病毒、鸡新城疫病毒接种试验等等。
接种病毒后，隔离饲养，每日观察动物发病情况，根据动物出现的症状，初步确定是否有病毒增殖。
2、鸡胚培养法不同的病毒可选择不同日龄的鸡胚和不同的接种途径，如痘病毒接种于10～12d的鸡胚绒毛尿囊膜上，鸡新城疫病毒宜接种在10d尿囊腔和羊膜腔内，虫媒病毒宜接种于5d卵黄囊，继续培养观察。
鸡胚不同组织细胞的体外培养及永生化的开题报告
鸡胚不同组织细胞的体外培养及永生化的开题报告1. 研究背景鸡胚是一种常用的模式动物，胚胎时期包含了各种要素，如肌肉、神经、心血管等组织。
对于组织器官工程及器官再生的研究，鸡胚是独一无二的研究对象，可以通过其特殊的解剖结构、生理生化变化及生物学特性来深入研究不同组织细胞的发育和分化过程。
此外，开展鸡胚各组织细胞的体外培养、细胞增殖及永生化等方面的研究，对疾病治疗和组织再生工程等应用具有很大的应用价值。
2. 研究目的本研究旨在通过组织培养技术和基因工程技术，对鸡胚不同类型组织细胞进行体外培养和永生化，探索其细胞增殖及分化规律，并分析分化因子和信号通路的作用，为鸡胚组织工程和再生医学提供理论和实践基础。
3. 研究方法(1) 制备鸡胚细胞悬液：从不同孵化期的鸡胚中分离不同类型细胞标本，并利用酶解法将其分离成单细胞悬液。
(2) 细胞培养：将制备好的鸡胚细胞悬液分别在不同的培养基中进行细胞培养。
使用的培养基包括DMEM培养基、MEM培养基和FBS培养基，其中加入生长因子和细胞因子对于细胞增殖和永生化至关重要。
(3) 细胞生长特性的分析：使用细胞增殖和MTT测定法，对细胞的增殖和代谢活性进行监测和分析。
(4) 永生化细胞系的建立：通过体外培养的方式，使细胞经过连续传代达到永生化状态，并进行细胞形态学和分子生物学检测，确定其永生化状态。
4. 预期结果通过对不同孵化期的鸡胚细胞进行体外培养，我们可以得到一系列的细胞系，可以通过基因工程技术进行调控，从而进一步解析不同组织的分化规律和研究发生和分化的分子机制。
同时，筛选出的永生化细胞系具有长期的增殖能力和不可逆转的细胞周期，可以为组织工程和再生医学提供有力的细胞资源。
5. 研究意义(1) 通过组织培养和永生化技术，研究鸡胚各组织细胞的增殖和分化规律，揭示了发生和分化过程的分子机制，为组织工程和再生医学提供理论支持。
(2) 研究可以筛选出多种鸡胚细胞系，包括永生化细胞系，为组织工程提供可使用、可扩增的单倍体细胞。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
第一节鸡胚接种一、鸡胚的结构鸡胚是正在发育的活的机体，组织分化程度低，细胞代谢旺盛，适于许多人类和动物病毒的生长增殖，是常用的病毒分离培养方法之一（衣原体、立克次体的分离亦用鸡胚）。
目前，鸡胚在正粘病毒、副粘病毒、痘病毒、疱疹病毒及脑炎病毒，尤其在禽类病毒的研究上应用较多。
可用于病毒的分离、鉴定，抗原和疫苗制备，以及病毒性质的研究等。
虽然随着组织培养技术的不断发展，不少病毒已不再用鸡胚来分离培养，但对某些病毒来说，鸡胚仍是一种不可缺少的培养手段。
鸡胚培养的优点是，来源充足，价格低廉，操作简单，无需特殊设备或条件，易感病毒谱较广，对接种的病毒不产生抗体等。
当然，鸡胚培养也有其缺点，即除痘斑和鸡胚死亡是特异性感染指征外，多需用第二试验系统来测定病毒存在与否；非SPF鸡胚，亦可能含有对某些家禽病毒的母源抗体，甚至还可能带有鸡白痢沙门氏菌、霉形体、鸡白血病等病毒。
因此，用鸡胚分离培养病毒时，必须考虑这些问题。
原则上应使用非免疫蛋来孵鸡胚，最好用SPF鸡胚。
一般说来，孵育至8-14天的鸡胚最有利于病毒的生长，因为此阶段鸡胚发育日趋完善，各种脏器均已形成，已能经受接种物的适当刺激，同时胚胎细胞幼嫩，骨胳不健全，还未长出羽毛，很利于病毒在胚胎中增殖，同时也有利于收获高滴度的病毒，14天以后，胚胎骨骼硬化，胚皮表面羽毛渐生，已不便感染病毒，特别是已不利于收获病毒材料。
在操作鸡胚时）一定要注意到这一点。
孵育至21天左右，羊水和尿囊液已全部被胚胎吸收，一部分卵黄陷入胚胎腹部，另一部分则仍留在体外，胚胎已发育成小鸡，破壳而出。
鸡胚的基本结构如图，从图中可以看出，鸡胚的最外层为石灰质的卵壳，上有气孔供气体交换，卵壳之下为壳膜，很易与卵壳分离，其功能是使气体分子与胚胎内的液体分子在内外进行交换，因此在孵育时需要有一定的湿度和空气。
如果湿度太低，鸡胚就容易脱水、引起鸡胚死亡。
气流不通，鸡胚缺氧，同样会造成鸡胚死亡。
鸡胚的钝头（俗称“大头”），是气室，其功能是呼吸和调节胚内压力。
壳膜之下为血管丰富的绒毛尿囊膜，其外层为绒毛膜，系外胚层形成，内层为尿囊膜，系内胚层形成，两膜所夹为中胚层。
由于胚胎的肺发育不完善，此时绒毛尿囊膜代行胚胎呼吸器官的作用，气体的交换是在绒毛尿囊膜的血管内通过卵壳进行的。
尿囊腔是胚胎的排泄器官，内含的尿囊液初为透明液体，成分极类似于生理盐水溶液，以后则尿酸盐含量增高。
尿囊液量在11-13日龄时最高，平均达6毫升左右。
羊膜是胚胎的最内层包被，系外胚层和中胚层形成，羊膜腔内含羊水，胚胎浸于其中，羊水在起初是单纯的生理盐水溶液，以后蛋白质含量增加。
羊水量在8-15日龄时最高，平均约为1毫升左右。
附着于胚胎上的是卵黄囊，其膜系由内胚层和中胚层形成，内包卵黄，是胚胎发育的养料。
卵的尖端（俗称“小头”）是卵白，是胚胎发育晚期的养料二、鸡胚培养实验用器械不鸡胚培养技术简便，但一些最基本的设备仍需具备，它们包括：孵化箱、检卵器、卵架、打孔器、镊子、酒精灯、无菌眼科镊子和剪刀、吸头、洗耳球、注射器、适用的针头、无菌试营、平皿、三角瓶、烧杯、消毒胶布、石蜡和灭菌生理盐水等。
下面就一些最基本的设备作一简单介绍：孵化箱是给受精卵提供发育条件的设备，要求恒温恒湿。
市售专用孵化箱可自动进行气体交换和翻蛋。
实验室中，常用普通恒温培养箱或恒温室代替，要注意保持室内湿度和人工翻蛋。
检卵器有市售专用检卵器，在暗室中操作。
也可根据条件向行设计，用木板制成一大小为35 X 25.5 X 15厘米的木盒，上半层为一暗室，上方开一小孔，以便于用眼检视鸡胚，两侧开大孔以供双手伸入小暗室转动鸡胚蛋和进行标记。
木盒中间有一隔板，其中间部位开一卵形圆孔，木盒下层安装有100瓦灯泡，待检胚蛋置于卵形孔上。
开灯检查，不必在暗室中进行。
打孔器可用剪刀代替.卵架孵育用盛放鸡胚蛋的卵盘有市售专用者，实验操作中所用卵架可用木板制成小方盒，上面开一卵形孔。
三、鸡胚的实验室孵育选择实验室用鸡卵，最好用白色薄壳鸡蛋，其易于观察胚胎的生活情况。
实验用卵一般不宜保存过长时间，通常保存期不应超过10天，5天以内最好。
而且不宜在高温下保存，通常保存于4~20 C，以10 C条件下最好。
适宜的孵育温度为38~39 C，相对湿度为45~60 %，并注意空气流通。
孵育3天后每天应翻卵1~2次，以保证气体交换均匀，发育齐全，从而避免半边发育现象的出现。
孵后第四天用检卵器对鸡卵进行检视，检出未受精卵和死亡的鸡胚。
经四天孵育后，未受精卵不见有鸡胚迹象，仅见模糊的卵黄暗影；受精卵则可见清晰的血管小团，其中有鸡胚迹象，较大的鸡胚可见到胚胎主动运动; 濒死或死亡的鸡胚则见到胚胎运动呆滞或不运动，血管昏暗、折断或漂落，这种鸡胚应剔出不用。
四、鸡胚的接种1. 绒毛尿囊膜接种主要用于痘病毒和疱疹病毒的分离和增殖，这些病毒可在鸡胚绒毛尿囊膜上形成痘斑和病斑。
此外其它用于绒毛尿囊腔接种的病毒也可使用，而且收毒量更高，缺点是操作不易成功。
选取10-13 日龄的鸡胚，照检后，将气室及胚胎位划出，并在胚位附近无大血管处，划一记号，用蛋钻在卵壳上磨一裂缝（或用电烙器在卵壳上烙出一个直径为2-3mm的烤焦圈），小心将蛋壳去掉，注意切勿损伤壳膜；在气室中央也钻一个小口，用针尖挑破壳膜，切勿损伤其下的绒毛尿囊膜，滴加1 滴无菌生理盐水于刺破处，用吸耳球紧贴气室中央小口，造成负压，即可见生理盐水下沉，绒毛尿囊膜凹下，和壳膜分开，造成人工气室。
滴加0.05-0.1ml 接种物于绒毛尿囊膜上，腊封口，封口部位朝上，不要翻动，37C培养。
2. 尿囊腔接种主要用于正粘病毒和副粘病毒，例如禽流感病毒和新城疫病毒的分离和增殖，马脑炎病毒也常用、IBD、IBDV也可。
选取9 -11 日龄的鸡胚，照检后，将气室及胚胎位划出，在气室边缘上打一小口，避开大血管处，注射器沿小口插入1-1.5cm ，注入接种物0.1-0.2ml ，腊封口。
3. 卵黄囊接种主要用于虫媒批膜病毒以及鹦鹉热衣原体和立克次氏体的分离和增殖。
选取6 - 8日龄的鸡胚，照检后，将气室及胚胎位划出；垂直放置在卵座上，在气室中央钻一个小口，注射器沿小口插入3 cm,注入接种物0. 1-0.5ml ，腊封口。
4. 羊膜腔接种主要用于正粘病毒和副粘病毒的分离和增殖，操作技术比较困难。
A. 开窗法：从气室处去蛋壳开窗，从窗口用小镊子剥开蛋膜，一手用平头镊子夹住羊膜腔向上提，另一手注射0.05-0.1ml 接种物于腔内，使蛋直立孵化，此法可靠，但胚胎易受伤而死，而且易污染。
B. 盲刺法：将鸡胚放在灯光向上照射的蛋座上，使蛋转动使胚胎面向术者。
在气室顶部到边缘的一半处打一孔，用40mn长的针头垂直插入，月深30mm以上。
如已刺如羊膜腔，能使针头拨动胚即可注入接种物0.1-0.2ml ，如针头左右移动时胚胎随着移动，则针头已刺入胚胎，这时应将针头稍提起后再注射，石蜡封口。
五.鸡胚材料的收获原则上接种什么部位，收获什么部位。
（1）绒毛尿囊膜：用碘酊、酒精消毒接种部位及四周，揭去封闭处的卵壳。
用灭菌镊子扩大开口处，轻轻夹起绒毛尿囊膜，用消毒剪刀剪下接种面及周围的膜，置于灭菌生理盐水的平皿中。
（2）尿囊腔接种：收获前将鸡胚置4°C冰箱中6h或过夜将鸡胚冻死而使血液凝固，以免收获时流血。
用碘酊、酒精消毒气室部位卵壳，以无菌镊子击破气室端卵壳，沿气室周围剪去卵壳，撕去壳膜和绒毛尿囊膜，用镊子轻轻压住胚胎，以无菌吸管或注射器吸取尿囊液于灭菌试管内。
收集的液体应清亮，浑浊则表明有细菌污染；呈血红色，说明血管破裂；黄色液体，可能卵黄囊被刺破。
应做无菌检验。
（3）羊膜腔：首先收取尿囊液，方法同上。
后用注射器插入羊膜腔内收集，约可收到1ml 液体，无菌检测。
（4）卵黄囊：先首先收取尿囊液和羊膜腔液，后用吸管吸卵黄液。
将整个内容物倾入无菌平皿中，剪取卵黄膜保存。
第四节细胞培养常用设备准备室的设备：单蒸馏水蒸馏器、双蒸馏水蒸馏器、酸缸、烤箱、高压锅、储品柜（放置未消毒物品）、储品规（放置消毒过的物品）、包装台。
配液室的设备：扭力天平和电子天平（称量药品）、PH计（测量培养用液PH值）、磁力搅拌器（配置溶液室搅拌溶液）。
培养室的设备：液氮罐、储品柜（存放杂物）、日光灯和紫外灯、空气净化器系统、低温冰箱（-80 °C）、空调、二氧化碳缸瓶、边台（书写实验记录）。
必须放在无菌间的设备：离心机（收集细胞）、超净工作台、倒置显微镜、CO2孵箱（孵育培养物）、水浴锅、三氧消毒杀菌机、4C冰箱（放置serum和培养用液）。
无菌操作无菌室的灭菌：1. 定期打扫无菌室：每周打扫一次，先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等，然后用3%。
来苏尔或者新洁尔灭或者0.5 %过氧乙酸擦拭。
2. CO2孵箱（培养箱）灭菌：先用3%。
新洁尔灭擦拭，然后用75%酒精擦拭或者0.5%过氧乙酸，再用紫外灯照射3. 实验前灭菌：打开紫外灯、三氧杀菌机、空气净化器系统各20-30 分钟4. 实验后灭菌：用75%酒精（3%新洁尔灭）擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台。
实验人员的无菌准备：1. 肥皂洗手。
可减少手上的微生物。
2. 穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩、放好拖鞋。
但是在洁净工作台上时就无需上述防护。
如果你有长头发，则应把它系在脑后。
不要说话或少说话。
如果感冒，则最好不要做组织培养工作。
3. 用75%酒精棉球擦净双手。
无菌操作的演示：1. 凡是带入超净工作台内的酒精、PBS培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用75%酒精擦拭瓶子的外表面2. 靠近酒精灯火焰操作。
3. 器皿使用前必须过火灭菌4. 继续使用的器皿（如瓶盖、滴管）要放在高处，使用时仍要过火。
5. 各种操作要靠近酒精灯，动作要轻、准确，不能乱碰。
如吸管不能碰到废液缸。
6. 吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管，防止交叉污染。
器械的清洗和消毒一、新的玻璃器皿的洗消：1. 自来水刷洗，除去灰尘。
2. 烘干、泡盐酸：烤箱中烘干，然后再浸入5%稀盐酸中12小时以除去脏物、铅、砷等物。
3. 刷洗、烘干：12 小时后立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗，自来水冲干净后用烤箱烘干。
4. 泡酸、清洗：用清洁液（重铬酸钾120g：浓硫酸200ml:蒸馏水1000ml）浸泡12 小时，然后从酸缸内捞出器皿用自来水冲洗15 次，最后蒸馏水冲洗3-5 次和用双蒸水过3 次。
5. 烘干、包装：洗干净后先烘干，然后用牛皮纸（油光纸）包装6. 高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内盖好盖子，打开开关和安全阀，当蒸气成直线上升时，关闭安全阀，当指针指向15磅时，维持20-30 分钟。
7. 高压消毒后烘干二、旧的玻璃器皿的洗消：1．刷洗、烘干：使用过的玻璃器皿可直接泡入来苏尔液或洗涤剂溶液中，泡过来苏尔溶液（洗涤剂）的器皿要用清水刷洗干净，然后烘干。