第四章动物干细胞

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2008年十大科学突破

在火星山发现冰
用干细胞培育器官
在银河系内发现与生命起源有关的糖分子 治愈艾滋病 超级计算机 为癌症患者做基因组测序 碳纳米管制成的扩音器 测出现今温室气体水平为800,000年来的最高值 把水变成燃料

干细胞技术
2010年十大科学突破

三、胚胎干细胞系的建立(以小鼠ES为例)
1.培养体系的选择和准备
饲养层细胞:
①STO成纤维细胞系:已建系的细胞 ②MEF:小鼠胚胎成纤维细胞
无饲养层:
①培养液+人重组LIF
②含LIF的条件培养液:大鼠心肌细胞条件培养液
大鼠肝细胞株BRL条件培养液
2.胚胎的来源


胚胎的发育阶段:囊胚
小鼠胚胎来源
2006年, Takahashi等建立了第一株小鼠iPS
2007年, Takahashi等建立了第一株人iPS 2008年,Andrew French首次用字体皮肤细胞克隆出人类胚胎,
但未能成功提取出胚胎干细胞
二、胚胎干细胞的生物学特性
1. 形态特征

体积小、核大,有一个或多个核仁; 胚胎干细胞克隆紧密堆积,无明显的界限, 形似鸟巢
科学家首次观测到宏观物体量子效应
合成生物学
尼安德特人基因组 HIV预防 外显子组测序/罕见疾病基因 分子动力学模拟 量子模拟器 下一世代的基因组学 RNA的重新编程

大鼠的回归
2012年十大科学突破




希格斯玻色子 丹尼索瓦人基因组 让干细胞形成卵子 好奇号的着陆系统 X射线激光解开蛋白质的结构 基因组的精密工程 马约拉纳费米子 ENCODE项目 大脑/机器界面 中微子混合角
胚胎干细胞
来自早期胚胎、原始生殖细胞、或畸
胎瘤组织等的干细胞-万能细胞
成体干细胞
一群分布在成体组织中尚未分化的、 具有自我更新、并负有构建和补充某
种组织的各种类型细胞潜能的干细胞。
如骨髓造血干细胞(HSC),间质干细 胞(MSC),神经干细胞(NSC)
第二节

胚胎干细胞
胚胎干细胞研究的进展 胚胎干细胞的生物学特性 ※ 胚胎干细胞系的建立 ※ 胚胎干细胞的应用
一、胚胎干细胞研究的进展情况

1958年, Stevens最早发现了畸胎瘤干细胞

1981年, Evans和Martin分别成功地分离和体外培养了小鼠的胚
胎干细胞 1995年, Thomson等人分离建立了第一株灵长类动物的胚胎干细



1998年, Thomson等建立了第一株人类胚胎干细胞 1998年, Shamblott等建立了第一株人类生殖干细胞
显微镜下的人胚胎干细胞
2.生化特征

具有碱性磷酸酶和端粒酶活性; 表达SSEA-3、SSEA-4等; 表达OCT-4蛋白;

无X染色体失活。
3. 其他特征

二倍体核型 具有无限增殖能力 具有发育的多潜能性 能够形成嵌合体 具有培养细胞的所有特征,缺乏细胞周期中的 G1期的检验点
无饲养层培养:条件培养基
未分化的人胚胎干细胞
A.小鼠成纤维饲养细胞上培养8天后的ICM(标尺=100um) B.ICM中分离出的H9细胞系(标尺=100um) C. H9细胞系(标尺=50um) D.在无小鼠胚胎成纤维细胞,但有LIF(20ng/ml)的条件下培养5d后, H9细胞发生分化(标尺=100um)
第一节 干细胞的概念和分类
一、干细胞的概念
干细胞(Stem cell)是一群具有无限的或者 永生的自我更新能力,至少能够产生一种高度分
化的子代细胞的细胞(分化潜能),是个体生命
过程中产生和存在的一个特殊细胞群体。
二、干细胞的分类
按分化潜能

按发育状态
•胚胎干细胞
•成体干细胞
ES细胞 EG细胞 EC细胞
第四章
动物干细胞
胚胎干细胞
2007年十大科学突破

发现人类基因组个体间差异 用皮肤细胞培育出胚胎干细胞
发现银河系能量最大的宇宙射线
发现人体蛋白受体结构 发现超越硅电子的器件


证实量子霍尔效应
发现T细胞具有分工作战能力 发现高效低成本制药技术 发现人类大脑记忆的关健中心 编制挑战人类智力的电脑游戏
母小鼠超数排卵受精后采集

人胚胎的来源
多来自人工受精卵体外培养而来
3.胚胎干细胞的分离(酶消化法) 普通培养法

囊胚在分离培养液中培养2-5d 吸取ICM,胰酶消化,用培养液中和酶 分散后ICM小团块与饲养层细胞共培养,7天后更换 培养液,形成细胞克隆。

离散细胞克隆为单细胞,转移到新的饲养层细胞, 形成小的细胞克隆即分离培养成功。
全能干细胞 多能干细胞 单能干细胞
造血干细胞 间充质干细胞 神经干细胞 肝脏干细胞等
全能干细胞: (Totipotent stem cell)
具有形成完整个体的分化潜能。 如哺乳动物的受精卵及8细胞期 以前的卵裂球。
多能干细胞: 具有分化出多种细胞组织的潜能。 (pluripotent 如造血干细胞、神经干细胞。 stem cell) 单能干细胞: 只能向一种或两种密切相关的细 (multipotent 胞类型分化。如上皮组织基底层 的干细胞,肌肉中的成肌细胞。 stem cell)
第三节 成体干细胞
一、成体干细胞的概念
指一群分布在成体组织中尚未分化的、 具有自我更新、并负有构建和补充某种组织的 各种类型细胞潜能的干细胞。
二、成体干细胞的生物学特性
免疫外科法

用0.5%链霉蛋白酶,溶解去除透明带 利用兔抗鼠抗体和豚鼠血清处理胚胎, 溶解去除滋胚层,获得ICM

后续操作同普通培养法
4.胚胎干细胞的增殖培养
饲养层培养:

特殊的培养液:用DMEM培养液,还要加非必须氨
基酸;β -巯基乙醇。

以成纤维细胞为饲养细胞。
有时需加入LIF,抑制细胞分化
5.胚胎干细胞的鉴定

碱性磷酸酶检测 特异性表面抗原表达的鉴定
Hale Waihona Puke Baidu
具有碱性磷酸酶 和端粒酶活性; 表达SSEA-3、SSEA-4等; 表达OCT-4蛋白;
端粒酶活性的检测
核型分析 体外分化能力鉴定 体内分化能力鉴定 嵌合能力的鉴定
正常二倍体核型 发育的多潜能性 能形成嵌合体
干细胞培养过程
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