生物基因组序列比对分析

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（4）评价所建立的树，分析其生物学意义 评价所建立的树，
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第二部分：兔肝脱氧核糖核酸（ 第二部分：兔肝脱氧核糖核酸（DNA）的提取和测定 ）
实验目的
学习从动物组织中提取DNA及其含量、纯度测定的原理和方法 及其含量、 学习从动物组织中提取 及其含量 掌握离心机及岛津UV-120的使用方法 的使用方法 掌握离心机及岛津
实验操作
支试管， 取8支试管，按实验指导的表格加入试剂。 支试管 按实验指导的表格加入试剂。 加毕置沸水浴10分钟，取出冷却； 号管（ 波长比色。 加毕置沸水浴 分钟，取出冷却；以0号管（空白管）调零点，于595nm波长比色。 分钟 号管 空白管）调零点， 波长比色 以光密度为纵坐标， 含量（ 以光密度为纵坐标，DNA含量（µg/ml）为横坐标，绘制标准曲线 含量 ）为横坐标，绘制标准曲线. 将实验中所得到的兔肝DNA溶液作为待测样品，取两只试管，分别标“U”和“B”，按 溶液作为待测样品，取两只试管，分别标“ 和 将实验中所得到的兔肝 溶液作为待测样品 ， 表加入试剂。 表加入试剂。 混匀，置沸水中 取出冷却。 混匀，置沸水中10min, 取出冷却。 管调零， 在595nm处，以B管调零，测得待测液的光密度值，从标准曲线上查出相当于该光密度 处 管调零 测得待测液的光密度值， 的含量。 值DNA的含量。 的含量
基因分子进化分析步骤
（1）以目的基因为种子序列，搜索其在其它物种中的同源序列 ）以目的基因为种子序列，
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（2）将上述同源基因的核酸或蛋白序列作序列比对，Clustal X 将上述同源基因的核酸或蛋白序列作序列比对，
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（3）构建系统发生树：MEGA，PHYLIP，PAUP ）构建系统发生树： ， ，
全基因组序列数据的积累,使得不同生物之间的进化关系可以从分子水平上进行研究。 全基因组序列数据的积累 使得不同生物之间的进化关系可以从分子水平上进行研究。 使得不同生物之间的进化关系可以从分子水平上进行研究 不同于以往单纯依赖于生物形态学特征,这种分析更加深刻更加本质。 不同于以往单纯依赖于生物形态学特征 这种分析更加深刻更加本质。利用分子序列 这种分析更加深刻更加本质 使得我们可以研究,从单细胞生物到植物、动物甚至人的进化关系。 使得我们可以研究 从单细胞生物到植物、动物甚至人的进化关系。 从单细胞生物到植物 比较基因组学(Comparative Genomics)是基于基因组图谱和测序基础上，对已知的 是基于基因组图谱和测序基础上， 比较基因组学 是基于基因组图谱和测序基础上 基因和基因组结构进行比较，来了解基因的功能、表达机理和物种进化的学科。 基因和基因组结构进行比较，来了解基因的功能、表达机理和物种进化的学科。利 用模式生物基因组与人类基因组之间编码顺序上和结构上的同源性， 用模式生物基因组与人类基因组之间编码顺序上和结构上的同源性，克隆人类疾病 基因，揭示基因功能和疾病分子机制，阐明物种进化关系，及基因组的内在结构。 基因，揭示基因功能和疾病分子机制，阐明物种进化关系，及基因组的内在结构。 目前从模式生物基因组研究中得出一些规律：模式生物基因组一般比较小， 目前从模式生物基因组研究中得出一些规律：模式生物基因组一般比较小，但编码 基因的比例较高，重复顺序和非编码顺序较少； 比较高； 基因的比例较高，重复顺序和非编码顺序较少；其GC%比较高；内含子和外显子 比较高 的结构组织比较保守，剪切位点在多种生物中一致。 的结构组织比较保守，剪切位点在多种生物中一致。
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基因组比对软件
Mauve
VISTA
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分子进化
一个最基本的假设是地球上所有物种都 有一个共同的祖先， 有一个共同的祖先，从这个祖先开始以 数状形式发展， 数状形式发展，通常称为生命之树 （tree of life）。 ）。 分子进化研究的目的： 分子进化研究的目的：通过序列同源性 的比较， 的比较，分析序列间的变化进而了解基 因的进化以及生物系统发生的内在规律。 因的进化以及生物系统发生的内在规律。 分子进化有两个主要研究对象， 分子进化有两个主要研究对象，以全基 因组序列为研究对象分析物种进化； 因组序列为研究对象分析物种进化；以 某基因在多个物种的同源序列为研究对 象分析基因的进化 WWW.Ggene.Cn
1. 2. 3. 第一部分：生物基因组序列比对分析， 第一部分：生物基因组序列比对分析，分子进化 第二部分：兔肝 第二部分：兔肝DNA的提取和测定 的提取和测定 第三部分：目的基因SNP位点的鉴定及其意义 第三部分：目的基因 位点的鉴定及其意义
第一部分：生物基因组序列比对分析、 第一部分：生物基因组序列比对分析、分子进化
去塞！ 去塞！离心
挑取DNA至一离 至一离 挑取 心管(小烧杯 小烧杯)用 心管 小烧杯 用10ml 0.01N NaOH溶解 溶解
加1ml 5M NaCl
吸取上清液 勿吸到中间层！ 勿吸到中间层！
注意事项
尽可能避免DNA的断裂 尽可能避免DNA的断裂 DNA 匀浆时应保持低温，且匀浆时间应短； 1. 匀浆时应保持低温，且匀浆时间应短； 实验中使用的吸取DNA水溶液的滴管口应粗短并成钝口。 DNA水溶液的滴管口应粗短并成钝口 2. 实验中使用的吸取DNA水溶液的滴管口应粗短并成钝口。 保持DNA活性，避免酸碱或其他变性因素使DNA变性。 保持DNA活性，避免酸碱或其他变性因素使DNA变性。 DNA活性 DNA变性 搅动不要太大，以免使DNA断裂。 搅动不要太大，以免使DNA断裂。 DNA断裂 整个实验过程应在低温条件下进行。 整个实验过程应在低温条件下进行。 搅拌时动作要轻，反复倒置抽提，不可激烈振荡。 搅拌时动作要轻，反复倒置抽提，不可激烈振荡。
二苯胺显色法测定DNA含量 含量 二苯胺显色法测定
实验原理
DNA的α-脱氧核糖在酸性条件下转变成 羟基-r酮基戊醛，与二苯胺共热后 的 脱氧核糖在酸性条件下转变成ω-羟基 酮基戊醛， 脱氧核糖在酸性条件下转变成 羟基 酮基戊醛 形成蓝色化合物，该化合物在 处最大吸收。 形成蓝色化合物，该化合物在595nm处最大吸收。 处最大吸收 范围内光密度与DNA的浓度成正比。反应液中加入少量乙 的浓度成正比。 每ml含20－400µg范围内光密度与 含 － 范围内光密度与 的浓度成正比 醛，可提高反应的灵敏度。 可提高反应的灵敏度。
加入15% SDS时要慢，边搅边滴加（两人配合）。 时要慢， 加入 时要慢 边搅边滴加（两人配合）。 SDS的温度不能太低，易凝固。吸过SDS的吸管要及时清洗。 的温度不能太低，易凝固。吸过 的吸管要及时清洗。 的温度不能太低 的吸管要及时清洗 加入CHCl3/IAA液离心后，分为三层，由上到下为：无机相 蛋白相 有机相。DNA 液离心后， 蛋白相-有机相 加入 液离心后 分为三层，由上到下为：无机相-蛋白相 有机相。 溶解在无机相中，吸取无机相时动作要轻，不要吸到蛋白相。 溶解在无机相中，吸取无机相时动作要轻，不要吸到蛋白相。 CHCl3/IAA会溶解有机玻璃，用完后不能竖直放置在试管架上，必须冲洗干净。 会溶解有机玻璃， 会溶解有机玻璃 用完后不能竖直放置在试管架上，必须冲洗干净。
离心机的使用
打开电源开关； 打开电源开关； 平衡放置离心管；盖上盖子。 平衡放置离心管；盖上盖子。 调节时间旋钮至10min； ； 调节时间旋钮至 缓慢调节速度旋钮至9档 上升1档 缓慢调节速度旋钮至 档，每5-10s上升 档； 上升 离心完毕后机器自动停止，待完全停止后，打开盖子取出离心管。 离心完毕后机器自动停止，待完全停止后，打开盖子取出离心管。 离心管必须平衡后，才能启动离心机； 离心管必须平衡后，才能启动离心机； 离心机的盖子必须盖紧； 离心机的盖子必须盖紧； 离心过程中不要用重物撞击离心机； 离心过程中不要用重物撞击离心机； 要等离心机完全停止转动后再打开盖子。 要等离心机完全停止转动后再打开盖子。
综合性设计性实验综合性设计性实验-5
生物基因组序列比对分析，分子进化 生物基因组序列比对分析， 兔肝DNA的提取与二苯胺显色法测定 的提取与二苯胺显色法测定DNA含量 兔肝 的提取与二苯胺显色法测定 含量 目的基因SNP位点的鉴定及其意义 位点的鉴定及其意义 目的基因
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此实验共包括如下三个部分
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比较作图就是利用共同的遗传标记（主要是分子标记、基因的 比较作图就是利用共同的遗传标记（主要是分子标记、基因的cDNA克隆以及基因组 克隆以及基因组 克隆）对相关物种进行物理或遗传作图， 克隆）对相关物种进行物理或遗传作图，比较这些标记在不同物种基因组中的分布情 ），从 况，提示染色体或染色体片段上的同线性（synteny）或共线性（collinearity），从 提示染色体或染色体片段上的同线性（ ）或共线性（ ）， 而对不同物种的基因组结构及基因组进化历程进行精确分析。基因组比较作图的研究， 而对不同物种的基因组结构及基因组进化历程进行精确分析。基因组比较作图的研究， 不仅提示了同属甚至同科物种基因组间的同源性和差异性，对不同物种在起源、 不仅提示了同属甚至同科物种基因组间的同源性和差异性，对不同物种在起源、演化 过程中的变化的研究具有巨大的启示作用 。 比较作图的研究意义在于： 比较作图的研究意义在于：一、根据不同种的基因组基因及其排列顺序的高度保守特 点绘制而成的比较图，可以研究和探明它们的进化线索。 点绘制而成的比较图，可以研究和探明它们的进化线索。广泛的比较作图可为多个种 所用，建立它们之间的联系框架或系统。 所用，建立它们之间的联系框架或系统。
Baidu Nhomakorabea 实验操作
1. 弃上清留沉淀
兔肝
离心
1X SSC洗 洗 两次
加至8ml 加至 1X SSC
3.弃上清留沉淀 弃上清留沉淀 脱氧核糖核蛋白） （脱氧核糖核蛋白）
称取4 g 加 称取 8ml 1X SSC
离心
匀浆、 匀浆、过滤
2.弃上清留沉淀 弃上清留沉 弃上清留
取8ml匀浆液 匀浆液 离心
加至 8ml 0.15M NaCl-0.1M Na2EDTA
沉淀
等体积氯仿-异 等体积氯仿 异 丙醇混合液
加约2倍 加约 倍 体积 95% 乙醇
加 0.15M NaCl-0.1M Na2EDTA至4ml 至 轻搅 10min 加塞反复 倒置抽提 10min 重复 一次
DNA析出 析出
逐滴加入0.5ml 逐滴加入 15% SDS
用玻棒挑出
搅拌10min 搅拌
实验原理
利用脱氧核糖核酸蛋白和核糖核酸在电解质中不同的溶解度使二者分离， 利用脱氧核糖核酸蛋白和核糖核酸在电解质中不同的溶解度使二者分离，在 0.15M的氯化钠溶液中脱氧核糖核酸蛋白的溶解度最低。相反，核糖核蛋白能在 的氯化钠溶液中脱氧核糖核酸蛋白的溶解度最低。相反， 的氯化钠溶液中脱氧核糖核酸蛋白的溶解度最低 0.15M氯化钠中溶解，因此可利用不同浓度的氯化钠溶液将核酸核蛋白、脱氧核 氯化钠中溶解，因此可利用不同浓度的氯化钠溶液将核酸核蛋白、 氯化钠中溶解 糖核酸蛋白解离出来，而蛋白质变性沉淀，再用氯仿－异丙醇抽提， 糖核酸蛋白解离出来，而蛋白质变性沉淀，再用氯仿－异丙醇抽提，将蛋白质沉 淀除去， 则溶解。 淀除去，而DNA则溶解。 则溶解
系统发生树性质： 系统发生树性质：
理论上，一个 理论上，一个DNA序列在物种形成或基因复制 序列在物种形成或基因复制 末端分支 末端物种 末端物种 时，分裂成两个子序列，因此系统发育树一般 分裂成两个子序列， 是二歧的； 是二歧的； 如果是一棵有根树， 如果是一棵有根树，则树根代表在进化历史上 中间枝条 节点 根 是最早的、 是最早的、并且与其它所有分类单元都有联系 的分类单元，反映时间顺序； 的分类单元，反映时间顺序； 如果找不到可以作为树根的单元， 如果找不到可以作为树根的单元，则系统发生 树是无根树，反映距离； 树是无根树，反映距离； 从根节点出发到任何一个节点的路径指明进化 时间或者进化距离。 时间或者进化距离。 WWW.Ggene.Cn